AULA 3 - PROCESSO DOWNSTREAM

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IVNA MACÊDO DE LEMOS
PRODUÇÃO DE MEDICAMENTOS E COSMÉTICOS
Filtração: É realizada sob pressão
aplicada no meio alimentado afim de
separar o sólido do fluido.
Convencional: Há o depósito
contínuo de células e de meio de
cultura sobre a membrana,
formando uma camada
denominada torta de filtração.
Esta oferece maior resistência à
filtração, que é diretamente
proporcional a compressibilidade
das células e à pressão.
Tangencial: Há a formação de um
gradiente de concentração de
células ou solutos, na direção da
superfície da membrana, o qual
reduz o fluxo no seio da
suspensão. 
Fouling: O estreitamento dos
poros da membrana em
resultado à penetração de
solutos. 
É uma operação unitária
utilizada para a clarificação de
suspensões microbianas. 
Tem baixo consumo de
energia e custo elevado.
Centrifugação: As células suspensas
no meio líquido sedimentam-se
quando há ação de um campo de
gravitacional de um equipamento.
Separação células-líquido:
As células envolvidas apenas por
membranas celulares como células
de animais e hibridomas são frágeis e
facilmente rompidas sob baixas
tensões de cisalhamento. Logo,
requerem pouca energia para o seu
rompimento.
Podem ser rompidas pela
variação da pressão osmótica do
meio, por meio da adição de
detergentes ou pela aplicação de
ultrassom de baixa densidade.
Há células com estrutura de parede
robusta como as células microbianas,
quem tem rompimento difícil.
 As bactérias Gram-positivas possuem
paredes mais rígidas do que as Gram-
negativas, portanto são mais difíceis
de serem rompidas.
As leveduras e outras formas de
fungos são mais difíceis de serem
rompidas, pois possuem paredes
celulares mais rígidas.
Métodos:
mecânicos: homogeneizador de
alta pressão, moinho de bolas,
prensa francesa e ultrassom; 
não mecânicos ou físicos: choque
osmótico, congelamento e
descongelamento, aquecimento,
secagem; 
Rompimento Celular:
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químicos: álcalis, solventes,
detergentes, ácidos;
enzimáticos: lise enzimática ou
inibição da síntese da parede
celular.
Na escolha do processo de
rompimento são considerados
fatores como rendimento,
especificidade, necessidade de
controle de temperatura, custo da
operação unitária e capital investido.
Em um processo de rompimento
celular via lise enzimática, a influência
de variáveis como pH, temperatura,
força iônica, concentração celular e
de enzima devem ser conhecidas.
Lise Celular: Sonicação, Uso de
enzimas, Tensoativos e
Homogeneização.
Filtração e centrifugação para
separar restos celulares.
É uma solução contendo a
biomolécula a ser purificada,
compreendendo a redução do teor
de água do meio clarificado obtido,
após a remoção das células. 
Precipitação: Promove-se uma
perturbação química ou física na
solução tal que as proteínas, os
ácidos nucleicos e os pequenos
metabólitos tornem-se insolúveis.
Salting Out: Em soluções aquosas
a precipitação é promovida com
aumento da concentração de sais.
Concentração do Produto:
Diálise: fenômeno de retenção de
substâncias de maior massa
molecular por membranas
semipermeáveis, enquanto
substâncias de menor massa
molecular tem passagem livre.
Ultrafiltração: As membranas
apresentam poros entre 1 e 500
nm, logo permitem aumentar a
concentração de macromoléculas
pela redução do teor de água.
Proteínas: 1 a 20 nm.
Membranas de nanofiltração
apresentam poros menores.
É um método físico-químico de
separação de componentes de uma
mistura.
Pode ser classificada em escala
preparativa ou escala analítica.
Quanto mais interação a biomolécula
tiver com a fase estacionária (sólida)
mais ficará retido, caso tenha maior
interação com a fase móvel (líquida)
mais rapidamente será eluída assim
havendo uma separação.
