Cromatografia

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Cromatografia é uma técnica utilizada para a separação dos componentes de uma mistura. A separação cromatográfica é baseada na distribuição dos componentes entre uma fase estacionária e uma fase móvel. Esta separação resulta das diferenças de velocidade dos componentes arrastados pela fase móvel devido às diferentes interações com a fase estacionária. Os principais métodos cromatográficos são: cromatografia em papel (CP), cromatografia de camada delgada (CCD), cromatografia gasosa (CG) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A seleção do método a ser empregado depende do material a ser utilizado. 
A cromatografia tem sido desenvolvida e utilizada em diversos meios da ciência. A química é a área mais atuante no desenvolvimento de métodos cromatográficos, mas outras áreas da ciência também utilizam dessas técnicas, sendo elas muito difundidas na área farmacêutica e médica. Devido à alta precisão e confiabilidade dessas técnicas, elas são muito utilizadas na detecção ou separação de substâncias que estão em pequenas quantidades em uma mistura. Assim, na área médica a cromatografia tem grande utilização na toxicologia, seja para monitorar o uso de medicamento ou para o seu uso na ciência forense, dosando drogas de abuso e auxiliando a elucidar crimes.
Breve histórico
A cromatografia foi relatada pela primeira vez há pouco mais de 100 anos por Mikhail Semenovich Tswett (1872-1919). No período de 1899 a 1901 Tswett trabalhou em sua primeira pesquisa com a estrutura físico-química da clorofila das plantas, sendo que no ano de 1903 relatou uma nova categoria de análise adsortiva. O trabalho de Tswett foi apresentado em forma de tratado para a Sociedade de Ciências de Varsóvia, no qual descreveu os resultados preliminares de suas pesquisas com extrato de folhas, utilizando uma coluna de vidro recheada com carbonato de cálcio, separando os constituintes do extrato pela passagem de éter dietílico. No entanto, as denominações de cromatografia e cromatograma somente surgiram no segundo trabalho de Tswett, publicado em 1906. A palavra cromatografia designava o processo de separação, tendo sua origem do grego Chroma, com o significado de ―cor‖, e também do grego graphe, significando ―escrever‖. Já a palavra cromatograma refere-se às bandas separadas na coluna. Durante os cem anos que se seguiram da publicação de Tswett a cromatografia passou por grande evolução. Em decorrência de a técnica ser baseada em duas fases (móvel e estacionária) e da possibilidade de utilização de diferentes componentes nestas fases, a cromatografia demonstrou sua grande flexibilidade. O controle do fluxo da fase móvel por gravidade, pressão, ação capilar, eletro-osmose, aliado ao fato de o processo poder ser realizado em diferentes temperaturas, permitiu que a técnica de separação pudesse ser aplicada desde pequenos átomos a grandes quantidades de substâncias. Assim, a evolução da técnica iniciou-se na cromatografia líquida de adsorção seguida pela cromatografia de partição. Posteriormente surgiu a análise de gases e amostras vaporizadas, seguida pelas trocas iônicas, separação por tamanho molecular e eletrocromatografia. 4 Mais recentemente a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) tem sido a técnica analítica mais desenvolvida, difundida e utilizada nos laboratórios de análises químicas e farmacêuticas. Desta forma, nos últimos 40 anos muitos avanços em relação a esta técnica foram alcançados, impulsionados pelo desenvolvimento contínuo de novas partículas de fase estacionária, capazes de gerar colunas mais seletivas, eficientes e química e mecanicamente estáveis. A expansão da HPLC tem sido direcionada ao desenvolvimento de análises mais rápidas, sem o comprometimento do desempenho cromatográfico. Assim com a redução do tamanho das partículas da fase estacionária e das colunas, com partículas menores que 2 µm, surgiu a cromatografia líquida de ultra eficiência (U-HPLC), sendo esta uma das mais recentes evoluções da técnica cromatográfica.
Existem quatro tipos principais de cromatografia: cromatografia em papel, cromatografia de camada delgada, cromatografia gasosa e cromatografia líquida de alta eficiência. A seleção do tipo de cromatografia adequada depende do material a ser isolado e, frequentemente, diverso métodos cromatográficos podem ser usados sequencialmente para que seja obtido um composto na forma pura.
