Procedimentos básicos em microbiologia

Prévia do material em texto

Departamento de Microbiologia
Insti tuto de Ciências Biológicas
Universidade Federal de Minas Gerais
htt p://www.icb.ufmg.br/mic
As técnicas assépti cas são instrumentos indispensáveis para o isolamento, culti vo e identi fi cação de 
microrganismos. Têm a fi nalidade de evitar contaminações do meio de cultura ou dos materiais uti -
lizados para determinado procedimento e por microrganismos presentes no meio (ar, água, mãos, 
roupas, etc.).
Abaixo tem-se algumas medidas importantes que devem ser observadas pelo manipulador duran-
te a práti ca de técnicas de crescimento e isolamento de microrganismos, com o fi m de preservar 
a pureza do culti vo e minimizar os riscos de infecção ou intoxicação para o manipulador e para o 
ambiente onde a técnica está sendo realizada. 
Procedimentos básicos em microbiologia: técnicas 
assépti cas e culti vo de microrganismos
 1Procedimentos básicos em microbiologia - www.icb.ufmg.br/mic
Técnicas assépti cas
Zona de esterilidade
As manipulações devem ser feitas dentro de uma 
capela microbiológica de fl uxo laminar (Figura 1), 
que pode ser tanto de fl uxo horizontal quanto ver-
ti cal. O fl uxo um ambiente estéril dentro da capela. 
Na ausência de uma capela laminar, a manipulação 
deve ser feita por trás da chama do bico de gás, de 
forma a garanti r o estabelecimento de uma zona de 
esterilidade. É somente nesta zona estéril, que os 
tubos ou recipientes com meios de cultura estéreis 
e o material biológico a ser inoculado, deverão ser 
abertos ou manipulados. Qualquer outro material 
estéril (ex: caixa de ponteiras, seringas, potes con-
tendo microtubos, etc.) uti lizado nos procedimen-
tos só pode ser aberto nesta área, para ser preser-
vada a sua esterilidade.
Figura 1 - Capela de Fluxo Laminar Verti cal
 2Procedimentos básicos em microbiologia - www.icb.ufmg.br/mic
Flambagem
Alças de platina
Tanto a alça quanto o fio de platina devem ser flambados antes e 
depois de qualquer operação de semeadura ou inoculação de mi-
crorganismos. Para tanto, devem ser aquecidos ao rubro e a parte 
inferior do cabo deve ser passada na chama 2 a 3 vezes. A posição 
correta para a flambagem da alça é que a mesma faça um ângulo de 
45o em relação à mesa de trabalho (Figura 2). Deve ser utilizado o 
cone interno da chama do bico de Bunsen. Para retirar o material, 
seja para fazer um esfregaço ou para uma semeadura, esfriar previa-
mente a alça. Deixar esfriar nas proximidades da chama, ou em um 
tubo contendo água estéril. 
Tubos ou frascos
Figura 2 - Posição correta 
para a flambagem da alça.
Toda vez que fizer uma semeadura ou inoculação de microrganismos, utilizando tubos de ensaio, 
tubos de rosca ou frascos do tipo Erlenmeyer, deve-se flambar a boca dos mesmos imediatamen-
te após a retirada da tampa (ou tampão de algodão). A tampa deverá ser mantida segura pelo 
dedo mínimo da mão. Caso esteja repicando a cultura para outro tubo, o mesmo procedimento 
deve ser feito com este outro tubo antes da inoculação dos microrganismos. Incliná-los, sempre, 
a aproximadamente 30°. No caso de tubo com ágar inclinado, este deve ficar de preferência na 
horizontal. Após a retirada do material com alça ou pipetas, flambar novamente a boca do tubo e 
colocar a tampa. Descartar as ponteiras usadas em recipientes, de preferência, contendo soluções 
detergentes ou desinfetantes.
