Resumo Mét. Exp. de Física em Biociências - Microscopia Óptica

Prévia do material em texto

MET. EXP. FÍSICA EM BIOCIÊNCIAS 
 
Microscopia Óptica 
 
 
 
História da microscopia 
O primeiro microscópio surgiu em 1595, ele 
tinha somente duas lentes e produzia um 
aumento máximo de 9x. Uma das lentes ficava 
na região objetiva, na qual fica em contato 
com o objeto e outra na região ocular, em que 
ficava em contato com o observador. 
 
Em meados do século XVII, os primeiros 
microscópios mais elaborados surgiram na 
Itália, Inglaterra e Holanda– com aumento de 
até 20x – onde foi possível obter a primeira 
descrição de uma célula. 
 
 
Com o passar dos anos, ocorreu um 
desenvolvimento das técnicas que que 
permitiam a observação do material vivo, 
principalmente no século XX. 
 
 
 
 
O microscópio óptico atual 
Há dois tipos de microscópios de luz 
atualmente: o invertido e o convencional. 
Semelhanças: fonte iluminadora de luz (em 
cima no invertido e embaixo no convencional), 
lente condensadora (acima da amostra no 
invertido e abaixo da amostra no 
convencional), uma platina/mesa (apoio da 
amostra/espécime), lentes objetivas 
(responsável pela formação da imagem) e 
lentes oculares. 
OBS: A amostra sempre fica entre a lente 
objetiva e condensadora. 
A luz sai da fonte luminosa para a lente 
condensadora, que condensa a luz em 
determinado ponto/região pequena. Assim, a 
luz interage com a amostra e passa para a 
lente objetiva. Essa lente captura a luz – que 
sofreu desvios a passar pela amostra – e a 
projeta na lente ocular ou na câmera. 
 Microscópio comum 
Microscópio invertido 
MET. EXP. FÍSICA EM BIOCIÊNCIAS 
 
Microscopia Óptica 
 
 
 
Conceitos físicos básicos 
Y corresponde à amostra. A lente objetiva 
gera uma imagem aumentada dessa amostra 
(Y’). A lente ocular tem como objeto essa 
imagem gerada pela lente objetiva. A lente 
ocular gera uma imagem ainda maior (Y’’). 
 
 
Lentes objetivas 
As lentes objetivas são as mais importantes 
do microscópio e têm como principais 
atributos o grau de aumento, o número de 
abertura (capacidade de adquirir os raios 
angulares) e o grau de correção para 
aberrações. 
 
 
Tipos de aberrações 
Aberração esférica: ocorre devido à uma 
diferença na convergência para o foco entre 
os raios que passam pelo centro e periferia 
da lente. 
 
 
 
 
 
Isso acontece em lentes esféricas, que 
acabam tendo diferentes focos – antes ou 
depois de onde deveria ser –. Como 
consequência, há um desfoque na borda da 
imagem da amostra no microscópio. Para 
corrigir, é colocado películas nas lentes 
objetivas, de modo que atrase uma parte dos 
raios em relação a outros, sendo possível 
todos chegarem no mesmo ponto. 
 
Aberração cromática: ocorre devido a uma 
diferença de convergência pro foco de feixes 
de comprimento de onda menor em relação a 
outros de comprimento de onda maior. 
 
Os diferentes comprimentos de onda podem 
fazer o mesmo efeito da aberração anterior, 
focalizando em locais distintos. Como 
consequência, a amostra parece ter um 
degradê de cores e também pode ser 
corrigido. 
 
MET. EXP. FÍSICA EM BIOCIÊNCIAS 
 
Microscopia Óptica 
 
 
 
Curvatura de campo: como as lentes são 
curvas, o plano da imagem é curvo. 
 
As amostras são projetadas em um campo de 
forma distorcida, trazendo um efeito 
semelhante ao da aberração esférica. 
 
