Aula-1-1o-Sem_Estatistica_2020_parte-3

Prévia do material em texto

Aula 1 – Introdução a Química Analítica Instrumental 
Parte 3 - Calibração 
Prof. Julio C. J. Silva 
Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF) 
Instituto de Ciências Exatas 
Depto. de Química 
Juiz de Fora, 1o Semestre, 2020 
QUI 093 – Métodos Instrumentais de Análise 
Padronização e Calibração 
 
 
• Métodos absolutos ??? 
 
• Métodos relativos ??? 
https://ipemsp.files.wordpress.com/2010/05/tira-taxi.jpg 
 
Métodos de Calibração 
 
Gráficos De Calibração Em Análise Instrumental 
“Calibração é um conjunto de operações que estabelece, sob condições 
especificadas, a relação entre valores indicados por um instrumento 
de medição ou sistema de medição ou valores representados por uma 
medida materializada ou um material de referência, e os valores 
correspondentes estabelecidos por padrões” 
 
 
 
ANVISA - Guia para Qualidade em Química Analítica: Uma 
Assistência a Acreditação – ANVISA, 1.ed. – Brasília, 2004. 
Resposta x concentração 
 
Determinação da Concentração 
Determinação da Concentração 
Correlação e Regressão 
• Em análise instrumental normalmente é necessário calibrar o instrumento 
 
• A maneira usual para realizar calibração é submeter porções conhecidas da 
quantidade (p. ex. usando-se um padrão de medida ou material de referência) ao 
processo de medição e monitorar a resposta da medição 
 
• Curva de calibração  gráfico da resposta do instrumento (eixo y) em relação a 
concentração dos padrões (eixo x) 
 
• Curva e amostra desconhecida devem estar nas mesmas condições experimentais 
para que a concentração da amostra desconhecida seja determinado por 
interpolação gráfica da curva 
 
• Condições a serem verificadas: 
– Encontrar a melhor curva que se ajusta aos pontos 
– Quais são os erros para a inclinação e intercepto da linha? 
– Quais erros para a concentração determinada? 
– O gráfico é linear ou não? 
– Qual é o limite de detecção (LD/LQ)? 
 
Regressão Linear (Métodos dos Mínimos Quadrados) 
• Análise de regressão: estabelecer a melhor reta que passa pelos 
pontos (modelo de regressão) 
 
• Exigências: 
 
1. Relação linear 
 
• Equação da reta (modelo matemático) y = bx + a 
– b = inclinação da reta (slope) 
– a = interseção no eixo x (coeficiente linear) 
– y = variável dependente (resposta [ordenada]) 
– x = variável independente (concentração [abscissa]) 
 
2. O erro em x é considerado desprezível 
 
 
Regressão Linear (métodos dos mínimos quadrados) 
Método dos mínimos quadrados 
 
“Método estatístico de obtenção dos parâmetros de um modelo 
matemático (tal como a equação de uma linha reta) pela minimização da 
soma dos quadrados das diferenças entre os pontos experimentais e os 
pontos previstos pelo modelo” 
 
Parâmetros da equação da reta (modelo matemático) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Resíduos 
(Diferença dos pontos medidos em relação a regressão) 
• Resíduo = yi – (bxi + a) 
 
• Soma dos quadrados dos resíduos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
• Desvio padrão da regressão (Sy/x) 
 
 
 
• Desvio padrão da inclinação (b) 
 
 
 
 
• Desvio padrão da interseção da reta (a) 
 
Erros (desvios padrões) 
Erro na estimativa da concentração (sXo) 
 
• sXo = Desvio padrão dos resultados a partir da curva 
 
• b = Inclinação da curva 
 
• Sy/x = Desvio padrão da regressão 
 
• Yo = resposta de y para a concentração desconhecida (xo) 
 
• m = número de replicatas 
 
• n = número de pontos as curva 
(IC): 
Correlação e Regressão 
• Coeficiente de correlação (r) mede a fração da variação observada em y 
que é explicada pela relação linear : 
 
 
 
 
• Quanto mais próximo r está da unidade, melhor o modelo linear explica as 
variações de y 
Regressão Linear 
(Parâmetros do Método dos Mínimos Quadrados) 
 
Métodos de Calibração 
 
Erros no Coeficiente Angular e no Intercepto 
• Branco - Evitar contaminação de três fontes primárias: 
• Aparelhos (Branco instrumental) 
• Reagentes (Branco de calibração) 
• Laboratório (Branco da amostra) 
• Principais erros sistemáticos no preparo das amostras: 
• Contaminação 
- Ambiente de trabalho (ar) 
- Impurezas nos reagentes 
- Materiais 
• Perdas de elementos 
- Volatilização 
- Adsorção 
• Decomposição incompleta da amostra 
• Amostragem 
• Erros aleatórios derivados da curva 
 
