Microbiologia - Caracterização dos Microrganismos

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Microbiologia 
Caracterização dos microrganismos 
Conceitos 
• Necessária para o estudo adequado dos 
microrganismos – feito através de técnicas de 
isolamento e quantificação das bactérias; 
 
• Exemplo: podemos isolar microrganismos de água 
para verificar se ela está potável – para estar potável 
necessita não apresentar Escherichia coli. Para isso, 
podemos isolar microrganismos da água, do solo, de 
amostras biológicas ou secreções. 
 
Técnicas de quantificação 
• Se baseiam no: 
- Isolamento; 
- Quantificação; e, 
- Identificação dos microrganismos; 
• Para que a caracterização possa ser realizada, é 
necessário que o ambiente laboratorial esteja 
esterilizado; 
 
• No caso de estudo de bactérias patogênicas, é 
necessário o uso de um equipamento chamado de 
“capela de fluxo laminar”, o qual impede que 
indivíduos se contaminem com as bactérias quando 
as manuseiam – necessário o uso de Epis (luvas, 
mascaras, óculos): 
 
• São utilizados muitos meios de cultura para cultivo 
das bactérias, que podem ser sólidos ou líquidos. Mas, 
geralmente, eles necessitam ser esterilizados, esse 
processo ocorre através da autoclave – esteriliza os 
meios de cultura a partir do calor. Os meios de cultura 
sensíveis ao calor não podem ser esterilizados pela 
autoclave e sim por filtros estereológicos; 
 
• Para armazenar as amostras há o uso de tubos de 
ensaio, os quais podem ser de plástico ou de vidro; 
 
• As Placas de Petri são usadas para colocar um meio 
de cultura que irá solidificar, permitindo o semeio de 
bactérias para o cultivo laboratorial; 
 
• As micropipetas medem os volumes de líquidos. 
 
Isolamento dos microrganismos 
• Pode ser feito a partir de técnicas de cultura mista 
ou cultura pura – em placas de Petri e tubos de 
ensaio (cultura mista); 
 
• Cultura mista: quando há o uso de meio de cultura e 
possibilidade de crescimento de microrganismos – 
não é seletivo, permitindo o crescimento de mais de 
um tipo de microrganismo.; 
 
• Cultura pura: crescimento de um tipo especifico de 
microrganismo; 
 
• A estufa irá garantir a temperatura ótima para o 
crescimento das bactérias – cada microrganismo tem 
sua temperatura/tempo de crescimento; 
 
• Uma placa com várias colônias puras de bactérias é 
uma cultura pura com única espécie bacteriana; 
 
• Quando uma amostra tem muitas bactérias, não 
conseguimos verificar as colônias isoladas, o que 
dificulta o processo de quantificação da amostra. 
Assim, é necessário fazer as diluições seriadas; 
 
• Semeadura em meios de cultura puras: 
- Método de esgotamento por meio de estrias 
superficiais; 
- Método de semeadura em superfície (alça de Drigalsky); 
- Método de semeadura puor-plate; 
 
Curva de crescimento 
• Para o crescimento é necessário temperatura, pH e 
nutrição adequados; 
 
• Cada bactéria possui uma curva especifica de 
crescimento; 
 
• Quando semeamos uma bactéria ao meio de cultura, 
ela passa um tempo sem se reproduzir, pois é 
quando ela está se adaptando ao meio – chamado 
de fase lag de crescimento; 
 
• Quando ela se adapta ao meio, ela cresce de uma 
maneira bem rápida – fase log/crescimento 
exponencial; 
 
• Após o rápido período de crescimento, vem uma 
fase estacionada – número que se reproduz = 
número que morre.; 
 
• Por fim, o meio de cultura fica sem nutrientes 
suficientes e as bactérias começam a morrer. 
Conservação 
• Podem ser conservados para estudos posteriores 
por dias ou meses – refrigeradores em temperatura 
de 4 a 10º); 
 
• A conservação pode ser feita a partir do repique, 
que seria a passagem desses microrganismos para 
outro meio de cultura – como a bactéria 
Haemophilus influenza – conservando por períodos 
maiores; 
 
• A conservação em nitrogênio líquido – na 
temperatura de -196º – pode durar anos e necessita 
ser manuseado com muito cuidado, pois o nitrogênio 
queima a pele; 
 
• Freezer: - 70º - também permite um período longo; 
 
• Liofilização: tirar toda água do meio, assim as células 
ficarão em um estado estacionado do seu 
metabolismo – geralmente a amostra fica em forma 
de pó e permite a conservação por longos períodos. 
Microscópio 
• Permite a ampliação para visualização dos 
microrganismos; 
 
• Principais tipos: luminosos e eletrônicos; 
 
• Luminosos: ampliação de 1000-2000 – mostram 
contornos das estruturas; 
 
• Eletrônicos: ampliação de 200.000-400.000 – 
mostram organelas; 
 
• Confocal e por florescência: usa reagentes que 
emitem fluorescência; 
 
• Contraste de fase: permite a visualização do relevo 
as estruturas. 
Preparo de lâminas 
• Técnica da gota pendente – gota da amostra 
espalhada na lâmina; 
 