CROMATOGRAFIA EM PAPEL
 A cromatografia em papel (CP) é uma das técnicas mais simples e que requer menos instrumentos para sua realização, porém são a que apresenta as maiores restrições para sua utilização em termos analíticos. Neste tipo de cromatografia, uma amostra líquida flui por uma tira de papel adsorvente disposto verticalmente. O papel é composto por moléculas de celulose que possuem uma forte afinidade pela água presente na mistura de solvente, mas muito pouca afinidade pela fase orgânica, atuando como suporte inerte contendo a fase estacionária aquosa (polar). À medida que o solvente contendo o soluto flui através do papel, uma partição deste composto ocorre entre a fase móvel orgânica (pouco polar) e a fase estacionária aquosa. Desta forma, parte do soluto deixa o papel e entra na fase móvel. Quando a fase móvel alcança uma seção do papel que não contém soluto, o fenômeno de partição ocorre novamente, só que agora o soluto é transferido da fase móvel para a fase estacionária. Com o fluxo contínuo de solvente, o efeito desta partição entre as fases móvel e estacionária possibilita a transferência do soluto do seu ponto de aplicação no papel, para outro ponto localizado a alguma distância do local de aplicação no sentido do fluxo de solvente.
CAMADA DELGADA
Na cromatografia em camada delgada (TLC), a fase estacionária é uma camada fina formada por um sólido granulado (sílica, alumina, poliamida, etc.) depositado sobre uma placa de vidro, alumínio ou outro suporte inerte. Pequenas gotas de solução das amostras a serem analisadas são aplicadas em um ponto próximo ao extremo inferior da placa. Deixa-se a placa secar e, então se coloca a mesma em um recipiente contendo a fase móvel (solvente ou mistura de solventes). A polaridade do solvente deverá ser de acordo com a substância que se deseja separar. Como somente a base da placa fica submersa, o solvente começa a molhar a fase estacionária e sob por capilaridade. Deixa-se secar a placa após o deslocamento da fase móvel sobre ela. A revelação da placa é feita com a aplicação de um reativo que de cor às substâncias de interesse. 
CROMATOGRAFIA GASOSA
A cromatografia gasosa (CG) é uma técnica com poder de resolução excelente, possibilitando a análise de várias substâncias em uma mesma amostra. Dependendo do tipo de substância a ser analisada e do detector empregado, consegue-se detectar cerca de 10-12g do composto ml-1 de solução. Essa sensibilidade permite que pequenas quantidades de amostra possam ser analisadas. A fase estacionária da cromatografia gasosa é um material, líquido ou sólido, que propicia a separação da mistura através de processos físicos e químicos. A fase estacionária líquida é um líquido pouco volátil que recobre um suporte sólido, separando as substancias presentes na amostra através das diferenças de solubilidade e volatilidade. Como fase móvel é utilizada um gás, denominado gás de arraste, que transporta a amostra através da coluna de separação até o detector, onde os compostos separados são detectados. Os gases mais utilizados são o hélio (He), hidrogênio (H), nitrogênio (N) e argônio (Ar). Como o He é de difícil obtenção e alto custo é pouco utilizado no Brasil. A pureza do gás de arraste interfere no resultado, acusando impurezas na ordem de partes por milhão (ppm) ou partes por bilhão (ppb).
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
 A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) se desenvolveu muito nos últimos anos, recebendo o nome de cromatografia líquida por que a sua fase móvel é um solvente. Os componentes de um cromatógrafo líquido são: bomba, coluna cromatográfica, detector e o registrador. É um método utilizado para separação deespécies iônicas ou macromoléculas e compostos termo lábeis. A fase móvel da CLAE deve ser um solvente que respeite algumas características impostas por esse método analítico. A principal característica é que a fase móvel dissolva a amostra sem qualquer interação química entre ambas. Esta fase deve ter alto grau de pureza ou ser de fácil purificação, para que se possam fazer análises de alta sensibilidade, pois as impurezas podem interferir na detecção do analito por ultravioleta (UV). A fase móvel deve ser compatível com o detector empregado e, também possuir polaridade adequada para permitir uma separação conveniente dos componentes da amostra. Embora existam vários solventes três deles são mais utilizados: água, metanol e acetonitrila. Como fases estacionárias utilizam-se sólidos ou semirrígidos, cujas partículas porosas esféricas ou irregulares apresentam diferentes diâmetros e suportam pressão até 350 bar.