 
Erros na Análise 
 Erros na Análise - Métodos Analíticos 
Solos 
Minério 
Água 
Plantas 
Frutos 
Animais 
Poeira (PTS) 
Insetos 
Clínica 
PM10 
PM2,5 
PM1,0 
 
Balança 
 Erros na Análise - Métodos Analíticos 
1960 – 1 ppm: Pb (gasolina): 1º fio de cabelo branco 
 
 
 
1970 – 1 ppb (composto policíclicos aromáticos): agulha no palheiro 
 
 
 
 
1980 – 1 ppt (dioxina em leite): lente de contato numa praia de 150 Km 
 
 
 
Nobrega, J.A. I Escola de Química UFAM, 2013. 
Erros na Análise 
• Ambiente de trabalho (ar) 
• Teores de alguns elementos no ambiente de trabalho 
 
Erros na Análise - Fontes de contaminação 
• Ambiente de trabalho (ar) 
• Teores de alguns elementos no ambiente de trabalho 
 
Richter, R. Clean Chemistry. Techniques for Modern Laboratories. Monroe, Milestone Press, 2003. 
Erros na Análise - Fontes de contaminação 
Erros na Análise - Fontes de contaminação 
http://www.francodoamaral.med.br/upload/imagens/a20.jpg 
Nobrega, J.A. I Escola de Química UFAM, 2013. 
Erros na Análise - Fontes de contaminação 
“O objetivo da amostragem é coletar uma porção representativa 
para análise, cujo resultado fornecerá uma imagem mais 
próxima do universo estudado” 
 
“Não importando que a amostragem seja simples ou complexa, 
todavia, o analista deve ter a certeza de que a amostra de 
laboratório é representativa do todo antes de realizar a 
análise” 
 
“Frequentemente, a amostragem é a etapa mais difícil e a fonte 
dos maiores erros. A confiabilidade dos resultados finais da 
análise nunca será maior que a confiabilidade da etapa de 
amostragem” 
Erros na Análise - Amostragem 
Erros de Análise - AMOSTRAGEM 
Erros na Análise - Amostragem 
Unidades de 
amostragem 
 
Erros na Análise - Amostragem 
http://www.scielo.br/img/fbpe/rem/v55n3/3a11f1.gif 
Erros na Amostragem - Amostragem 
 
• Os erros aleatórios também podem influenciar a exatidão dos 
resultados obtidos a partir de curvas de calibração. 
 
• Pode-se observar que o desvio padrão (Sx0) na concentração do 
analito, obtido de uma curva de calibração, é mínimo quando a 
resposta (previsão de y0) da amostra se aproxima do valor médio 
(previsão média de y). 
 
• O ponto x(média), y (média) representa o centro da reta de 
regressão. Os pontos próximos desse valor são determinados 
com mais certeza que aqueles mais distantes da região central. 
Erros na Análise - Calibração 
Erros na estimativa da concentração 
Exemplo 1: Na determinação de um fármaco por fluorescência em 
meio ácido foram obtidos os seguintes resultados: 
 
 
 
 
 
a) Calcule o valor de r e a equação da reta; 
b) Considerando que o sinal de uma amostra desconhecida foi de 16,1 
(n = 1), calcule o valor estimado de quinina na amostra; 
c) Calcule os desvios padrões da inclinação e da interseção da reta; 
d) Calcule o erro da concentração Sxo para a concentração de [x] e seu 
IC (95%); 
 
• Resposta: r = 0,9987; b = 48,3; a = 0,24; [x] = 0,328 mg L-1; 
Sb = 1,427; Sa = 0,3496; Sxo =  0,016 e IC(xo) = 0,328  0,05 mg L
-1 
Concentração de quinina (mg L-1) 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 
Valores de fluorescência 0,00 5,20 9,90 15,30 19,10 
Minimização de Erros 
• Separações 
 
• Modificação de matriz e mascaramento 
 
• Diluição e equiparação de Matriz (matrix matching) 
 
• Método das adições de padrão 
 
• Método do padrão interno (PI) 
 
 
Método de determinação da concentração de um analito em solução. 
Pequenas quantidades conhecidas do analito são adicionadas à 
solução da amostra e as leituras do instrumento são registradas 
apósuma ou mais adições. 
 