• Técnica da lâmina e lamínula – gota da amostra 
espalhada na lâmina, com uso de uma pequena 
lâmina, chamada de lamínola, que facilita a fixação da 
amostra. 
Técnicas de coloração 
• Coloração simples: um corante. Exemplo: azul de 
metileno para grânulos metacromáticos de 
Corynebacterium diphtheriae; 
 
• Coloração simples com uso de iodo para verificar 
grânulos de glicogênio; 
 
• Coloração diferencial: coloração álcool acido 
resistente. Usada para identificar micobactérias. Uso 
do corante com carbolfucsina (vermelho) e um 
contraste azul de metileno, permitindo a visualização. 
Coloração de Gram 
• Técnica que permite a divisão das bactérias em 
gram-positivas e gram-negativas; 
 
• Foi descrita em 1884 na Dinamarca por Christian 
Gram; 
 
• Permite a visualização de características 
morfotintoriais das bactérias – morfologia/forma da 
célula, se ela está em forma de arranjo; 
 
• Coloração mais importante do laboratório de 
microbiologia para o cultivo de bactérias; 
 
• Utilização do corante púrpura cristal violeta (corante 
primário) + solução de iodo (fixador de corante 
primário) + álcool/mistura de álcool com acetona 
(agente descolorante) + contra corante/contrastante 
vermelho de safranina; 
 
• O agente descolorante e o contra 
corante/contrastante irão fazer a diferenciação; 
 
• Se a bactéria for gram-positiva ela permanece violeta 
e se for gram-negativa ficará com uma coloração 
rosa; 
 
• Realização de todo processo e visualização apenas 
no final dele; 
 Gram 
+ 
Gram 
- 
Primeiro 
corante 
Violeta 
cristal 
20s Púrpura Púrpura 
Fixador Iodo 60s Púrpura Púrpura 
Descoloração Álcool 
95% 
10-
20s 
Púrpura Sem 
cor 
Contrastante Safranina 20s Púrpura Rosa 
 
• Essa diferenciação da cor se dá através da parede 
celular. Ambas são compostas por peptideoglicano, 
mas possuem espessuras e revestimento externo 
diferentes; 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
• Gram-positiva: camada espessa de peptideoglicano, 
que quando adicionado o iodo e o corante, forma 
uma ligação química muito forte, assim, mesmo 
adicionando o álcool (agente descolorante), ele não é 
capaz de romper a ligação. Por isso a estrutura 
permanece com a coloração violeta; 
 
• Gram-negativa: fina camada de peptideoglicano + 
camada externa de lipopolissacarídeo (formada 
basicamente por lipídios), que quando adicionado o 
primeiro corante, ele não consegue se ligar com o 
peptideoglicano. Ao adicionar o álcool, ele irá arrastar 
os lipídios, permitindo que a fina camada de 
peptideoglicano seja exposta. Com isso, adicionando 
o contra corante/contraste, ele irá se ligar a camada 
exposta de peptideoglicano e apresentará a 
coloração rosa; 
 
 
 Coloração de Giemsa 
• Muito usada para o cultivo de protozoários como 
Toxoplasma gondii, Plasmodium vivas e 
Trichomonas; 
Caracterização dos microrganismos 
• Pode ser feita a partir de características morfológicas 
– uso de microscopia e colorações para observação 
de características morfotintoriais; 
- Diâmetro celular (µm); 
- Comprimento celular (µm); 
- Se possui flagelos e a quantidade; 
- Comprimento do flagelo (µm); 
- Se produz pigmentos solúveis. 
 
• Características nutricionais e de cultivo; 
- Depende do meio de cultura utilizado, pois é nele que 
possui os nutrientes necessários para o crescimento dasbactérias. Sendo assim, é de suma importância a 
temperatura e a luminosidade desse meio. 
 
 
• Características metabólicas; 
- Provocar reações químicas para saber se as bactérias 
respondem de alguma maneira específica. Se a bactéria 
tiver alguma reação ocorre uma mudança de coloração 
no meio, permitindo a sua identificação; 
- Reação de oxidase; 
- Liquefação da gelatina; 
- Hidrólise de amido; 
- Desnitrificação (redução de nitrato a nitrito). 
• Características antigênicas; 
- Cada espécie bacteriana tem na sua superfície um 
antígeno (substancias especificas) e o nosso corpo tem a 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
capacidade de produzir um anticorpo especifico para 
interagir com ele. Esse anticorpo fica no kit, ao inocular 
uma amostra nele, se formar uma coagulação quer dizer 
que a reação foi positiva, ou seja, na sua amostra possui 
aquela bactéria em estudo. 
• Características patogênicas; 
 
• Características genéticas; 
- Isolar o cromossomo (DNA) da bactéria em estudo e 
aplicar uma sonda de DNA, da forma de se for da mesma 
espécie irá haver combinação das fitas, se for de espécies 
diferentes não irá haver combinação; 
- Apenas é feito em última análise, quando os outros 
testes não são suficientes.