Relatório 1 métodos instrumentais

Prévia do material em texto

Universidade de São Paulo 
Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto 
Departamento de Química 
 
 
 
Métodos Instrumentais 
 
 
Relatório – Experimento I 
Determinação de cafeína em chá mate por HPLC 
 
 
 
Isabela Ferreira de Lima; nºUsp: 11215998 
Maria Caroline dos Santos; nºUsp: 11370881 
Victória dos Santos Souza; nºUsp: 11297295 
 
 
 
 
 
 
Ribeirão Preto 
2021 
1 INTRODUÇÃO 
A cromatografia líquida de alta eficiência é uma das técnicas de separação mais 
utilizadas e sofisticadas na atualidade. A técnica cromatográfica, condiciona a separação 
de vários componentes de amostras analíticas possibilitando posterior determinação a 
partir da sistematização de dados e gráficos que o método instrumental estabelece. O 
sistema de separação cromatográfico HPLC implica em vantagens importantes na 
separação de analitos, justificando a sua larga utilidade nas indústrias, tais como a 
exatidão na quantificação, versatilidade na alteração do sistema como por exemplo nas 
diferentes colunas que podem ser usadas na separação de analitos de interesse (variando 
fase móvel e estacionária) e sensibilidade do método que está diretamente relacionada 
com o detector utilizado. 
Entretanto, existem desvantagens econômicas importantes, pois o sistema requer 
alto investimento, principalmente no que diz respeito ao detector que é membro 
fundamental/indispensável da instrumentação, contudo, inerente a sensibilidade da 
técnica HPLC. 
A determinação e quantificação da cafeína por HPLC é um excelente exemplo 
de aplicação da técnica que aborda especificidades importantes na distribuição do 
sistema. A cafeína se encontra em grãos de café, folhas de chá mate e semente de cacau 
por exemplo, possuindo uma larga utilidade terapêutica. A cafeína é conhecida também 
como 1,3,7-trimetilxantina, sendo um alcaloide com massa molecular de 194,19 g/mol, 
a figura 1 expressa sua estruturação química. 
 
Figura 1. Estrutura química da cafeína (1,3,7-trimetilxantina) 
Contudo, utilizaremos uma coluna cromatográfica de fase reversa (detalharemos 
posteriormente) e, obviamente, como sendo uma cromatografia em coluna, a fase 
estacionária é percolada pela fase móvel que força a passagem, com a amostra, para 
determinação dos analitos sob pressão na coluna cromatográfica. Analisaremos o 
mecanismo que pauta essas interações e suas implicações. Por fim, após a passagem 
pela coluna, os analitos e a fase móvel transmitem um sinal para o detector que 
sistematiza essas informações em um cromatograma (sinal em função do tempo de 
retenção 𝑇 ). Utilizaremos e discutiremos o detector de arranjo de diodos que detecta 
em comprimento de onda de 254nm. 
2 OBJETIVO 
Determinação da concentração da cafeína em chá mate utilizando a técnica 
instrumental de HPLC, a partir da construção da curva analítica e suas determinações 
quantitativas. 
3 MATERIAIS E MÉTODOS 
3.1 MATERIAIS 
 6 Balão volumétrico de 10 ml; 
 2 Béquer de 10 ml; 
 1 Béquer de 250ml; 
 1 Vidro de relógio; 
 1 Pipeta volumétrica de 0,50 ml 
 1 Pipeta volumétrica de 1,00 ml; 
 1 Pipeta volumétrica de 2,00 ml; 
 1 Pipeta volumétrica de 3,00 ml; 
 1 Microsseringa de vidro; 
 1 Membrana de filtração com poros de 0,45µm; 
 1 Proveta de 250 ml; 
 1 Proveta de 500ml ; 
 2 tubos Eppendorf de 2 ml; 
 1 Bastão de vidro médio; 
 1 Chapa de aquecimento; 
 1 termômetro de 100°C; 
 1 balança analítica; 
 Água ultrapura; 
 Solução padrão de cafeína 0,500 mg/ml; 
 Sachês de chá mate. 
3.1.2 EQUIPAMENTO 
 HPLC com detector de arranjo de Diodos (λ=254nm); 
 Coluna C18 – FE: octadicilsilano (5,0µm, 4,6 x 150 mm); 
 Pré coluna. 
3.2 MÉTODOS 
3.2.1 Preparo da fase móvel 
 
 
 
 
 
 
 
3.2.2 Desgaseificação da fase móvel 
 
 
 
 
 
 
3.2.3 Preparo das soluções padrão 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Medir separadamente nas 
provetas (500ml). Metanol 
500ml e na outra 500 ml de 
solução aquosa ácida pH 3,5. 
Depois adicionar os 
solventes ao frasco 
HPCL. 
Borbulhar gás Hélio, 
para a dispersão do gás 
oxigênio. 
Ilustração 
 