Para corrigir essas aberrações, são 
necessárias lentes objetivas específicas. 
Lentes acromáticas: correção para aberração 
cromática. 
Lentes apocromáticas: correção para 
aberração cromática e esférica. 
Lentes planapocromática ou planacromática: 
correção para curvatura de campo. A 
planapocromática corrige para os três tipos 
de aberração e a planacromática apenas não 
corrige para a aberração esférica. 
 
 
Condensador 
É uma lente mais recente em nível históricos 
que coleta a luz da fonte e a concentra em um 
cone de luz que ilumina a amostra. Também 
apresenta correções para aberrações 
 
 
 
 
(aplanáticos, acromáticos, aplanáticos-
acromáticos, Abbe). O condensador possui 
características e informações muito 
semelhantes às da lente objetiva, porém 
funciona de forma inversa. 
 
Lentes oculares 
Podem auxiliar na correção de aberrações 
residuais, além da possibilidade de 
apresentarem réguas ou grades de 
calibração. São capaz de gerar uma imagem 
ainda maior do objeto. 
 
Interação luz e matéria 
Para entender a formação de uma imagem em 
um microscópio, é necessário entender como 
a luz é capaz de interagir com a matéria. 
 
 Transmissão / Reflexão / Refração 
 Difração / Absorção / Espalhamento 
 
Os mais predominantes, além da 
transmissão, são a refração e a difração. 
 
 
 
MET. EXP. FÍSICA EM BIOCIÊNCIAS 
 
Microscopia Óptica 
 
 
 
Número de abertura (lentes Objetivas) 
Quando a luz interage com a amostra no 
microscópio, a amostra induz um desvio da 
trajetória do feixe de luz, chamado de 
difração. Além disso, quando a luz sai do ar 
para o vidro e, em seguida, para o ar de novo, 
há também o desvio da trajetória do feixe de 
luz chamado de refração. Ambos os 
fenômenos fazem com que o feixe de luz sofra 
um desvio angular. 
A capacidade que as objetivas possuem de 
capturar com maior poder esses feixes de luz 
angulados está relacionada com seu número 
de abertura. Quanto maior o número de 
abertura, maior esse poder. (NA = η senα) 
A utilização de condensador antes da lente 
objetiva ajuda a angular mais os raios 
luminosos que chegam na amostra e, 
consequentemente, ajudam a aumentar o 
ângulo dos raios difratados. Com isso, há um 
aumento da resolução. 
 
 
Conceito de resolução 
É o limite em que dois objetos pequenos são 
ainda vistos como objetos separados, sendo 
usado como uma medida do poder de 
resolução do microscópio. 
A imagem de um objeto é a somatória de 
sucessivos padrões formados no plano 
imagem, denominados Padrões de Airy. Cada 
padrão de Airy é relativo a um ponto 
 
 
 
específico do objeto. Com isso, a resolução de 
uma imagem é a capacidade de distinguir 
cada um dos padrões de Airy. 
 
A resolução pode ser calculada, segundo 
Abbe, pela fórmula D = λ/2NA. O D significa o 
espaço entre duas partículas adjacentes; λ é 
o comprimento de onda da luz utilizada na 
iluminação; NA é o número de abertura da 
lente objetiva. 
No entanto, foi descoberto o critério de 
resolvido/não resolvido (critério Rayleigh), o 
que gerou uma nova fórmula: D = 
1.22λ/2(NAobj + NAcond). A constante 1,22 
está relacionada a esse novo critério. Quanto 
mais próximas forem NAobj e NAcond, 
melhor será a resolução. 
 
Além disso, a resolução também depende da 
distância de trabalho, ou seja, a distância da 
lente para a amostra. Quanto maior for o 
número de abertura, menor será a distância 
de trabalho (pois consegue maior angulação) 
e, consequentemente, maior a resolução. 
OBS: Lentes com óleo ajudam na resolução 
por terem o mesmo grau de refração do vidro. 
Logo, os feixes de luz não sofrem a refração 
do ar e, ao passar pela lente – que fica 
próximo a amostra, é possível obter uma 
maior angulação. 
 
