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MAPA/SDA/CGAL 
Laboratório Nacional Agropecuário - LANAGRO/RS 
Laboratório de Produtos de Origem Animal 
Método de Ensaio - MET 
Código: MET POA/16/02/02 
Página 1 de 5 
Emissão: 07/08/2014 
Pesquisa de Fosfatase Alcalina em Leite Fluido por Colorimetria 
 
 
 
1 Escopo 
Este método tem como objetivo descrever os procedimentos para o ensaio “Pesquisa de 
Fosfatase Alcalina em Leite Fluido por Colorimetria”. 
 
2 Fundamentos 
O principal objetivo do ensaio é verificar se o processo de pasteurização do leite foi 
eficiente. Também pode ser utilizado para verificação de fraude por adição de leite cru ao 
pasteurizado. 
A enzima fosfatase alcalina, que está sempre presente no leite cru, é desnaturada em 
temperaturas próximas a de pasteurização. O tratamento térmico igual ou mais severo do que 
temperaturas de 62,8ºC por 30 minutos ou a 71,8ºC por 15 segundos, aplicados 
comercialmente para a pasteurização, elimina todos os microrganismos patogênicos e 
também toda a atividade enzimática da fosfatase alcalina. Logo, o leite e seus derivados que 
apresentem um teste negativo para fosfatase alcalina são considerados pasteurizados e 
próprios para o consumo. Um teste positivo, neste caso, significa que não se alcançou a 
temperatura adequada. No leite UHT, o teste não é realizado rotineiramente, pois a 
temperatura para a esterilização atinge os 150º C, inativando a enzima. 
A atividade ótima da enzima ocorre em pH 9,65 e temperatura de 37-39°C sendo 
aparentemente aumentada pelos elementos cálcio, lítio, manganês e, especialmente, o 
magnésio. É fortemente inibida pelo zinco, mercúrio e cádmio. 
Vários fatores podem interferir na quantidade de fosfatase alcalina no leite, tais como 
raça, individualidade, período de lactação, produção (a quantidade de fosfatase, é 
inversamente proporcional à produção) e nos casos de mamite em que há grande aumento da 
fosfatase. 
A verificação da atividade enzimática é feita mediante a adição do substrato específico da 
enzima, em condições ideais para sua atuação, à amostra. A fosfatase alcalina hidrolisa 
ésteres de monofosfatos à temperatura e pH apropriados liberando compostos que podem ser 
detectados por desenvolvimento de cor. O método utiliza como substrato para a enzima o fenil 
fosfato dissódico. O fenol liberado reage com 2,6-dicloroquina cloroimida na presença de 
sulfato de cobre gerando um indofenol de cor azul. A quantidade de cor desenvolvida é 
proporcional à concentração da fosfatase. 
 
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3 Reagentes, padrões e materiais 
3.1 Reagentes 
a) Catalisador 
Preparo: dissolver 0,2 g de sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4.5 H2O) p.a. em 100 mL 
de água. 
b) Solução reagente 
Preparo: pesar 0,150 g de 2,6-dicloroquinona cloroimida (C6H2Cl3NO) p.a. e dissolver em 
50 mL de álcool etílico p.a. Transferir para frasco âmbar e estocar em geladeira. A coloração 
da solução recentemente preparada é amarelo-citrina, passando a amarelo-ouro e tendendo a 
escurecer, adquirindo tons amarronzados com o envelhecimento. Recomenda-se usar a 
solução por um período máximo de duas semanas, desde que conservada sob refrigeração e 
ao abrigo da luz. 
c) Substrato 
Preparo: em um béquer, pesar 0,5 g de fenilfosfato dissódico dihidratado (C6H5Na2O4P.2 
H2O) p.a. Dissolver com o tampão carbonato diluído e transferir para balão volumétrico de 500 
mL. Completar o volume com o mesmo tampão. 
Recomenda-se usar esta solução durante um período máximo de duas semanas. 
d) Tampão carbonato 
(1) Preparo da solução estoque: pesar 46,89 g de carbonato de sódio anidro (Na2CO3) p.a. 
e 37,17 g de bicarbonato de sódio (NaHCO3) p.a. Dissolver em água e transferir para balão 
volumétrico de 1000 mL, completando o volume. 
(2) Preparo da solução de uso: retirar uma alíquota de 25 mL da solução estoque e 
transferir para balão volumétrico de 500 mL e completar o volume. O pH deste tampão 
diluído situa-se entre 9,5 e 9,7. 
 
3.2 Materiais 
a) Tubo de ensaio com tampa rosca; 
b) Estante para tubos; 
 
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c) Pipetas graduadas de 2 e 5 mL, ou material volumétrico similar. 
4 Equipamentos 
a) Banho-maria com temperatura entre 39-41ºC 
b) Termômetro calibrado com divisão de pelo menos 1ºC. 
 