Partindo da solução padrão 
(concentração 0,5 mg ml-1), 
preparar 5 soluções diluídas 
em balões volumétricos de 
10ml 
As seguintes concentrações 
diluídas 0,025; 0,05; 0,075; 
0,100 e 0,125 mg ml devem ser 
preparadas com a solução de 
metanol. 
Portanto, os seguintes volumes 
devem ser adicionados para 
termos estas concentrações: 
0,5;1,0;1,5;2,0;2,5. 
Em seguida, injetar cada uma 
dessas soluções no HPLC, em 
triplicata, sempre em ordem 
crescente de concentração. 
3.2.4 Preparo da amostra de chá 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3.2.5 Condicionamento da coluna cromatográfica 
 
 
 
 
3.2.6 Injeção das soluções padrão e curva analítica 
 
 
 
 
 
 
Pesar a massa de um 
sachê de mate 
Inserir o sachê no béquer com 
200ml de água (ultrapura) á 80°C. 
Durante 10 min, mexendo 
esporadicamente com o bastão de 
Depois, aguarde que o 
extrato atinja a temperatura 
ambiente, ou acelere 
colocando-a o béquer em 
cima de uma bacia com 
Pipetar 3,0 ml do extrato em um 
balão volumétrico de 10 ml e 
completar o mesmo com a fase 
móvel. 
Filtrar o extrato com a 
microsseringa de vidro contendo a 
membrana porosa. Recolher o 
filtrado em eppendorf e injetar 
(triplicata) no HPLC. 
Ligar o HPLC e o computador Iniciar o bombeamento da fase 
móvel, aumentando a vazão da fase 
móvel lentamente até chegar a 1 
ml/min. Depois acordar a 
estabilização da pressão no sistema. 
Iniciar a injeção das 
soluções padrões de cafeína 
diluídas por ordem 
crescente 
Depois plotar gráficos com 
cada solução padrão. Área 
(eixo y) versus 
concentração mg/ml(eixo x) 
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 
Inicialmente, torna-se importante mencionar os parâmetros que iremos trabalhar 
e as especificidades do sistema que analisamos o analito. Nós utilizamos uma coluna de 
fase reversa, a qual se caracteriza pela menor polaridade da fase estacionária e maior 
polaridade da fase móvel. Coluna C18 – FE: octadicilsilano (5,0 µm, 4,6 x 150 mm), 
enquanto que a fase móvel é composta por metanol: solução aquosa ácida pH = 3,5 
(50:50 v/v). 
Iniciando com a determinação dos volumes, com a solução padrão de cafeína de 
concentração 0,0500 mg/mL. Preparamos 5 amostras para diluição no balão de 10,0 
mL. Nossa tarefa inicial seria determinar os respectivos volumes paras as concentrações 
de 0,025; 0,050; 0,075; 0,100 e 0,125 mg/mL. Determinamos os volumes utilizando a 
relação 𝐶 . V = C . V . Exemplificando, 
0, 025 mg/mL . 10 mL = 0, 500 mg/mL .V 
V = 0,500 mL 
Desse modo, para 0,025 mg/mL𝑉 = 0,500 𝑚𝐿 ; 0,050 mg/mL𝑉 = 0,0100 mL; 
0,075 mg/mL𝑉 = 1,50 mL; 0,100 mg/mL𝑉 = 2,00 𝑚𝐿; 0,125 mg/mL𝑉 = 2,5 𝑚𝐿. 
Tabela 1. Áreas resultantes nos cromatogramas apresentados para cada solução 
padrão preparada 
 
Concentração da solução 
(mg/mL) 
Área 
(𝒕𝒓=4,9 min) 
0,0250 838471 
0,0500 1732475 
0,0750 2529330 
0,100 3259818 
0,125 4187939 
 
 
Figura 2. Curva analítica obtida a partir das áreas e respectivas concentrações 
Com base no tempo de retenção da cafeína das soluções padrão (𝑡 =4,9 min) e 
analisando o cromatograma da amostra de chá, identificamos o pico da cafeína em 
t =4,899 com respectiva área das amostras triplicata. Desse modo, com a equação da 
curva analítica y = 3E+07x + 41723, torna-se possível deduzir o valor de concentração 
de cafeína na amostra. 
4.1) Determinando a concentração de cafeína mg/mL nas amostras 1, 2 e 3 
(diluídas) a partir da curva analítica obtida pela regressão linear dos valores de 
área e concentração da solução padrão 
1. Amostra 1: área identificada para a cafeína = 46262 
46262 = 3 * 10 x + 41723 x = 1,51 mg/mL 
(1,51 mg/mL) (10 mL) = C (3 mL) C =𝟓, 𝟎𝟑 . 𝟏𝟎 𝟒 mg/mL 
 
