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UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO RELATÓRIO DA AULA PRÁTICA BIOQUÍMICA I PROF. DRAULIO COSTA Relatório 2. Aulas 1 e 2 práticas demonstrativas sobre carboidratos. 13 de maio de 2021. Germano Menezes, Helbert Gustavo, Igor Kauã, Isabela Holanda, Jayne Ellen, João Paulo N. I. de Brito. 1. INTRODUÇÃO Carboidratos são substancias compostas principalmente de carbono, hidrogênio e oxigênio. Os carboidratos são conhecidos, também, como glicídios ou açucares e são biomoléculas importantes que formam a base nutricional dos organismos não fotossintéticos. Eles são classificados como: monossacarídeos, que são açucares simples, sendo impossibilitados de se quebrar na digestão, pois são os menores glicídios; dissacarídeos, formados por dois monossacarídeos; oligossacarídeos, é a ligação de até 10 monossacarídeos; polissacarídeos, união demais de 10 monossacarídeos. (ALCÂNTARA, et al, 2015). O amido é uma união de dois polissacarídeos, amilose e a amilopectina. Ele está presente em grande quantidade nas células vegetais, geralmente como um polissacarídeo de reserva, na formula de grânulos insolúveis. Os polissacarídeos que constituem o amido são homopolímeros constituídos por glucose. A amilose contém uma estrutura linear com unidades de glucose que ao serem ligadas a amilopectina apresenta uma cadeia ramificada com ligações glicosídicas. (ALCÂNTARA, et al, 2015). A caracterização de carboidratos é um processo de importância na ciência, pois nos permite identificar a presença dele, assim como também o especificar. O processo de hidrólise é responsável por quebrar macromoléculas importantes em nosso organismo, como no caso dos açucares, permitindo a formação de monossacarídeos como a glicose, que possui uma grande importância no processo de respiração celular. 2. OBJTIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL DA AULA 1 Na primeira aula se teve como objetivos demonstrar a extração e caracterização do amido de batata, identificar o amido como carboidrato e, por fim, evidenciar o amido através de reações de precipitação e coloração. 2.2 OBJETIVO GERAL DA AULA 2 Demonstrar a hidrólise do amido, verificar os diferentes tipos de catálise: por ação de ácido e enzima específica, e verificar através de reações específicas o desaparecimento do amido e o aparecimento de açúcares redutores durante o curso da hidrólise. Além disso, o objetivo também foi elaborar curvas de tempo, tanto para a hidrólise ácida como enzimática, por meio de dosagem de açúcares redutores. 3. PARTE EXPERIMENTAL E MATERIAIS UTILIZADOS 3.1 VIDRARIAS E EQUIPAMENTOS As vidrarias são muito importantes, pois elas facilitam a vida dos pesquisadores. Elas são instrumentos que podem ser fabricados em vidro cristal ou vidro temperado ou plástico. Os equipamentos são usados para adotar medidas de substâncias e analisar reações químicas, (MILOS, 2019). 3.1.1 Béquer É um recipiente muito utilizado em laboratório, são usados em grande parte, para formar reações de soluções, dissolver substâncias sólidas, efetuar reações de precipitação. O mais comumente encontrado em laboratórios são os béqueres feitos de vidro borisilicato, pois estes são mais resistentes ao calor, (MARTINEZ, s/d). Figura 1 – Béquer. Fonte: https://www.dsyslab.com.br/ s/d. 3.1.2 Funil vidro O funil no laboratório é utilizado para realizar filtração e fazer transferências de líquidos, ele pode ser acompanhado com o papel filtro. Existem dois tipos de funil, o liso e o raiado, (LABORQUIMI, s/d). https://www.dsyslab.com.br/ Figura 2 – Funil de vidro. Fonte: www.infoescola.com, 2016. 3.1.3 Tubos de ensaio Recipientes onde ocorrem reações e análises. Pode também ser utilizado para coleta de amostras em pequena quantidade, (QUEVEDO,2016). Figura 3 – Tubo de ensaio. Fonte: www.infoescola.com, 2016. 