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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE Relatório dos experimentos das aulas práticas síncronas e assíncronas Aluno: Rafael de Oliveira Costa Professora: Helena Carla Castro Cardoso De Almeida Monitores: Beatriz Drummond e Julia Habibe Disciplina de Bioquímica Fundamental Curso de Farmácia Turma F2 1) Reação de Biureto Objetivo: identificar proteínas em uma solução pelo uso do reagente biureto. Materiais: reativo do biureto, água destilada, solução diluída de proteínas e solução de aminoácidos. Método: o reagente biureto, quando em solução aquosa, se dissocia e libera o íon cobre. Esse cátion bivalente se ligará nos grupamentos amino da ligação peptídica, logo ele sinalizará a presença ou a ausência de proteínas na solução. Em caso positivo, a solução ficará com uma coloração azul-violeta. Pergunta: A quantidade de proteínas pode alterar a intensidade da cor da reação? Sim, pois haverá maior quantidade de grupamentos amino para o cobre se ligar, o que conferirá alteração na intensidade da cor da reação, para mais ou para menos. No tubo 1: 0,5mL de água destilada + 1mL do reativo de biureto No tubo 2: 0,5mL de proteína + 1mL do reativo de biureto No tubo 3: 0,5 mL de aminoácido + 1mL do reativo de biureto Resultado: Após a análise dos tubos, é possível verificar que o tubo 1 ficou levemente azulado devido à própria coloração do reativo de biureto. No tubo 2, a amostra apresentou uma coloração azul-violeta expressiva, o que ratifica a presença de proteínas na solução. Já o tubo 3, permaneceu incolor, já que não há grupamento amino para que o cátion cobre se ligue e altere a cor do sistema. Portanto, o reagente de biureto configura-se como uma substância capaz de detectar proteínas presentes em uma solução aquosa, a partir de proteínas e peptídeos com dois ou mais aminoácidos. 2) Reação de Ninhidrina Objetivo: identificar aminoácidos em uma solução pelo uso da ninhidrina. Materiais: ninhidrina, prolina, proteína, solução com aminoácido, água destilada. Método: o teste de ninhidrina detecta a presença ou a ausência do grupo amino livre dos aminoácidos, do grupo amino terminal de peptídeos e proteínas em uma temperatura acima da temperatura ambiente. Em caso positivo, a solução ficará com uma coloração púrpura. No tubo 1: 0,5mL de água destilada + 2mL de ninhidrina No tubo 2: 0,5mL de proteína + 2mL de ninhidrina No tubo 3: 0,5mL de aminoácido + 2mL de ninhidrina No tubo 4: 0,5mL de prolina + 2mL de ninhidrina Obs: todos os tubos foram colocados em banho-maria Resultado: No tubo 1, a amostra permanece incolor. O tubo 2 forma uma cor púrpura, pois possui grupamentos amino livres. Já o tubo 3, forma uma cor púrpura mais intensa no meio, pois contém maior quantidade de grupamentos amino livres. No caso da prolina no tubo 4, que é uma amina secundária, esse aminoácido reagiu de forma diferente com a ninhidrina ao passo de formar uma imina e atribuir uma coloração amarela na amostra. 3) Precipitação ácida Objetivo: precipitar a proteína pelo ácido tricloroacético (TCA) e com o auxílio do reativo biureto. Materiais: ácido tricloroacético, solução diluída de proteína, reativo biureto. Método: o TCA foi usado como agente precipitante de proteínas e de peptídeos provenientes da solução diluída de proteínas. O reativo biureto auxilia na detecção de proteínas na amostra. · Adicione 1mL de TCA + 1mL da solução diluída de proteínas no tubo 1. · Homogeneizar, observar e colocar o tubo 1 na centrífuga por 10 minutos. · Separe as frações sobrenadante e o precipitado. · Adicionar 0,5mL do sobrenadante no tubo 2. · Adicionar 1mL do reativo biureto no tubo 2. Resultado: Após realizar o método de precipitação ácida com uso de do ácido tricloroacético, foi utilizado o reativo biureto no tubo 2 para detectar a presença de proteína. Foi possível verificar, a partir da coloração mais clara, que não há presença de proteínas no tubo 2, logo toda a proteína precipitou quando foi adicionado o TCA e ao passar pela centrífuga. 4) Efeito da adição de sais Objetivo: precipitar a proteína a partir da adição de sais na solução. Materiais: solução diluída de proteína, solução saturada de sulfato de amônio, ácido tricloroacético. Método: Ao adicionar sais a uma solução, resulta em um aumento da concentração de íons no sistema. Nesse sentido, com a adição de pequenas quantidades de sal a uma solução contendo proteínas, as cargas provenientes da dissociação do sal passam a interagir com as moléculas proteicas, diminuindo a interação entre elas. Assim, implica o aumento da solubilidade da proteína no meio aquoso, cujo fenômeno é chamado de “salting-in”. Em meio a elevada concentração de íons no sistema, ocorre o efeito “salting-out”. Nesse contexto, a água, detentora de um elevado poder de solvatação, passa a interagir com ambas as espécies: proteínas e os íons adicionados. Contudo, a água apresenta maior capacidade de solvatação de partículas menores, o que gera uma maior interação proteína-proteína, diminuição da solubilidade em meio aquoso e a precipitação da proteína. · Adicione 2mL da solução diluída de proteínas + 2mL da solução saturada de sulfato de amônio. · Homogeneizar, centrifugar por 10 minutos e separar as frações sobrenadante e precipitado. · Adicionar o sobrenadante no tubo 1 e por TCA. · Homogeneizar o tubo 1, centrifugar novamente e dissolvê-lo com 1mL de tampão. · Adicionar 1mL de tampão no tubo 2 contendo o precipitado, agitar e observar. Resultado: Após realizar o método de precipitação da proteína a partir da adição de sais na solução gerou um precipitado branco, uma vez que o excesso de sais na amostra praticamente anula a interação da água com as proteínas, tornando estas insolúveis. 5) Efeito da adição do solvente orgânico Objetivo: precipitar a proteína a partir da adição de solvente orgânico. Materiais: álcool etílico, solução com proteína Método: A solubilidade das proteínas em solventes orgânicos é menor do que em água, uma vez que a água apresenta constante dielétrica elevada (grandeza que mede a capacidade de interação do solvente com o soluto, o que difere para cada solvente). Em uma solução aquosa com moléculas proteínas, há interações entre água-proteína e proteína-proteína, sendo a primeira mais dominante, já que a água possui a capacidade de separar as partículas do soluto. Já para os solventes orgânicos, a constante dielétrica é inferior à da água, então a interação proteína-proteína se sobressai e a proteína precipita. Tubo 1: 1mL da solução de proteínas + 2mL de etanol gelado (adicionar lentamente) Resultado: Após adicionar o etanol gelado, é possível verificar o aparecimento de uma mistura trifásica – álcool, proteína como corpo de fundo e água. A precipitação de proteínas por solventes orgânicos, como o etanol (álcool), é associada com uma mudança da constante dielétrica do meio, já que a proteína presente na solução atinge seu ponto isoelétrico e precipita. O álcool, quando utilizado a temperaturas baixas, é útil para separar misturas proteicas, já a temperaturas mais elevadas essa substância pode levar à desnaturação por rompimento das pontes de hidrogênio e formação de interações apolares, que são importantes para a manutenção da conformação proteica. Dessa forma, introduzir o álcool em uma temperatura gelada e de modo lento são indispensáveis para controlar a temperatura de reação entre a água e o álcool, pois é uma reação exotérmica.
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