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MET. EXP. FÍSICA EM BIOCIÊNCIAS Microscopia Óptica História da microscopia O primeiro microscópio surgiu em 1595, ele tinha somente duas lentes e produzia um aumento máximo de 9x. Uma das lentes ficava na região objetiva, na qual fica em contato com o objeto e outra na região ocular, em que ficava em contato com o observador. Em meados do século XVII, os primeiros microscópios mais elaborados surgiram na Itália, Inglaterra e Holanda– com aumento de até 20x – onde foi possível obter a primeira descrição de uma célula. Com o passar dos anos, ocorreu um desenvolvimento das técnicas que que permitiam a observação do material vivo, principalmente no século XX. O microscópio óptico atual Há dois tipos de microscópios de luz atualmente: o invertido e o convencional. Semelhanças: fonte iluminadora de luz (em cima no invertido e embaixo no convencional), lente condensadora (acima da amostra no invertido e abaixo da amostra no convencional), uma platina/mesa (apoio da amostra/espécime), lentes objetivas (responsável pela formação da imagem) e lentes oculares. OBS: A amostra sempre fica entre a lente objetiva e condensadora. A luz sai da fonte luminosa para a lente condensadora, que condensa a luz em determinado ponto/região pequena. Assim, a luz interage com a amostra e passa para a lente objetiva. Essa lente captura a luz – que sofreu desvios a passar pela amostra – e a projeta na lente ocular ou na câmera. Microscópio comum Microscópio invertido MET. EXP. FÍSICA EM BIOCIÊNCIAS Microscopia Óptica Conceitos físicos básicos Y corresponde à amostra. A lente objetiva gera uma imagem aumentada dessa amostra (Y’). A lente ocular tem como objeto essa imagem gerada pela lente objetiva. A lente ocular gera uma imagem ainda maior (Y’’). Lentes objetivas As lentes objetivas são as mais importantes do microscópio e têm como principais atributos o grau de aumento, o número de abertura (capacidade de adquirir os raios angulares) e o grau de correção para aberrações. Tipos de aberrações Aberração esférica: ocorre devido à uma diferença na convergência para o foco entre os raios que passam pelo centro e periferia da lente. Isso acontece em lentes esféricas, que acabam tendo diferentes focos – antes ou depois de onde deveria ser –. Como consequência, há um desfoque na borda da imagem da amostra no microscópio. Para corrigir, é colocado películas nas lentes objetivas, de modo que atrase uma parte dos raios em relação a outros, sendo possível todos chegarem no mesmo ponto. Aberração cromática: ocorre devido a uma diferença de convergência pro foco de feixes de comprimento de onda menor em relação a outros de comprimento de onda maior. Os diferentes comprimentos de onda podem fazer o mesmo efeito da aberração anterior, focalizando em locais distintos. Como consequência, a amostra parece ter um degradê de cores e também pode ser corrigido. MET. EXP. FÍSICA EM BIOCIÊNCIAS Microscopia Óptica Curvatura de campo: como as lentes são curvas, o plano da imagem é curvo. As amostras são projetadas em um campo de forma distorcida, trazendo um efeito semelhante ao da aberração esférica. Para corrigir essas aberrações, são necessárias lentes objetivas específicas. Lentes acromáticas: correção para aberração cromática. Lentes apocromáticas: correção para aberração cromática e esférica. Lentes planapocromática ou planacromática: correção para curvatura de campo. A planapocromática corrige para os três tipos de aberração e a planacromática apenas não corrige para a aberração esférica. Condensador É uma lente mais recente em nível históricos que coleta a luz da fonte e a concentra em um cone de luz que ilumina a amostra. Também apresenta correções para aberrações (aplanáticos, acromáticos, aplanáticos- acromáticos, Abbe). O condensador possui características e informações muito semelhantes às da lente objetiva, porém funciona de forma inversa. Lentes oculares Podem auxiliar na correção de aberrações residuais, além da possibilidade de apresentarem réguas ou grades de calibração. São capaz de gerar uma imagem ainda maior do objeto. Interação luz e matéria Para entender a formação de uma imagem em um microscópio, é necessário entender como a luz é capaz de interagir com a matéria. Transmissão / Reflexão / Refração Difração / Absorção / Espalhamento Os mais predominantes, além da transmissão, são a refração e a difração. MET. EXP. FÍSICA EM BIOCIÊNCIAS Microscopia Óptica Número de abertura (lentes Objetivas) Quando a luz interage com a amostra no microscópio, a amostra induz um desvio da trajetória do feixe de luz, chamado de difração. Além disso, quando a luz sai do ar para o vidro e, em seguida, para o ar de novo, há também o desvio da trajetória do feixe de luz chamado de refração. Ambos os fenômenos fazem com que o feixe de luz sofra um desvio angular. A capacidade que as objetivas possuem de capturar com maior poder esses feixes de luz angulados está relacionada com seu número de abertura. Quanto maior o número de abertura, maior esse poder. (NA = η senα) A utilização de condensador antes