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CROMATOGRAFIA A LÍQUIDO – parte I – HPLC
Bibliografia 
COLLINS, C. H., BRAGA, G. L., BONATO, P. S., Introdução a 
Métodos Cromatográficos, 1997, 7ª ed 
Cope, M.J., Davidson, I.E., J. Phys E: Sci Instrum, 19 p. 763, 
1986. 
 
OBSERVAÇÃO: Trazer um comprimido de um medicamento 
que contenha ácido acetilsalicílico. 
Instruções gerais: 
. i)Preparo da fase móvel: A fase móvel deverá ser 
preparada medindo-se os volumes de água e solvente orgânico 
separadamente, com auxílio de uma proveta. O pH deverá ser 
ajustado ainda na fase aquosa, antes da adição do solvente 
orgânico. A fase móvel deve ser desgaseificada em banho de 
ultrassom por 20 min; ii) Condicionamento da coluna: Ajustar 
gradativamente a vazão da fase móvel de 0 a 1,5 mL/min, 
deixando-a passar pela coluna por 15 min a 1,5 mL/min; iii) 
Limpeza da coluna: Após o uso, diminuir de forma gradual, a 
vazão da fase móvel até zero, e lavar a coluna com metanol por 
30 min a 1,0 mL/min. Caso a fase móvel contenha tampão, antes 
da limpeza com metanol, a coluna deverá ser lavada com a 
mesma proporção da fase móvel, porém sem o tampão (esse 
procedimento evita a precipitação do sal do tampão em metanol 
dentro do sistema cromatográfico). 
2. Ligar previamente o detector UV-Vis para que a lâmpada 
possa ser aquecida. 
3. Introduzir (com auxílio de uma micro-seringa) um volume, no 
mínimo, três vezes maior que da alça de amostragem para 
garantir que a alça esteja totalmente preenchida com a solução a 
ser injetada. Cuidado para não introduzir bolhas no sistema. 
Instrumentação 
Equipamento: Cromatógrafo a líquido Shimadzu 
modelo LC-10A, equipado com uma bomba de pistão. Pré-
coluna: Shim-pack G-ODS (4), sílica RP18, 5 µm de diâmetro de 
partícula, 10 mm de comprimento por 4,0 mm de diâmetro 
interno. Coluna: Shim-pack CLC-ODS (M), sílica RP18, 5 µm 
de diâmetro de partícula, 250 mm de comprimento por 4,6 mm 
de diâmetro interno. Detector: UV-vis, ajustado em 230 nm. 
Volume da alça de amostragem: 5 µL. 
Reagentes e Amostras 
Solvente de limpeza da coluna: Metanol. Fase Móvel: 
Acetonitrila: água (50:50 v/v), pH = 2,5 (ajustado com HCl) 
Soluções padrão: AB = padrão de ácido benzóico; AAS = padrão 
de ácido acetilsalicílico; MIX = mistura de ácidos benzoico, 
gálico e acetilsalicílico. 
Amostra: Determinar em balança analítica a massa de 1 
comprimido. Triturar o comprimido em um almofariz. Pesar, em 
um béquer de 100 mL, a massa de comprimido necessária para 
que a concentração final de AAS esteja dentro da faixa de 
calibração usada, num volume total de 100,0 mL. Adicionar 
cerca de 30 mL da solução da fase móvel. Manter o béquer em 
banho de ultrassom por 15 min. Transferir a solução para um 
balão de 100,0 mL completá-lo com água deionizada e filtrar a 
solução resultante em um filtro com poro de 0,2 µm. 
Experimento A: Identificação dos 
analitos pela técnica de spiking. 
Injetar a mistura de padrões (MIX). Depois, injetar 
MIX + AAS (mistura 1:3). Por fim, injetar MIX + AB (mistura 
1:3), e identificar os picos dos três componentes da mistura 
através da técnica de spiking. 
Experimento B: Quantificação do ácido 
acetilsalicílico 
Para melhorar a resolução dos picos observados no 
cromatograma do MIX, no qual foi usada como fase móvel, a 
solução de acetonitrila: água, 50:50, prepare 150 mL de uma 
nova fase móvel, cuja composição permita a separação em linha 
de base dos picos. 
A partir da solução AAS 100 mg/L, preparar, em um 
balão de 10,0 mL, soluções para a obtenção de uma curva de 
calibração na faixa de 20 a 100 mg/L. Completar com água 
deionizada. 
Injetar cada uma das soluções preparadas e construir 
uma curva de calibração com as soluções padrão preparadas. 
Injetar a amostra preparada e determinar a massa de cada analito 
encontrada no medicamento. 
 
Instruções para abertura dos arquivos: 
Programa OriginLab: 
No menu principal, abrir: File/Import/Simple Single ASCII. 
Procurar o arquivo no diretório salvo, abrir e selecionar ambas as 
colunas abertas. No menu Plot, selecionar a opção Line para 
obter o gráfico. Para cópia do gráfico em arquivo doc, ir ao menu 
Edit e selecionar CopyPage. Colar o gráfico no documento de 
destino. 
Para integração dos picos, na janela do gráfico do programa, 
selecionar Baseline no menu Tools; na guia “baseline”, clicar em 
“create baseline”; na guia “peaks”, clicar em “find peaks”, 
deixando habilitadas todas opções; por fim, na guia “área”, 
habilitar “use base markers” e clicar em “use baseline”. 
CROMATOGRAFIA A LÍQUIDO – parte II – CI 
Instrumentação 
Equipamento: Cromatógrafo de íons Metrohm, modelo 
761 SD Compact IC, equipado com uma bomba de pistão, bomba 
peristáltica para regeneração da coluna supressora e detector 
condutométrico. Pré-coluna: RP 2, 4,6 µm de diâmetro de 
partícula e 4,0 mm de diâmetro interno. Coluna: Metrosep A 
SUPP 4, 9 µm de diâmetro de partícula, 250 mm de comprimento 
por 4 mm de diâmetro interno. 
Reagentes e Amostras 
Solução de regeneração do supressor: 
H2SO4 100 mmol/L e H2O deionizada. Fase Móvel: Tampão 
4,0 mmol/L Na2CO3 + NaHCO3, pH = 10,0. Esta solução deve 
ser desgaseificada (banho de ultrassom e vácuo) por 15 minutos 
antes do uso. Amostra: deve ser desgaseificada apenas em banho 
ultra-som. Solução padrão estoque: MIX, contendo cloreto, 
brometo, acetato e fosfato, a 15 mg/L cada. 
Identificação dos padrões na mistura 
Injetar a solução padrão MIX. Discutir a ordem de 
eluição e fazer spiking com padrão cuja ordem de eluição seja 
duvidosa.