Esterilização de materiais
Autoclave
A autoclave é um equipamento eficiente para a esterilização de diversos materiais e meios de 
cultura. Consiste no tratamento térmico úmido sob pressão, em geral, a 121°C por quinze minu-
tos. Como exemplos de uso da autoclave têm-se a esterilização de placas de Petri, tubos falcon, 
microtubos, ponteiras, meios de cultura líquidos ou contendo ágar, papéis toalha, materiais con-
taminados, pipetas manuais, etc. No entanto, como medidas de segurança ou para evitar estragos 
com os materiais e meios de cultura, alguns cuidados devem ser tomados, como por exemplo: 
acomodar bem os materiais e não encher demais a autoclave; deixar sair todo o vapor para então 
fechar a válvula de segurança; estar atento à temperatura marcada na autoclave e sempre medir 
o tempo transcorrido; assim que desligar a autoclave, esperar a temperatura abaixar para então 
abrir a válvula de escape do vapor e, quando todo o vapor sair, a autoclave pode ser aberta e o ma-
terial que foi esterilizado retirado. A autoclave pode existir de diversos tamanhos e configurações, 
dependendo da sua finalidade (Figura 3).
 3Procedimentos básicos em microbiologia - www.icb.ufmg.br/mic
Forno de Pasteur
Algumas substâncias e materiais, como instrumentos metálicos, seringas de vidro, vaselinas e 
óleos, às vezes não podem ser submetidos ao calor úmido e devem ser esterilizados sob calor 
seco. Em geral, são necessárias temperaturas maiores e tempos de exposição mais longos para se 
atingir a esterilização do que os empregados na autoclave, uma vez que o poder de penetração do 
calor seco é menor que o do calor úmido.
Produtos químicos
Compreende a utilização de produtos do grupo dos aldeídos, glutaraldeídos e formaldeídos. Como 
apresentam toxicidade, não são indicados como medida de primeira escolha, no entanto são in-
dispensáveis para a esterilização de materiais termossensíveis, tais como artigos de nylon e teflon, 
luvas, tubos de borracha e outros.
Figura 3 - modelos de autoclave
Desinfecção e antissepsia
A desinfecção e antissepsia consistem na descontaminação de materiais inertes e tecidos vivos, 
respectivamente, por microrganismos em suas formas vegetativas. Para fins de desinfecção e 
antissepsia, em geral, faz-se o uso de produtos químicos, Entre estes produtos, são largamente 
utilizados o hipoclorito de sódio, álcool etílico a 70%, soluções de iodo e aldeídos.
Cultivo de microrganismos
Os microrganismos podem ser provenientes de diversas fontes naturais ou então serem adquiridos 
de culturas previamente armazenadas, podendo estar refrigerados ou liofilizados. O crescimento 
destes microrganismos é otimizado quando inoculados em meios de cultura apropriados e manti-
dos em condições de temperatura, aeração e tempo de crescimento adequados. Caso não se co-
nheça os microrganismos que estão sendo cultivados, como no caso do estudo da microbiota de 
determinado local, normalmente eles são isolados e identificados para então poderem ser adqui-
ridas as culturas puras. Inúmeras técnicas de cultivo e isolamento de microrganismos podem ser 
empregadas e no presente texto, somente é abordada uma visão superficial dos procedimentos 
básicos utilizados para tais fins.
 4Procedimentos básicos em microbiologia - www.icb.ufmg.br/mic
Condições de incubação
As técnicas empregadas para o isolamento e cul-
tivo de microrganismos dependem da fonte (ali-
mentos, tecidos vivos, água, ar, etc.) e do tipo de 
microrganismo que se deseja isolar (enteropa-
tógenos, bactérias lácticas, fungos filamentosos, 
leveduras, etc.). Por exemplo, alguns microrga-
nismos crescem somente ou preferencialmente 
em condições de anaerobiose e, portanto, após 
o repique em meios de cultura adequados, os 
tubos ou placas devem ser acondicionados em 
câmaras de anaerobiose (Figura 5). Na ausên-
cia desta, existem outros equipamentos com o 
fim de manter uma atmosfera livre de oxigênio, 
como jarras de anaerobiose e envelope plástico 
para anaerobiose.
Para os microrganismos aeróbios, a incubação 
das placas ou tubos contendo os inóculos é nor-
malmente feita em estufas bacteriológicas (Figu-
ra 6). Tanto em condições aeróbias e anaeróbias, 
o controle da temperatura é importante para se 
obter o crescimento dos microrganismos na taxa 
adequada. Enquanto muitos microrganismos 
crescem em temperatura ambiente ou até mes-
mo em condições extremas, outros têm a melhor 
taxa de crescimento a 37°C e, assim, devem ser 
mantidos em estufas com a temperatura regula-
da.