2. Amostra 2: área identificada para a cafeína = 1612199 
1612199 = 3 * 10 x+ 41723 x = 0,0523 mg/Ml 
(0,0523 mg/mL) (10 mL) = C (3 mL) C = 0,174 mg/mL 
3. Amostra 3: área identificada para a cafeína = 1635108 
1635108 = 3 .10 x + 41723 x = 0,0531 mg/mL 
(0,0531 mg/mL) (10 mL) = C (3 mL) C = 0,177 mg/mL 
y = 3E+07x + 41723
R² = 0,9986
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
4500000
0 0,05 0,1 0,15
Ár
ea
 
Concentração (mg/mL)
Média das concentrações calculadas: 
∁ = 
5,03 . 10 + 0,174 + 0,177
3
= 𝟎, 𝟏𝟏𝟕 𝐦𝐠/𝐦𝐥 
Desvio padrão: 
𝜎 = 
(5,03 . 10 − 0,117) + (0,174 − 0,117) + (0,177 − 0,117)
3
= 0,0825 
Coeficiente variância 
𝐶𝑉 = 
0,0825
0,117
 . 100 = 70% 
Contudo, observamos um valor de CV relativamente alta, isso se explica pela 
discrepância de resultados obtida na análise da primeira amostra se compararmos com a 
amostra 2 e 3. Entretanto, podemos observar que as amostras 2 e 3 apresentam 
resultados de concentrações precisos entre elas e se analisarmos acerca desses dois 
valores obtemos um desvio padrão de 0,0015 e o coeficiente de variação igual a 
0,855%. Portanto, nesse contexto teríamos obtido valores mais precisos e confiáveis. 
4.2) Determinando a concentração de cafeína mg/g em relação a massa do 
mate do sachê 
Inicialmente, temos uma massa de 2,1843 g colocada em um béquer com 200 
mL de água. Calculando a concentração nesses 200 mL de água obtemos uma 
concentração de 0,0109 g/mL 
C = 
2,1843 g
 200mL
= 0,0109 g/mL 
Agora, calculando a concentração que será obtida na diluição no balão de 10 
mL, encontramos a seguinte concentração 
(0,109 mg/mL) (10 mL) = C (3 mL) 
C = 0,0363 g/mL 
4.3) Cromatogramas obtidos com a injeção da solução padrão de cafeína 
0,025 mg/mL. Variando a composição da fase móvel. 
Essa etapa de análise se pauta na observação do que aconteceria com o fator de 
retenção cromatográfico se aumentássemos ou diminuíssemos a proporção de methanol 
na fase móvel. De imediato, notamos que se a proporção de metanol é aumentada o 
sinal é obtido mais rapidamente e, portanto, detectado mais brevemente. Isso acontece 
pelo fato de estarmos trabalhando com uma coluna do tipo reversa, onde a fase 
estacionária (octadecilsilano) possui um caráter mais apolar ou menos polar do que a 
fase móvel. Desse modo, o analito interage menos com a coluna cromatográfica e mais 
com a fase móvel e acaba sendo detectado mais rapidamente. Ou seja, os analitos eluem 
mais cedo e o fator de retenção diminui (figura 3) 
 
 Figura 3. Diferenças no fator de retenção alterando a proporção da fase móvel 
(a) Metanol: solução aquosa (pH = 3,5) 45:55 (v/v) 
(b) Metanol: solução aquosa (pH = 3,5) 40:60 (v/v) 
(c) Metanol: solução aquosa (pH = 3,5) 35:65 (v/v) 
(d) Metanol: solução aquosa (pH = 3,5) 30:60 (v/v) 
Apresentemos na figura 3 o momento da retenção para cada proporção de 
metanol e solução aquosa e notamos diferenças na velocidade de eluição para cada 
variação de fase móvel. Como observamos anteriormente, quanto mais polar for a fase 
móvel mais rapidamente o sinal do analito sera detectado, isso porque o não haverá uma 
interação mais significativa com a fase estacionário (que é mais apolar). 
Por isso, diminuindo a proporção de metanol a fase móvel tende a ser menos 
polar possibilitando uma maior interação com a fase estacionária (apolar) e 
consequentemente aumenta o fator de retenção do analito que interage com a fase 
estacionária. É o que acontece com a fase móvel (d), observe que o sinal dentre as 
quatro eluições acontece de forma mais demorada, enquanto que o analito (d) é o que 
possui maior fator de retenção porter a fase móvel menos polar (possuir menor 
quantidade de metanol) condicionando uma maior interação do analito com a coluna. 
De forma geral, notamos que o fator de retenção aumenta com a diminuição de 
methanol em fase móvel como se observa no cromatograma. O sinal (a) apresenta o 
outro extremo, com sua maior proporção de metanol e consequente eluição mais rápida, 
enquanto que as fases móvel (b) possui maior polaridade e por isso elui mais 
brevemente que o analito (c) que se torna menos polar nessa proporção. 
4.4) Melhor comprimento de onda para analisar a cafeína 
O detector UV para a cafeína possui um limite máximo de absorção no 
comprimento de onda entre 271 e 275 nm. Contudo, a quantificação se torna mais 
eficiente em torno dessa faixa de comprimento de onda. Trazendo um pouco desse 
comportamento de detecção máxima da cafeína nesse comprimento de onda, podemos 
analisar o cromatograma como base de observação (figura 4) 
 