O método de adição padrão é trabalhoso, mas é especialmente 
importante quando a amostra é muito complexa, quando as 
interações com a matriz são significativas e quando houver 
dificuldade de encontrar um padrão interno adequado ou uma 
matriz isenta da substância de interesse 
MÉTODO DAS ADIÇÕES DE PADRÃO 
[Xi]/([S]f + [X]f) = Ix/Is+x 
 
[X]f = [X]i x (V0/V) 
 
[S]f = [S]i x (Vs/V) 
 
[X]i = conc. do analito na solução inicial 
[X]f = concentração do analito na solução final 
[S]f = concentração do padrão na solução final 
Ix = sinal da solução inicial 
Ix+s = sinal da solução final 
[S]i = concentração do padrão na solução inicial 
Vo = Volume inicial da amostra 
Vs = volume do padrão 
V = Volume total 
 
 
MÉTODO DAS ADIÇÕES DE PADRÃO 
MÉTODO DAS ADIÇÕES DE PADRÃO 
(Adições múltiplas - Método Gráfico) 
y = b.xE + a, y = 0 → xE = - a/b 
 
Cx 
Cx 
Um soro contendo Na+ fornece um sinal de 4,27 mV em uma análise 
de emissão atômica. Então 5,00 mL de uma solução de NaCl 2,08 mol 
L-1 foram adicionados a 95,00 mL de soro. Esse soro contaminado 
fornece um sinal de 7,98 mV. Considerando os dados acima encontre 
a [Na] na amostra de soro. 
 
R: 0,113 mol L-1 
 Exemplo 3 
 
 
 
 
 
R: 17,3 g mL-1 
Exemplo 2 
“Amostra gravimetricamente contaminada” 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Método do Adição e Recuperação (Spike) 
 
Elementos Nível 1 
 
Nível 2 
 
Nível 3 
75
As 87,5 ± 6,7 91,7 ± 6,7 93,8 ± 7,6 
137
Ba 134,1 ± 31,8 117,3 ± 13,4 112,6 ± 7,7 
114
Cd 99,3 ± 6,6 99,3 ± 7,7 100,7 ± 8,3 
59
Co 87,1 ± 7,1 87,8 ± 8,1 89,2 ± 8,3 
52
Cr 87,6 ± 14,0 86,2 ± 11,0 86,3 ± 9,9 
133
Cs 104,6 ± 3,5 104,6 ± 4,2 105,4 ± 4,7 
63
Cu 100,2 ± 8,1 97,8 ± 6,7 97,9 ± 6,8 
69
Ga 97,6 ± 5,3 96,4 ± 5,1 97,3 ± 6,2 
113
In 96,4 ± 7,6 96,5 ± 6,2 98,1 ± 8,1 
7
Li 83,6 ± 9,0 82,6 ± 8,6 83,5 ± 8,2 
60
Ni 89,6 ± 8,4 90,4 ± 8,8 91,5 ± 7,9 
206
Pb 114,6 ± 5,3 113,4 ± 5,1 114,1 ± 5,5 
109
Ag 85,3 ± 31,1 87,2 ± 30,8 88,8 ± 31,1 
86
Sr 91,5 ± 2,5 95,7 ± 5,2 97,8 ± 6,8 
203
Tl 112,2 ± 4,3 112,8 ± 5,0 113,5 ± 5,4 
51
V 79,3 ± 8,1 81,6 ± 8,2 83,3 ± 8,5 
64
Zn 116,2 ± 10,5 101,8 ± 8,2 99,4 ± 5,4 
 
Método do Padrão Interno (PI) 
• No método do padrão interno, uma quantidade conhecida da espécie 
que atua como referência é adicionada a todas as amostras, padrões 
e brancos. Então o sinal de resposta não é aquele do próprio analito, 
mas sim da razão entre o sinal do analito e o da espécie de 
referência. 
 
• É preparada, como de maneira usual, uma curva de calibração na qual 
o eixo y é a razão entre as respostas e o eixo x, a concentração do 
analito nos padrões. 
 
• Adição de quantidade conhecida de elemento nos padrões e na 
amostra 
 
• Corrige variações no sinal analítico devido a mudanças nas condições 
de análise 
 
• O padrão interno deve ser semelhante ao analito para “sofrer” os 
mesmos efeitos ! 
 
 
Método do Padrão Interno (PI) 
Método do Padrão Interno (PI) 
Ax /[ X ] = F x As/[ S ] 
 
Ax = área do sinal do constituinte 
[X] = concentração do constituinte 
As = área do sinal do padrão interno (PI) 
[S] = concentração do padrão interno 
F = Fator de resposta 
 
Exemplo 4: Em um experimento preliminar, uma solução contendo 
0,0837 mol L-1 de X e 0,0666 mol L-1 de S (padrão interno) fornece 
picos com área de Ax = 423 e As = 347. Para analisar a amostra 
desconhecida, 10,0 mL de uma solução de 0,146 mol L-1 de S foram 
adicionados a 10 mL da amostra desconhecida, e a mistura foi 
diluída a 25 mL. A mistura forneceu um cromatograma com Ax = 553 
e As = 582. Encontre [X] na amostra. 
R = 0,143 mol L-1 
Figuras de Mérito 
 
• Validação 
 
– Sensibilidade 
 
– Limites de detecção (LD) e Quantificação (LQ) 
 
– Faixa dinâmica linear 
 
– Adição e recuperação (spike, tendência) 
 
– Precisão 
Sensibilidade 
Sensibilidade da calibração 
• A sensibilidade da calibração reflete o quanto de medida observada 
é aumentada após o acréscimo de uma unidade em concentração da 
espécie de interesse. 
 