Cultivo em tubos contendo meios de cultura lí-
quidos
Tal procedimento é bastante útil, pois possibilita 
a rápida e elevada multiplicação de microrganis-
mos.Se o objetivo for o isolamento, os microrga-
nismos podem ser crescidos nos meios de cultura 
líquidos adequados, seguido por semeadura 
Figura 4 - Câmara de anaerobiose
Figura 5 - Estufa Bacteriológica
em placas. A inoculação de microrganismos em meios de cultura líquidos pode ser feita com o 
auxílio de uma alça de platina previamente flambada ou alça descartável esterilizada, caso os mi-
crorganismos sejam provenientes de meios sólidos ou semi-sólidos, ou através de uma pipeta, nor-
malmente quando se está fazendo o repique de uma cultura que está armazenada em meio líquido.
Semeadura em placas
Na maioria dos casos, o microrganismo a ser isolado faz parte de uma população mista, sendo 
indispensável o seu isolamento no sentido de obtenção de cultura pura. Uma das maneiras de se 
obter uma cultura pura consiste no emprego da técnica de semeadura, em que são obtidas colônias 
isoladas de microrganismos. As colônias são caracterizadas por suas características morfológicas e, 
dependendo do objetivo, são cultivadas separadamente em meios sólidos ou líquidos para a pos-
terior identificação. A técnica de semeadura também pode ser aplicada em determinados estudos 
com o objetivo apenas de cultivo ou para quantificar a população microbiana.
 5Procedimentos básicos em microbiologia - www.icb.ufmg.br/mic
Inoculação por estrias ou esgotamento em pla-
cas de ágar
A técnica de semeadura por estrias múltiplas con-
siste em espalhar o material com o auxílio de uma 
alça bacteriológica, fazendo estrias sucessivas até 
o esgotamento do material, de modo a obter-se 
um perfeito isolamento das bactérias existentes 
na amostra, que após a incubação, formarão as 
colônias isoladas sobre a superfície do ágar. A exe-
cução é simples e devem ser tomados alguns cui-
dados para que realmente consiga o isolamento 
das bactérias. Primeiramente, deve-se flambar a 
alça de platina (ou então pode-se utilizar alças de 
plástico descartáveis previamente esterilizadas) e 
introduzi-la no meio contendo as bactérias. Fazer 
então o estriamento na superfície do ágar da pla-
ca de Petri Após a primeira estria, flambar nova-
mente a alça, girar a placa cerca de 30˚ e puxar 
nova estria. Repetir esse passo pelo menos mais 
2 vezes (Figura 5). Lembre-se de que a quantida-
de de material a ser inoculada deve ser mínima, 
sendo que em muitos casos, é necessário diluir o 
meio do qual os microrganismos são provenien-
tes; caso contrário, pode haver a justaposição das 
colônias e por isso não se pode isolá-las. 
Método de “espalhamento” em placa
 Consiste em espalhar o material (suspensão bac-
teriana na maioria das vezes) com o auxílio de um 
swab (para obtenção de tapete uniforme) ou alça 
de Drigalski (para obtenção de colônias isoladas 
após diluição), fazendo a semeadura por toda a 
superfície da placa de Petri (Figura 6). Deve-se 
ter o cuidado de garantir que toda a superfície da 
placa seja semeada, evitando regiões sem seme-
adura. Recomenda-se que o procedimento de se-
meadura com o swab seja feito em três direções 
distintas, com diferença de 30 graus, e com a alça 
em toda a superfície, girando a placa.
Figura 6 - Semeadura por esgotamento em pla-
ca: segundo e terceiro conjunto de estrias
Figura 7 - Semeadura por esgotamento em pla-
ca: segundo e terceiro conjunto de estrias
Figura 8 - Semeadura em placa por espa-
lhamento utilizando alça de Drigalski
RUSSO, E.; RUSSO, E. M. A. Controle de infecção e normas de biossegurança: uma necessidade e uma obrigação. Rev. 
odontol. UNICID;13(1):63-72, jan.-abr. 200.
BRASIL. Diretrizes gerais para o trabalho em contenção com agentes biológicos: Ministério da Saúde, Secretaria de Ciên-
cia, Tecnologia e Insumos Estratégicos. Brasília, DF: Ministério da Saúde, 2006. 50p.
Boop, C.A. Manual of clinical microbiology. 7º Ed., Ed. Murray, American Society for Microbiology, Washington, DC, 1999.
Literatura sugerida
Procedimentos básicos em microbiologia - www.icb.ufmg.br/mic