da lente objetiva ajuda a angular mais os raios luminosos que chegam na amostra e, consequentemente, ajudam a aumentar o ângulo dos raios difratados. Com isso, há um aumento da resolução. Conceito de resolução É o limite em que dois objetos pequenos são ainda vistos como objetos separados, sendo usado como uma medida do poder de resolução do microscópio. A imagem de um objeto é a somatória de sucessivos padrões formados no plano imagem, denominados Padrões de Airy. Cada padrão de Airy é relativo a um ponto específico do objeto. Com isso, a resolução de uma imagem é a capacidade de distinguir cada um dos padrões de Airy. A resolução pode ser calculada, segundo Abbe, pela fórmula D = λ/2NA. O D significa o espaço entre duas partículas adjacentes; λ é o comprimento de onda da luz utilizada na iluminação; NA é o número de abertura da lente objetiva. No entanto, foi descoberto o critério de resolvido/não resolvido (critério Rayleigh), o que gerou uma nova fórmula: D = 1.22λ/2(NAobj + NAcond). A constante 1,22 está relacionada a esse novo critério. Quanto mais próximas forem NAobj e NAcond, melhor será a resolução. Além disso, a resolução também depende da distância de trabalho, ou seja, a distância da lente para a amostra. Quanto maior for o número de abertura, menor será a distância de trabalho (pois consegue maior angulação) e, consequentemente, maior a resolução. OBS: Lentes com óleo ajudam na resolução por terem o mesmo grau de refração do vidro. Logo, os feixes de luz não sofrem a refração do ar e, ao passar pela lente – que fica próximo a amostra, é possível obter uma maior angulação. MET. EXP. FÍSICA EM BIOCIÊNCIAS Microscopia Óptica Iluminação de Köhler Foi introduzida em 1893 e é tida hoje como a melhor maneira de se iluminar uma amostra em um microscópio óptico. Esse sistema de iluminação é capaz de controlar a direção e o ângulo do cone de luz que chega na lente objetiva, além de controlar a área do campo iluminado. O experimento: Na frente da trajetória da luz, antes de chegar na lente condensadora, coloca-se um objeto. Esse objeto não pode ser um que barre totalmente a luz – sendo escolhido o diafragma da câmera. Ele vai ser projetado pela lente condensadora no plano da amostra – é necessáriocolocar esse objeto no foco da lente, para ser capaz de projetar a imagem. Quando é possível (a partir de deslocamentos feitos na lente) ter uma imagem projetada de forma clara e delineada, achou-se a posição da lente condensadora para ter uma melhor qualidade de iluminação da imagem. Técnicas de geração de contraste Contraste é a capacidade ou propriedade de um objeto/estrutura em ser diferenciado do fundo – podendo ou não ser inerente ao objeto. Em vários materiais, especialmente os não corados ou vivos, o contraste é tão pobre que o objeto permanece invisível, apesar da capacidade da objetiva em resolver ou separar os detalhes. As principais técnicas de contraste em microscopia óptica são: campo claro, contraste de fase, polarização e contraste interferencial diferencial (ou de Nomarski). Alguns objetos podem absorver a luz total ou parcialmente pela presença de pigmentos, por exemplo. Essa pigmentação pode ser natural ou artificial – quando usamos um corante. Logo, esses objetos tem contraste e podem ser observados pela microscopia de campo claro. No entanto, caso não seja possível corar e/ou fixar a amostra e se o fundo não for preto, o pouco contraste da imagem vai ser dado pela diferença de foco entre as partes do objeto que está sendo visualizado no microscópio. Se for um objeto fino – como as células –, essa falta de contraste é ainda pior. Por isso foi criado a microscopia de contraste de fase. O pensamento do descobrir dessa microscopia, Fritz Zernike, foi: Quando a luz interage com regiões de uma amostra, a amostra é capaz de alterar a fase do feixe de luz em relação àquele feixe que passa fora do objeto, ou seja, os objetos atrasam/defasam a MET. EXP. FÍSICA EM BIOCIÊNCIAS Microscopia Óptica luz. No entanto, os olhos humanos – assim como os filmes fotográficos – são incapazes de detectar essas diferenças de fase, apenas variações de cor e intensidade de luz. Logo, Zernike teve a ideia de transformar variações de fase em varrições de nível de cinza, ou seja, variações de cor e intensidade. Isso foi feito a partir de um anteparo (tipo anel) na frente do condensador – deixando passar apenas uma parte da luz. Somente a parte da luz que passa vai difratar e, consequentemente, alterar a fase, criando uma pequena diferença de fase. Coloca-se, então, uma placa de fase na lente objetiva, de modo a alterar mais abruptamente a fase dos feixes de luz que não interagiram com o objeto. Desse modo, altera-se a fase a ponto de permitir a diferença de intensidade de luz, sendo visível ao olho humano perceber o contraste. Com isso, para a microscopia de contraste de fase é colocado um anel atrás da lente condensadora e outro atrás da lente objetiva. Esses dois anéis precisam estar conjugados/alinhados e é possível se ter contraste positivo ou negativo.
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