3.1.4 Suporte para tubos de ensaio Esse suporte tem a finalidade de servir alocar os tubos de ensaio, assim evitando dos mesmo durante a sua utilização, (QUEVEDO,2016). http://www.infoescola.com/ http://www.infoescola.com/ Figura 4 – Estante de tubos de ensaio. Fonte: www.infoescola.com, 2016. 3.1.5 Pipeta A pipeta é utilizada para medir e transferir soluções e líquidos. Existem diversas, porém, as duas mais comuns são a volumétrica e a gradual, (QUEVEDO,2016). Figura 5 – pipeta graduada. Fonte: www.infoescola.com, 2016. 3.1.6 Aquecedor magnético O aquecedor magnético é utilizado para aquecer e agitar soluções, através da utilização de “peixinho” dentro do recipiente que contém a solução a ser agitada, através de campo magnético que centraliza o peixinho no fundo do recipiente, o mesmo realiza movimentos circulares para agitam e uniformizam a solução, (QUEVEDO,2016). http://www.infoescola.com/ http://www.infoescola.com/ Figura 6 – Aquecedor magnético. Fonte: www.infoescola.com, 2016. 3.1.7 Espectrofotômetro O espectrofotômetro, é um aparelho que tem a finalidade de medir o quanto uma substância química absorve a luz, medindo a sua intensidade, (KASVI, 2018). Figura 7 – Espectrofotômetro. Fonte: www.lojabunker.com.br, s/d. 3.1.8 Banho maria O banho maria possui a função de aquecimento de se soluções em temperaturas adequadas par o experimento que será realizado. http://www.infoescola.com/ http://www.lojabunker.com.br/ Figura 8 – Aparelho de laboratório, para o banho maria. Fonte: www.prolab.com.br, s/d. 3.2 EXPERIMENTOS REALIZADOS EM AULA Os experimentos foram feitos de forma remota, divididos em duas partes, extração e caracterização do amido, e hidrólise ácida e enzimática do amido. 3.2.1 Extração e caracterização do amido 3.2.1.1 Reagentes e solventes utilizados • Água destilada; • Água quente; • Solução de amido (obtido pela batata); • Solução de α-naftal; • Ácido sulfúrico concentrado. 3.2.1.2 Extração do amido O procedimento realizado inicialmente foi o de extração do amido. Para isso, foi utilizada uma amostra de batata, que é uma fonte rica em amido e ao ser raspada, ocorre os rompimentos das células que a compõem e dentro dessas células há presença de amiloplastos, onde estão contidos os grânulos de amido. Com o rompimento das células os amiloplastos são liberados para o meio, (BIOQUÍMICA PRÁTICA UFPR, 2020). https://www.youtube.com/channel/UCxHsIoEHNr3uZ0gcSDRgQwA Em seguida, pegou-se um pedaço da batata e raspou para dentro de um béquer. Após isso, foi adicionado aproximadamente 50 mL de água destilada no béquer e o a agitou bastante com o auxílio de um bastão de vidro (isso para liberar os grânulos de amido que estão nas células da batata). Figura 9 – Extração do amido. Fonte: www.youtube.com. 2020. A etapa seguinte foi a filtração do material obtido. Para isso foram utilizados um funil e uma gaze (serviu como papel filtro), que teve como objetivo retirar a parte sólida mais densa da solução. Na solução restante ficaram os grânulos de amido insolúvel em água fria. Então, foi deixado à solução por 10 minutos em repouso para que esses grânulos decantem, para, assim, facilitar a retirada do sobrenadante com o auxílio de outro béquer, ficando somente os grânulos de amido. Figura 10 – Filtração do material obtido. Fonte: www.youtube.com. 2020. http://www.youtube.com/ http://www.youtube.com/ Para transformar os grânulos insolúveis em solúveis, eles foram postos em um béquer de 100 mL, dilui-se eles em 50mL de água fria e 50mL de água quente, que, com a ajuda de uma pipeta, foram adicionados aos poucos sob agitação (constante) de um agitador magnético, que ali foi deixada por alguns minutos, atingindo uma tonalidade perolada. Figura 11 - Adição de água em agitação. Fonte: www.youtube.com. 2020. 