HPLC ou CLAE

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Instituto de Química/UFRGS- QUI-01-110-Aula Prática de HPLC 
Determinação de Ácido Ascórbico (Vit-C) em suco de frutas 
 
Nome: Natiele Reis Packowski Turma: C 
 
Objetivo: Determinação de Ácido Ascórbico (Vit-C) em suco de frutas. 
 
1) Amostra - Espremer meia laranja. Filtrar em funil de Buchner e do filtrado transferir 600 µL do suco 
de fruta para um balão volumétrico de 30 mL e avolumar o balão com fase móvel KH2PO4 0,01 molar e 
pH 2,6. Essa solução será denominada de solução A. Transferir com uma seringa, equipada com filtro de 
celulose de 0,2 µm aproximadamente, 0,6 mL da solução A para um vial (frasco) de injeção. 
 
2) Curva Padrão 
Soluções padrão contendo o ácido ascórbico na faixa de concentração de 5 µg mL-1 a 100 µg mL-1. A Tabela 
1 apresenta os dados de concentrações e áreas dos padrões para a determinação da curva de calibração da Vit-
C, para os detectores de UV e RID. 
Tempo de retenção da Vitamina C = 
Tabela 1 – Dados dos valores de concentrações e áreas correspondentes para os detectores UV-VIS e 
RID. Valores de triplicata 
 DP=desvio padrão 
 DP=desvio padrão 
 
 
2.1) Com os dados do Detector de UV-Vis, da Tabela 1, construa o gráfico da curva de calibração para 
a determinação da VIT-C, e determine a equação da reta. 
 
Detector de UV-Vis 
µg mL-1 Área 1 Área 2 Área 3 Área média 
Desvio 
padrão 
Desvio padrão relativo 
(%) 
5,0 3,1697 3,1264 3,1089 3,1350 0,0313 0,998 
10,0 6,5393 6,4089 6,3569 6,4350 0,0940 1,460 
25,0 16,7207 16,3831 15,7073 16,2704 0,5160 3,172 
50,0 33,6258 33,2146 33,1998 33,3467 0,2418 0,725 
75,0 50,7512 50,6039 50,7946 50,7166 0,09996 0,197 
Detector de RI 
µg mL-1 
Área 
1 
Área 
2 
Área 3 Área média 
Desvio 
padrão 
Desvio padrão relativo 
(%) 
5 0,0076 0,0093 0,0090 0,0086 0,00091 10,51 
10 0,0185 0,0193 0,0193 0,0190 0,00046 2,427 
25 0,0459 0,0498 0,0481 0,0479 0,00196 4,079 
50 0,1041 0,1047 0,1013 0,1034 0,00181 1,756 
75 0,1609 0,1622 0,1613 0,1615 0,00067 0,412 
 
 
 
Figura 1: Curva de calibração para o ácido ascórbico (vitamina – C) para o detector de UV-Vis. 
Equação da reta: 0,6796x – 0,4462 
 Tabela 2 – Valores das áreas no detector da amostra de suco de laranja 
 
 
2.2) Com os dados da Tab. 2 e a partir da curva de calibração determinada para o UV-vis segundo 
os dados da Tab. 1, determine a concentração em g L-1 da Vit-C na laranja. 
 
Área média = 31,3249 
Equação da reta: 0,6796x – 0,4462 
 
0,6796x – 0,4462 = 31,3249 
0,6796x = 31,3249 + 0,4462 
X = 31,77/0,6796 
X = 46,75µg/mL 
 
Fator de diluição: 50 
X = 46,75 x 50 
X = 2337,5 µg/mL 
X = 2,337g/L 
 
3.0) – Avalie a diferença de sinal entre os detectores de UV-vis e RID. 
 
As áreas obtidas com o detector RID são menores que as áreas obtidas com o UV-Vis. O detector RID 
tem baixa sensibilidade e pode acarretar erro na análise. Por isso devem ser utilizados os dados do detector de 
UV-Vis, que possuí alta sensibilidade, para realizar a determinação de concentração. 
 
y = 0,6796x - 0,4462
R² = 0,9999
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Á
re
a 
(m
A
U
.m
in
)
Concentração (µg/mL) 
Curva de Calibração
AMOSTR
A 
Área 1 Área 2 Área 3 
Área 
média 
Conc. (μg.mL-1) 
Fator 
Diluiçã
o 
Conc. na laranja (g.L-
1) 
1 31,0095 
30,998
8 
31,966
5 
 31,3249 46,75 50 2,337 
 
 
 
 
 
4.0) Responda as questões abaixo 
 
4.1 – Um analista recebe uma amostra cujos analitos presentes estão na ordem de traços e 
absorbem bem no UV-vis. Ele utilizou um equipamento HPLC equipado com o detector de Índice de 
refração. Você concorda com o analista no uso desse equipamento para a análise em questão? Justifique 
sua resposta. 
Não concordo, pois esse detector não é capaz de detectar substâncias em baixas concentrações, mesmo 
que este detector seja considerado universal pelo fato de todas as substâncias terem índice de refração próprio. 
Além disso, nessa analise os analitos presentes estão na ordem de traços e o equipamento não é capaz de 
detectar. 
 
4.2 – Qual a finalidade do uso da coluna guarda em análises por HPLC? 
A coluna guarda é utilizada para reter o material que possa ficar adsorvido na fase estacionária, 
remover o material particulado, saturar a fase móvel com a fase estacionária, além de aumentar a vida útil da 
coluna pois a protege da degradação.