5 Precauções analíticas 
a) Ajustar a temperatura do banho-maria para que a mesma fique na faixa entre 40 ± 1º C. 
b) Os tubos de ensaio e suas tampas precisam encontrar-se perfeitamente limpos e sem 
qualquer vestígio de detergentes em decorrência do processo de lavagem e livres de 
fenol. 
c) As provas positivas são repetidas com reagentes recentemente preparados (usar 
somente o regente do substrato até duas semanas do preparo). 
d) A amostra sofre cuidadosa agitação antes de ser analisada, visando distribuir a gordura 
ou a camada de creme pelo líquido. A retirada de uma alíquota da amostra a partir da sua 
camada superior pode levar a resultado positivo ou suspeito, ainda que o leite tenha sido 
adequadamente pasteurizado. A fosfatase alcalina encontra-se adsorvida aos glóbulos de 
gordura. 
e) A fosfatase alcalina pode sofrer reativação após algum tempo de pasteurização do leite. 
Esta interferência é rara, porém pode ocorrer principalmente em leites com mais de 24 
horas de processamento. Alguns fatores que podem aumentar a reativação são o 
aumento da temperatura de pasteurização com diminuição do tempo de exposição, 
aumento da temperatura de estocagem do leite pasteurizado (10 a 34ºC), presença de 
certos elementos como cálcio e magnésio. A acidez, ao contrário, age inibindo a ativação 
da fosfatase. 
 
6 Procedimentos 
1) Transferir 0,5 mL da amostra a analisar para um tubo de ensaio; 
2) Adicionar 5 mL do substrato e tampar. Agitar ligeiramente e levar ao banho-maria mantido 
a 39-41º C durante 20 minutos. 
3) Esfriar o tubo de ensaio em água corrente. 
4) Adicionar 6 gotas de solução reagente e 2 gotas do catalisador. 
5) Levar o tubo novamente ao banho-maria a 39 – 41º C por 5 minutos. 
6) Fazer a leitura do teste. 
 
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A cada novo lote de substrato realizar o ensaio da amostra em paralelo com controle 
positivo (leite cru) e negativo (leite cru fervido). 
 
7 Resultados 
O resultado do ensaio fosfatase alcalina é registrado no formulário “Dados brutos da 
análise de leite” – anexo do POP POA/06 e inserido na planilha eletrônica IT POA/04. 
O teste é qualitativo e o resultado é expresso como positivo ou negativo. O resultado é 
considerado positivo com aparecimento de coloração azul intensa (quanto mais intensa a 
coloração, maior é a deficiência de pasteurização) e negativo com aparecimento de coloração 
cinza. 
 
7. 1 Critérios para aceitação do resultado 
Para o leite cru, o resultado esperado é positivo, pois ainda não sofreu nenhum tipo de 
processamento. Imediatamente após a pasteurização, o leite deve apresentar teste negativo 
para fosfatase alcalina. Quando o resultado for discordante, o ensaio é repetido com uso de 
controles. 
 
8 Arquivamento dos registros 
Não aplicável. 
Observação: os formulários utilizados neste método de ensaio são arquivados conforme 
procedimento descrito no POP POA/06 – Controle de Itens de ensaio Leite eDerivados 
Lácteos e IT POA/04 – Uso de Planilha Eletrônica na Revisão de Cálculos de Dados Brutos nas 
Análises de Leite, Derivados Lácteos, Água e Mel. 
 
9 Referências 
BRASIL. Ministério da Agricultura. Secretaria de Defesa Agropecuária. Métodos 
Analíticos Físico-Químicos para Controle de Leite e Produtos Lácteos. Instrução 
Normativa 68, 12/12/06. Brasília: Ministério da Agricultura, 2006. 
 
BRASIL. Ministério da Agricultura. Regulamentos Técnicos de Produção, Identidade e 
Qualidade do Leite . Instrução Normativa 51, 18/09/02. Brasília: Ministério da Agricultura, 
2002. 
 
CASTRO, Paula Rosa Schetino. Modificação de Método de Scharer para Determinação 
da Atividade de Fosfatase Alcalina em Leite. Viçosa, Minas Gerais, 2005. Consultado em 
 
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29/07/2014:http://alexandria.cpd.ufv.br:8000/teses/ciencia%20e%20tecnologia%20de%20aliment
os/2005/190246f.pdf 
10 Anexos 
Não aplicável. 
 
11 Alterações 
Alterado o texto do item 2 Fundamentos visando facilitar o entendimento da reação química 
e implicações no resultados do ensaio. 
Incluído no item 5 Precauções analíticas, subitem “a” a importância da vidraria estar livre de 
fenol (interferente) e no subitem “e” alguns fatores que podem interferir na reativação enzimática. 
Incluído uma referência bibliográfica (terceira bibliografia citada). 
 
12 Responsabilidades 
É de responsabilidade do RT ou seu substituto do POA assegurar que os analistas que 
utilizarem este MET tenham sido treinados e capacitados para sua execução e o mesmo esteja 
sendo corretamente seguido. 
 
 
Elaboração/Revisão: Aprovação: Verificação: 
Rita Beatriz Andrade - POA Tiago Charão de Oliveira - POA Eliana Menezes - UGQ 
Data: 30/07/2014 Data: 06/08/2014 Data: 07/08/2014