3.2.1.3 Reação de Molisch Em um tubo de ensaio foi adicionado 2 mL da soluçãode amido, 3 gotas do reativo de Molisch e 2 mL de H2SO4 concentrado e adicionado pela borda do tubo, deixando o tubo descansando para ocorrer a reação. Figura 12 – Formação da reação de Molisch. Fonte: www.youtube.com. 2020. http://www.youtube.com/ http://www.youtube.com/ 3.2.1.4 Reação de Lugol Em um tubo de ensaio foi inserido 2 mL da solução de amido e 3 gotas da solução de Lugol (I2 + KI). E de forma imediata se obteve o resultado. Também foi realizado um aquecimento do tubo de ensaio no banho maria em uma temperatura de 100°C, e em seguida foi feito um resfriamento do tubo de ensaio com o auxílio de um béquer e uma piseta, até que se voltasse a temperatura ambiente. 3.2.2 Precipitação de polissacarídeos em solução Nos experimentos de precipitação do amido, foi usado 5 mL da solução de amido em 2 tubos de ensaios, em um foi adicionado 5 mL de (NH4)2SH4 saturado e no outro adicionou 5 mL de EtOH. Após agitar os tubos para homogeneizar as soluções, deixou-se em repouso por 10 minutos. Em seguida, filtrou as duas soluções, que passaram pelo teste de Lugol, tanto a parte filtrada quanto a que retido no filtro. Figura 13 – Filtração das soluções. Fonte: www.youtube.com. 2020. 3.2.3 Hidrólise ácido e enzimático do amido 3.2.3.1 Reagentes e solventes utilizados • Solução de glucose; • Água Destilada; • Reativo de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS); http://www.youtube.com/ • Solução de amido; • Solução de HCI concentrado; • Reativo de Lugol. 3.2.3.2 Curva de titulação Para realização desse procedimento foi utilizado soluções de glucose de concentração conhecida, submetidas ao método colorimétrico do DNS. Figura 14 – Curva de calibração. Fonte: www.youtube.com. 2020. Após a realização da curva de calibração, determinou-se a absorbância no espectrofotômetro, que estava calibrado com um comprimento de onda de 540 nm. 3.2.3.3 – Experimento da hidrólise Consistiu em uma análise, onde procurou-se observar o comportamento das hidrólises ácida e enzimática do amido, quando reagem com o reativo de Lugol e com uma concentração de DNS, por um período de 20 minutos. Foi realizado dois procedimentos simultâneos em banho e maria, um para hidrólise ácida e outro para a enzimática. Precisou utilizar, dois aparelhos de banho maria, com temperaturas de 37°C para o processo com enzimas e 100°C para os ácidos. Com antecedência foi posto por 5 minutos, um tubo de ensaio com 5 mL de solução de amido a 1%, em ambos aparelhos. Isso aconteceu para que fosse possível a homogeneização da solução. http://www.youtube.com/ Figura 15 - Parte inicial do experimento de hidrólise. Fonte: www.youtube.com. 2020. Em seguida, no tubo de ensaio aquecido a 37°C, adicionou-se 0,2 mL de saliva diluída em tampão de imidazol com o pH 7,2 (diluição 1:2), assim formando a hidrólise enzimática. E no tubo de ensaio com temperatura de 100°C, foi colocado 0,2 mL de HCl concentrado, formando a hidrólise ácida. Figura 16 – Coleta das alíquotas. Fonte: www.youtube.com. 2020. Após a adição de HCL e uma leve agitação para homogeneização da substância, no seu respectivo tubo de ensaio, imediatamente foi retirado uma amostra de 0,2 mL para um outro http://www.youtube.com/ http://www.youtube.com/ tubo de ensaio e futuramente no mesmo foi adicionado 3 gotas de Lugol (I2+KI), assim realizando o teste de Lugol. Posteriormente, foi retirado mais 0,2 mL da solução, que foi posta em um novo tubo de ensaio para que depois fosse adicionado 1 mL de DNS para a realização do teste. Deste modo, deu início ao tempo zero do experimento de hidrólise ácida. Depois da adição da saliva diluída em tampão imidazol, foi feita uma leve agitação para homogeneização da solução, que em seguida teve uma retirada de uma alíquota de 0,2 mL para um novo tubo de ensaio que, mais tarde, teve um