MET. EXP. FÍSICA EM BIOCIÊNCIAS 
 
Microscopia Óptica 
 
 
 
Iluminação de Köhler 
Foi introduzida em 1893 e é tida hoje como a 
melhor maneira de se iluminar uma amostra 
em um microscópio óptico. 
Esse sistema de iluminação é capaz de 
controlar a direção e o ângulo do cone de luz 
que chega na lente objetiva, além de controlar 
a área do campo iluminado. 
O experimento: Na frente da trajetória da luz, 
antes de chegar na lente condensadora, 
coloca-se um objeto. Esse objeto não pode 
ser um que barre totalmente a luz – sendo 
escolhido o diafragma da câmera. Ele vai ser 
projetado pela lente condensadora no plano 
da amostra – é necessáriocolocar esse 
objeto no foco da lente, para ser capaz de 
projetar a imagem. Quando é possível (a 
partir de deslocamentos feitos na lente) ter 
uma imagem projetada de forma clara e 
delineada, achou-se a posição da lente 
condensadora para ter uma melhor qualidade 
de iluminação da imagem. 
 
 
 
 
Técnicas de geração de contraste 
Contraste é a capacidade ou propriedade de 
um objeto/estrutura em ser diferenciado do 
fundo – podendo ou não ser inerente ao 
objeto. Em vários materiais, especialmente os 
não corados ou vivos, o contraste é tão pobre 
que o objeto permanece invisível, apesar da 
capacidade da objetiva em resolver ou 
separar os detalhes. 
As principais técnicas de contraste em 
microscopia óptica são: campo claro, 
contraste de fase, polarização e contraste 
interferencial diferencial (ou de Nomarski). 
Alguns objetos podem absorver a luz total ou 
parcialmente pela presença de pigmentos, 
por exemplo. Essa pigmentação pode ser 
natural ou artificial – quando usamos um 
corante. Logo, esses objetos tem contraste e 
podem ser observados pela microscopia de 
campo claro. 
 
No entanto, caso não seja possível corar e/ou 
fixar a amostra e se o fundo não for preto, o 
pouco contraste da imagem vai ser dado pela 
diferença de foco entre as partes do objeto 
que está sendo visualizado no microscópio. 
Se for um objeto fino – como as células –, 
essa falta de contraste é ainda pior. Por isso 
foi criado a microscopia de contraste de fase. 
O pensamento do descobrir dessa 
microscopia, Fritz Zernike, foi: Quando a luz 
interage com regiões de uma amostra, a 
amostra é capaz de alterar a fase do feixe de 
luz em relação àquele feixe que passa fora do 
objeto, ou seja, os objetos atrasam/defasam a 
MET. EXP. FÍSICA EM BIOCIÊNCIAS 
 
Microscopia Óptica 
 
 
 
luz. No entanto, os olhos humanos – assim 
como os filmes fotográficos – são incapazes 
de detectar essas diferenças de fase, apenas 
variações de cor e intensidade de luz. 
Logo, Zernike teve a ideia de transformar 
variações de fase em varrições de nível de 
cinza, ou seja, variações de cor e intensidade. 
Isso foi feito a partir de um anteparo (tipo 
anel) na frente do condensador – deixando 
passar apenas uma parte da luz. Somente a 
parte da luz que passa vai difratar e, 
consequentemente, alterar a fase, criando 
uma pequena diferença de fase. Coloca-se, 
então, uma placa de fase na lente objetiva, de 
modo a alterar mais abruptamente a fase dos 
feixes de luz que não interagiram com o 
objeto. Desse modo, altera-se a fase a ponto 
de permitir a diferença de intensidade de luz, 
sendo visível ao olho humano perceber o 
contraste. 
Com isso, para a microscopia de contraste de 
fase é colocado um anel atrás da lente 
condensadora e outro atrás da lente objetiva. 
Esses dois anéis precisam estar 
conjugados/alinhados e é possível se ter 
contraste positivo ou negativo.