A cromatografia na toxicologia forense 
O termo ―ciência forense‖ abrange profissões envolvidas na aplicação de ciências sociais e físicas no sistema de justiça criminal. O cientista forense precisa esclarecer, com mínimos detalhes, os fatos ocorridos no sistema criminal utilizando para isso técnicas especializadas para se chegar a conclusões. Deste modo a análise de traços de substâncias exige métodos que garantam um alto nível de confiabilidade, pois os resultados finais exercem influência direta sobre o destino de um determinado indivíduo. Assim, o uso da cromatografia associada a técnicas espectrais é de grande importância para a detecção de drogas de abuso, para análises toxicológicas sistemáticas, para identificação de drogas utilizadas em doping e para identificar a causa mortis. As metodologias para identificação do consumo de drogas ilícitas têm sido desenvolvidas com o auxilio da cromatografia associada a diferentes técnicas espectrais, devido à possibilidade da utilização destas para identificação de pequenas quantidades de inúmeras substâncias em diferentes matrizes. Exemplos de matrizes que podem ser utilizadas na identificação de drogas de abuso é sangue, urina, fluidos orais, cabelo e o mecônio, utilizado para monitoração do uso de drogas durante a gravidez. A urina é a matriz biológica mais comumente utilizada nas análises toxicológicas. Assim, testes cromatográficos podem determinar inúmeras substâncias nesta matriz. Em teste toxicológico em urina humana, com o intuito de avaliar técnicas cromatográficas, pesquisadores identificaram simultaneamente oito diferentes drogas de abuso ou seus metabólitos, entre elas estavam metanfetamina, anfetamina, morfina, cocaína e seu principal metabólito a bezoilecgonina. Em um estudo mais recente foi possível identificar simultaneamente 13 substâncias de abuso e seus metabólitos em amostras de urina humana. Os 10 pesquisadores utilizaram a cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao espectrofotômetro de massa (HPLC-MS). Eles ainda ressaltaram a importância da técnica por eliminar a necessidade de testes de triagem e confirmatórios (DUXBURY et al., 2010). Apesar de a urina ser comumente utilizada, outra matriz biológica muito utilizada na toxicologia forense é o sangue. Pesquisadores estudaram a identificação das principais drogas de abuso utilizadas em festas (Rave) em amostras de sangue humano preparadas com princípios ativos e em amostras provenientes do Forensic Pathology Department ou do Medico-Legal Department of the North Branch of the National Institute of Legal Medicine. No estudo pôde-se identificar por meio da cromatografia gasosa acoplada a espectrofotometria de massa a metadona, cetamina, buprenorfina, entre outras drogas de abuso. Em outra pesquisa utilizando a CG-MS, empregando amostras de sangue humano preparadas com os princípios ativos a serem estudados, os pesquisadores puderam identificar simultaneamente sete tipos de anfetaminas. Para comprovar a aplicação do teste na toxicologia forense, os pesquisadores utilizaram uma amostra de sangue obtida de um cadáver humano que teve a urina positiva para a presença de anfetamina. Nessa amostra utilizou-se a mesma técnica utilizada no experimento isolando simultaneamente duas anfetaminas, demonstrando a eficácia da técnica. No entanto, há testes que podem utilizar tanto o sangue como a urina, como ocorreu em estudo no qual se identificaram nove tipos de fentanila e 16 outros opioides nessas duas matrizes biológicas de forma confiável em casos de morte, óbitos que ocorrem durante a hospitalização e em mortes súbitas em jovens. O cabelo também pode ser utilizado como matriz biológica na pesquisa do uso de drogas de abuso. Em um trabalho foi relatado à determinação quantitativa de 13 drogas de abuso e de seus metabólitos em amostras de cabelo humano, por meio da HPLC-MS. Os pesquisadores enriqueceram as amostras de cabelo, provenientes de indivíduos que não eram usuários de drogas, com os princípios ativos que seriam posteriormente pesquisados. Após, as amostras foram extraídas e as substâncias alvo da pesquisa puderam ser identificadas. Apesar de as amostras de cabelo do estudo ter sido enriquecida com os princípios ativos, os pesquisadores relataram que utilizam a mesma técnica na rotina do laboratório, obtendo eficácia semelhante à atribuída no estudo. Em outro estudo envolvendo carabinoides, os quais são substâncias que induzem efeitos semelhantes ao tetraidrocanabinol (principal substância psicoativa encontrada nas plantas do gênero Cannabis), os pesquisadores conseguiram isolar 22 substâncias dessa classe em cabelo humano. Foram utilizadas tanto amostras embebidas com substâncias padrão como amostras de usuários crônicos de substâncias com carabinoides em sua composição. Nas amostras preparadas foi possível isolar os 22 carabinoides envolvidos na pesquisa, e nas amostras dos usuários foi possível também isolar carabinoides em todas as oito amostras testadas. Outra utilização da cromatografia na toxicologia forense são os casos em que se utilizam drogas para a prática de crimes. A vítima recebe determinada substância que cause sonolência, amnésia ou inconsciência e é roubada ou até mesmo sofre abuso sexual. Assim, métodos cromatográficos acoplados a espectrofotometria de massa podem identificar simultaneamente 128 ou mais drogas. Em um estudo, pesquisadores conseguiram isolar de uma amostra de urina enriquecida com 128 padrões das drogas utilizadas nestes crimes, entre elas estavam opioides, anfetaminas, barbitúricos, alucinógenos, benzodiazepínicos, relaxantes musculares e outras drogas. Testes semelhantes ao descrito anteriormente podem também serem aplicados no sangue. Pesquisadores utilizaram da U-HPLC associada ao espectrômetro de massa para identificar 46 compostos utilizados na facilitação de crimes ou de drogas de abuso no sangue de vítimas de abuso sexual. Apesar do uso de matrizes biológicas como o sangue e a urina, algumas vezes não há a disponibilidade de tecidos em bom estado de conservação, como no caso de corpos que são encontrados em avançado estado de decomposição. Nestes casos, a detecção de substâncias que possam estar envolvidas na causa da morte pode ser realizada em larvas de insetos, que se alimentam dos tecidos em decomposição, a qual pode ser realizada por meio da cromatografia. O primeiro trabalho que relatou o uso da cromatografia para identificação de compostos relacionados com a morte do indivíduo em larvas de insetos foi publicado em 1980. O trabalho descreveu um caso de um corpo que foi encontrado aproximadamente 14 dias após a morte e estava em avançado estado de decomposição. Havia a suspeita de suicídio pelo consumo de uma alta dose de fenobarbital, no entanto não havia tecido humano para se realizar os testes toxicológicos. Os pesquisadores coletaram larvas de insetos que se alimentavam do cadáver, extraíram a amostra e realizaram a CG e CCD, confirmando a overdose por fenobarbital. Em outro trabalho semelhante os pesquisadores utilizaram de tecido cerebral de ratos e suínos e de larva de Lucilia sericata. Inicialmente eles administrarammetilfenidato por via intravenosa nos ratos e posteriormente realizaram a eutanásia, separando o cérebro no qual foram colocadas as larvas de insetos. No tecido cerebral de suínos o metilfenidato foi adicionado diretamente, com posterior colocação das larvas. Nas larvas dos dois tipos de tecido testado foi possível o isolamento do metilfenidato por cromatografia líquida associada ao espectrofotômetro de massa. Assim o método mostrou-se como alternativa toxicológica para o estudo do metilfenidato em larvas encontradas em corpos em decomposição. No controle do doping em atletas o principal objetivo do emprego das técnicas de cromatografia é a monitorização do uso ou do abuso de drogas que podem estimular o crescimento muscular, aumentar a resistência em competições, reduzir o peso corporal ou reduzir a dor causada por esforço excessivo.
O uso de desmopressina é proibido entre atletas de elite, por mascarar a ação de drogas diuréticas. Diante disto pesquisadores desenvolveram, por meio da cromatografia acoplada ao espectrofotômetro de massa, um teste para detecção de demospressina na urina humana, e 13 consideraram a técnica adequada para laboratórios que trabalham com o controle de doping. Além da desmopressina inúmeros outros compostos são proibidos para atletas de elite e estão listados na The 2012 Prohibited List da World Anti-Doping Agency. A WADA foi criada em 1999 como agência independente, financiada pelo movimento desportivo de diferentes governos do mundo, e estabelece que muitos dos testes anti-doping utilizem da cromatografia acoplada a técnicas espectrométricas. Ela tem como objetivo a pesquisa científica, desenvolvimento de métodos de detecção de doping e acompanhamento do código mundial anti-doping, demonstrando assim a importância das técnicas cromatográficas neste tipo de exame.