Figura 4.Cromatograma da absorção da cafeína em dois comprimentos de onda 
Como análise inicial, podemos dizer que o comprimento de onda igual 272 nm 
seria o ideal para a análise do analito (cafeína). Podemos nos pautar, na área aparente da 
linha vermelha na figura 4 que é nitidamente maior e, portanto, há uma maior 
quantificação do analito. Outro fator importante para essa afirmação seria o alargamento 
do pico da linha vermelha que aparenta ser menor. Como sabemos, quanto mais 
achatado, isto é, mais fino se torna o pico maior é a eficiência da separação. Contudo, 
quanto maior o número de etapas de equilíbrio, melhor se torna a separação, e por isso o 
pico fica mais estreito. Observamos que o pico em 272 nm é mais fino porque o valor 
da base W entre os dois comprimentos de onda são bem parecidos, entretanto a linha 
vermelha afunila seu tamanho na extremidade quantificando uma maior área e um valor 
de 𝑤 menor (metade do pico). 
Para ilustrar essa ideia e também mencionar a importância do número de pratos 
teóricos na análise quantitativa de eficiência cromatográfica, fizemos uma tentativa de 
medida da largura do pico para calcularmos o número de pratos teóricos N. Lembrando 
que, quanto maior for o número de pratos mais eficiente se torna a separação 
cromatográfica. 
4.4.1) Comprimento de onda272 nm 
𝑁 = 16 (
𝑇
𝑊
) 
𝑁 = 16 (
9,3
0,2
) 
N= 34.596 
4.4.2) Comprimento de onda 254 nm 
𝑁 = 16 (
9,3
0,4
) 
N = 8.649 
Contudo, notamos um maior número de pratos teóricos em 272 nm, esse dado é 
um parâmetro muito importante para analisarmos a eficiência de uma separação. 
Portanto, o melhor comprimento de onda para separação da cafeína seria 272 nm. 
 
Figura 5. Pico da cafeína em comprimento de onda 272 nm 
Figura 5 se torna interessante nessa análise, pois ela nos mostra exatamente o 
fator de retenção da cafeína que está em torno de 272 nm. 
4.5) Mecanismo que envolve a separação 
Sabemos que há um equilíbrio de sorção do analito entre as fases estacionária e 
móvel e sendo líquido-líquido entre as fases. A cromatografia de partição de fase ligada 
se enquadra no mecanismo de separação da fase reversa neste experimento, pois se 
baseia em um equilíbrio líquido-líquido o qual a fase estacionária está ligada a uma 
superfície sólida e o soluto possui afinidade com a fase estacionária. Contudo, na 
superfície ocorre adsorção física. 
Outra informação importante seria que a cromatografia de fase liga como 
mecanismo, o suporte para a maioria dos empacotamentos de fases ligadas são 
preparadas com silica rígida ou com composições de silica. Caracteristica importante do 
suporte da nossa fase estacionária. 
5 CONCLUSÃO 
 Diante do experimento realizado, observamos que numa cromatografia HPLC a 
cafeína demonstra uma melhor interação com uma fase mais polar e que o melhor 
comprimento de onda para a análise da cafeína, nos parâmetros do equipamento 
utilizado, é de 272 nm; visto que nesse comprimento de onda é encontrado maior 
número de pratos teóricos, significando uma melhor eficiência. Analisando os cálculos 
obtidos a partir dos dados coletados, vimos que o desvio padrão encontrado a partir da 
concentração das 3 amostras foi relativamente baixo, mesmo existindo um valor de 
concentração (amostra 1) que se desmonstre mais discrepante em relação aos outros. Oresultado do desvio padrão se apresenta ainda menor quando recalculado sem o valor de 
concentração da amostra 1. Como o desvio padrão é um parâmetro para dizer o nível de 
precisão, concluímos que o experimento realizado em questão foi preciso, com dados 
satisfatórios. 
REFERÊNCIAS 
SKOOG, HOLLER, NIEMAN, Princípios de Análise Instrumental, 5ª Edição, 
Editora Bookman, São Paulo-SP, 2002. 
SKOOG, WEST, HOLLER, CROUCH, Fundamentos de Química Analítica, 
Tradução da 8ª Edição norte-americana, Editora Thomson, São Paulo-SP, 2006.