Troca Iônica:
É simples, tem fácil ampliação de
escala, alta resolução, alta
capacidade de adsorção e é
versátil.
Esse método baseia-se na
competição entre íons de
interesse e contaminantes pelos
grupos carregados da matriz.
Cromatografia:
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As moléculas de proteína
possuem, em sua superfície,
grupos com cargas positivas e
negativas. 
Cargas positivas: histidina,
lisina, arginina e das aminas
terminais. 
Cargas negativas: ácido
aspártico e glutâmico e de
grupos carboxílicos terminais.
Os aminoácidos carregados
positivamente ou negativamente
interagem com uma resina de
carga oposta.
Posso alterar o pH e/ou a força
iônica para realizar a eluição de
uma proteína já ligada.
Bioafinidade:
Cromatografia específica para o
meu analito de interesse. 
Exemplos: anticorpo-antígeno,
enzima-inibidor, lectina-glicose.
Baseia-se nas propriedades das
espécies que interagem como a
proteína a ser separada e a fase
estacionária.
Sistema chave-fechadura.
Caso eu "estresse" essa ligação
com alteração de temperatura ou
usando um competidor haverá
eluição.
Vantagens: Alta seletividade e
especificidade (purifica a proteína
em 1000x), reduz o custo global e
tempo.
Exemplos: Uso de imunoafinidade
para purificação do fator VIII
recombinante para tratar
hemofilia; Uso de proteína A que
se liga a porção Fc de anticorpos
IgG; Uso de lectina para purificar
glicoproteínas.
Exclusão Molecular:
Gel filtração: Usa um gel como os
orgânicos de acrilamida, agarose
e dextrana.
Esse gel forma uma matriz
gelificada na fase estacionária.
Baseia-se nos tamanhos e nas
formas das moléculas, na qual as
proteínas pequenas irão interagir
com essa "malha" e as proteínas
grandes irão eluir.
CLAE ou HPLC:
Coluna Empacotada: Melhora a
eficiente do processo.
Vantagens: Tempo reduzido de
análise; Alta resolução; Boa
análise qualitativa; Resultados
quantitativos; Boa detecção;
Versatiblidade; Mecanização.
Desvantagens: Alto custo de
instrumentação; Alto custo de
operação; Falta bom detector
universal; Necessidade de
treinamento e experiência.
Fator VIII de coagulação: sensível.
Separação de insulina, hormônio
do crescimento, citocinas, IL2.
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Fase Reversa: Modifica a
polaridade da resina, na qual
podemos ligar grupamentos de
natureza apolar como octil,
octadecil e fenil.
Para as proteínas a fase C-18 é
considerada muito lipofílica.
Na fase móvel utiliza-se solventes
polares como água, acetonitrila e
metanol.
Eluição Isocrática: Se mantêm o
mesmo solvente.
Eluição por gradiente: A
composição do solvente pode ser
alterada para otimizar seu
processo de separação.
Primeiro passo é acrescentar os
excipientes e esterilizar, assim
teremos uma formulação que poderá
ser liofilizada, garantindo maior
estabilidade as moléculas.
Não pode-se se usar tensoativos
iônicos pois causam desnaturação
das proteínas.
Não pode autoclavar.
Filtração Esterilizante.
Liofilização: Secagem a baixas
temperaturas.
Remoção da água - sublimação.
Adição de crioprotetor, que é uma
açúcar.
Primeira etapa é o congelamento
(-80ºC), em uma película fina
através de centrifugação.
Formulação de Produto:
Segunda etapa consiste na
aplicação de vácuo.
Terceira etapa consiste na
sublimação, onde é aquecido em
torno de 0 ºC.
Vantagens: Secagens a baixa
temperatura que evita hidrolise,
evita oxidação e evita quebra da
molécula, além de gerar um
produto leve e poroso e de fácil
redispersão devido a alta
afinidade com a água.
Desvantagens: Processo lento e
de alto custo.