• Numericamente, ela é determinada pelo coeficiente angular da curva 
analítica. 
 
Y = bx + a ( b = inclinação = sensibilidade) 
 
• Essa medida não é capaz de informar as diferenças de 
concentrações que podem ser detectadas. 
 
Sensibilidade analítica 
• É definida como a razão entre a inclinação da curva analítica e o 
desvio padrão do sinal analítico em uma determinada concentração. 
 
• Esse parâmetro leva em consideração o ruído presente nos sinais de 
resposta. 
 
• g = b/s (desvio padrão do sinal) 
 
Faixa dinâmica de trabalho (Faixa Linear) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
• LOQ – Limite de Quantificação 
• LOD – Limite de Detecção 
• LOL – Limite de linearidade 
 
 
 
 
 
 
https://www.google.com/url?sa=i&url=https%3A%2F%2Fwww.slideser
ve.com%2Fdieter-spence%2Fcalibration-
methods&psig=AOvVaw1phB7jPFy4KSnwQvl92Zmd&ust=158830285
6170000&source=images&cd=vfe&ved=0CAIQjRxqFwoTCODI6bqXj-
kCFQAAAAAdAAAAABBo 
Limites de Detecção 
Limite de detecção (LD) e Quantificação (LQ): é a menor 
concentração que pode ser distinguida com um certo nível de 
confiança. Toda técnica analítica tem um limite de detecção. 
 
LD = Ybco + K . Sbco  em termos de sinal 
 
LD = limite de detecção (em termos de sinal) 
Ybco = sinal do banco  intercepto (estimativa) 
Sbco = desvio padrão do branco (n= 10 no mínimo)  Sy/x (estimativa) 
 
LD = (K . Sbco) / S  em termos concentração 
 
S = Sensibilidade (coef. angular da curva analítica (b)) 
 
LQ = (10 . Sdbco)/S  em termos concentração 
 
LQ = limite de quantificação 
LQ (INMETRO): usar o primeiro ponto da curva analítica de calibração 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Limites de Detecção (sinal) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
• Um valor de k de 3 corresponde a um nível de confiança de 98% 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Limites de Detecção 
 
• Exemplo 5: Usar os dados do exemplo 2 para calcular o 
LD e o LQ. 
Controle de Qualidade dos Resultados 
(Gráficos de Controle) 
• Um gráfico de controle é um gráfico sequencial de alguma 
característica que é importante na garantia de qualidade. 
 
• O gráfico também mostra os limites estatísticos da variação que são 
permissíveis para a característica que está sendo medida. 
 
 
 
 
•  = média da população 
•  = Desvio padrão da população 
• N = no de replicatas 
• LSC =limite superior de controle 
• LIC = limite inferior de controle 
Controle de Qualidade dos Resultados 
(Gráficos de Controle) 
Ensaio de Proficiência 
• Determinação de Metais em matriz de Água por ICP-MS - PEP 
002/2007 (SENAI-CETIND-BA) 
 
• Resultados – Arsênio (z-scores) 
 
 
Lab/ICP-MS 
Exemplo 6: Construa um gráfico de controle para “Total de óbitos”. 
Considere N = 1. Obs.: no site tem um exercício modelo. 
Validação de métodos (INMETRO) 
• Validação 
– Seletividade 
– Faixa de trabalho (curva analítica) 
– Linearidade (r) 
– Sensibilidade 
– Limite de detecção (LD) 
– Limite de quantificação (LQ) 
– Exatidão (CRM) 
– Teste de hipótese (teste t = 95%) 
– Adição e recuperação (spike, tendência) 
– Precisão 
– Registro de validação 
– Robustez 
– Ensaio interlaboratorial 
– Incerteza de medição 
 
Referências 
-Cadore, S. Notas de aula. IQ, UNICAMP, 2004. 
-Santos, M., Notas de aula. Depto Química, UFJF. 2009 
-D. A. SKOOG, D. M. WEST, F. J. HOLLER e S. R. CROUCH – 
Fundamentos de Química Analitica, 1a ed., Thomson, 2006. 
- Baccan, N., Química Analítica Quantitativa Elementar. 3a Ed. 
Edgard Blucher LTDA 
- James N. Miller & Jane C. Miller. Statistics and Chemometrics for 
Analytical Chemistry, fourth edition. Person Education. 
-ANVISA - Guia para Qualidade em Química Analítica: Uma 
Assistência a Acreditação – ANVISA, 1.ed. – Brasília, 2004. 
- Lowinsohn, D., Notas de aula. Depto. de Química, UFJF. 2009.