GD 2 Aminoácidos e Peptídeos- Métodos Bioquímicos - Bioquimica RESOLVIDO

Prévia do material em texto

5o GD de Bioquímica 
 Aminoácidos e Peptídeos- Métodos Bioquímicos 
Professor Milton 
 
1- Uma solução de um peptídeo de sequência desconhecida foi dividida em duas 
amostras. Uma amostra foi tratada com tripsina e outra com quimiotripsina. Os 
menores peptídeos obtidos por tratamento com tripsina tinham as seguintes 
sequências 
 
Ala-Val-Cys-Arg 
Pro-Pro-Lys 
Val-Leu-Ser-Gly-Ile-Phe-Arg 
 
Os menores peptídeos obtidos por tratamento com quimiotripsina tinham as 
seguintes sequências: 
 
Ala-Val-Cys-Arg-Met-Tyr 
Val-Leu-Ser-Gly-Ile-Phe 
Arg-Pro-Pro-Lys 
 
Deduza a sequência do peptídeo 
 
Dados a enzima tripsina hidrolisa peptídeos onde houver resíduos de Lys ou 
Arg que contribuem com a carbonila na ligação peptídica e a quimotripsina em 
Phe, Tyr ou Trip da mesma forma. 
 
2- Como podemos separar os peptídeos abaixo empregando uma cromatografia 
de troca iônica que contém o trocador iônico Q-sepharose ? 
 
Val-Lys-His-Cys; Val-Arg-His-Cys ; Val-His-Tyr-Cys 
 
1
 
 
3- Seria possível separar os peptídeos acima pelas diferenças de ponto isoelétrico 
empregando-se a cromatografia cuja fase estacionária contém trocadores iônicos 
positivos ou negativos? Especifique as condições 
 
4- As proteínas na forma nativa A, B e C possuem massas moleculares 15, 35 e 100 
KD foram submetidas à cromatografia de filtração em gel com as fases 
estacionárias, P-30, P-200 e G-100. Considerando essas informações e dados de 
especificações técnicas das resinas citadas, esboce os perfis cromatográficos 
esperados para as três especificações de fase estacionária. 
P30 (2500 – 40000) 
G100 (4000 – 150000) 
P200 (30000 – 200000) 
 
 
 
5- Como seria possível separar os peptídeos Pro-Val-His, Val-Pro-Gly e 
 
Ser-Ile-Val. 
 
Proponha o método predizendo a sequência em que serão deslocados do sistema 
de separação. 
 
6- Discorra sobre os diferentes tipos de resinas de troca iônica, explicitando as 
vantagens e limitações e a faixa de pH que pode ser utilizada. 
2
 
 
 
 
5 GD de Bioquímica 
Aminoácidos e Peptídeos- Métodos Bioquímicos 
1-
 
 
2- O trocador iônico Q-sepharose é um trocador aniônico onde a carga da sua resina é positiva e se 
liga em moléculas que possuem carga liquida negativa. No entanto, os três peptídeos em pH neutro 
possuem carga liquida positiva devido a presença de Histidina acompanhada de aminoácidos que 
possuem radicais sem carga. Devido a isso, nenhum peptídeo se ligaria a coluna nessas condições. 
Portanto para separar esses peptídeos seria necessário a modificação da carga liquida visando torna-los 
negativos. Para que isso ocorre seria necessário o ajuste do pH do meio para básico 0,5-1,5 unidades de 
pH acima do pH do ponto isoelétrico do peptídeo Val-Arg-His-Cys que é o que possui maior ponto 
isoelétrico dos 3. E então fazer um gradiente decrescente de pH para ir desligando da coluna os peptídeos 
separando-os. 
 
. 3-Sabendo que de acordo com o pH do meio, os peptídeos podem apresentar carga liquida positiva, 
negativa ou neutra. É possível também separar os peptídeos de acordo com a diferença do seu ponto 
isoelétrico (onde o peptídeo se torna sem carga). Se for utilizado trocadores aniônicos visando a ligação de 
peptídeos de carga negativa será necessário um ajuste no pH do meio para 0,5-1,5 unidades de pH acima 
do pH do ponto isoelétrico do peptídeo. Caso seja utilizado um trocador de cátions visando a ligação de 
peptídeos de carga positiva será necessário um ajuste do pH do meio para 0,5-1,5 unidades de pH abaixo 
do pH do ponto isoelétrico do peptídeo. 
3
 
 
 
 
 
 
4- 
 
 
 
 
 
 
5- Para separar os peptídeos seria necessária uma cromatografia de interação hidrofóbica. Os 
peptídeos com maior grau de hidrofobicidade se ligarão mais fortemente a matriz hidrofóbica e serão 
eluidos mais tardiamente devido ao seu grau de hidrofobicidade. É possível observar que Val-Pro-Gly 
possui três aminoácidos apolares, Ser-Ile-Val possui dois aminoácidos apolares (Val e Ile) e um 
aminoácido polar sem carga e Pro-Val-His possui dois aminoácidos apolares (Pro e Val) e um aminoácido 
polar com carga. Portanto a sequência em que esses peptídeos serão deslocados do sistema de separação 
hidrofóbico será: Pro-Val-His, depois Ser-Ile-Val e em seguida Val-Pro-Gly. 
 
 
4
 
 
 
 
 
 
6- Existem diferentes tipos de resinas de troca iônica De acordo com os grupos ionizáveis presos às 
estruturas das resinas, elas se classificam em quatro grupos básicos: catiônica fraca, catiônica forte, aniônica 
fraca e aniônica forte. A resina Dowex 1 tem como grupo ionizável (Ø - CH2N+ (CH3)
3 e sendo uma resina 
de poliestireno fortemente básica utilizada para trocar aniônicas. A resina Dowex 50 tem como grupo 
ionizável (Ø-SO3–H) também uma resina de poliestireno fortemente ácida utilizada para trocas catiônicas. 
A resina DEAE-celulose tem como grupo ionizável Dietilaminoetil CH2CH2N+ (C2H5)
2 é uma resina 
carregada positivamente utilizada no fracionamento de proteínas ácidas e neutras. A CM-celulose possui 
um grupo ionizável Carboximetil CH2COOH é ácida e utilizada no fracionamento de proteínas básicas e 
neutras. A DEAE –Sephadex é um gel de dextrano básico que possui como grupo ionizável o 
Dietilaminoetil CH2CH2N+ (C2H5)
2 que tem como vantagem a combinação de gel filtração e troca iônica 
de proteínas ácidas e neutras. O CM – Sephadex tem como grupo ionizável o Carboximetil - CH2COOH e 
é um gel de dextrano ácido que tem como vantagem a combinação de gel filtração e troca iônica de proteínas 
básicas e neutras. 
 
 
5