acréscimo de 3 gotas de Lugol (I2+KI) e assim foi realizado o teste de Lugol. Em seguida, foi retirada uma nova porção de 0,2 mL para um novo tubo de ensaio que, mais à frente, teve um adicionamento de 1 mL de DNS, então foi feito o seu respectivo teste. Desta forma, deu início ao tempo zero do experimento de hidrólise enzimática do amido. Após o tempo de 5 minutos, o mesmo procedimento foi realizado novamente em novos tubos de ensaios, em ambos experimentos, que teve um processo contínuo, até o tempo de 20 minutos, dando a conclusão dessa parte do experimento. Figura 17 – Coleta das amostras no tempo de 5 minutos. Fonte: www.youtube.com. 2020. http://www.youtube.com/ Figura 18 – Coleta das amostras no tempo 10 minutos. Fonte: www.youtube.com. 2020. Figura 19 – Coleta das amostras do tempo de 15 minutos. Fonte: www.youtube.com. 2020. http://www.youtube.com/ http://www.youtube.com/ Figura 20 – Coleta das amostras do tempo 20 minutos. Fonte: www.youtube.com. 2020. Em seguida, para saber a eficiência do teste de Lugol, tanto em relação a hidrólise ácida como a enzimática do amido, foi adicionado 10 mL de água em todos os tubos que se realizou o teste de Lugol, posteriormente foi feita uma leve agitação em todos os tubos, para homogeneização das soluções. Assim foi possível melhor observar a reação de Lugol. Figura 21 – Adição de água nos testes de Lugol. Fonte: www.youtube.com. 2020. Também, foi realizado a ativação do DNS, que é necessário uma elevação da temperatura. Se adicionou 1,3 mL de água destilada aos tubos de ensaio dos testes do DNS, que em seguida foram colocados em banho maria por 5 minutos, em uma temperatura de 100°C. Depois do passar do tempo, esses respectivos tubos de ensaio foram retirados do banho maria http://www.youtube.com/ http://www.youtube.com/ e tiveram uma adição de 7,5 mL de água, que logo passaram pelo processo de espectrofotometria. Figura 22 - Ativação do DNS. Fonte: www.youtube.com. 2020. Figura 23 – Leitura da absorbância. Fonte: www.youtube.com. 2020. http://www.youtube.com/ http://www.youtube.com/ 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 EXPERIMENTOS DA AULA 1 4.1.1 Reação de Molisch. O primeiro experimento realizado foi o da reação de Molisch. Ao concluir o experimento, percebe-se que entre o H2SO4 e a solução de amido foi formado uma substância de cor púrpura. A reação de Molisch é caracterizada pela capacidade de identificar os carboidratos pela adição de uma ácido forte. Quando um ácido forte entra em contato com um carboidrato em solução, há uma baixa no pH, fazendo com que as ligações dos polissacarídeos sofram hidrólise, que liberam os monossacarídeos e em seguidas são desidratados. Após esse processo é formado hidróxi – metil – furfural, que possui a capacidade de se condensar com o α-naftal, formando um reagente de Molisch, o qua,l ao entrar em contato com outro composto, revelará a presenta de carboidratos pela coloração violeta, (BIOQUÍMICA PRÁTICA UFPR,2020). Desse modo, conclui-se que nessa reação há presença de amido, pois essa característica permite perceber que a reação é positiva. Figura 24 – Reação de Molisch. Fonte: www.youtube.com. 2020. 4.1.2 Reação de Lugol. Já na segunda parte do experimento tivemos a reação de Lugol. Como resultado final, obtivemos uma solução de coloração azul escuro. O reativo de Lugol é uma substância composta por I2 + KI que permite identificar a presença especifica de amido em uma substância. Reagindo com a solução de amido (especificamente a parte do polissacarídeo amilose) que em http://www.youtube.com/ solução apresenta características helicoidal e na presença de 6 ou mais hélices permite que ocorra um alinhamento de mesmo plano das moléculas, ocorrendo por conta da compensação do iodo (I2). Imediatamente, a solução vai apresentar uma cor azul intensa, o que caracteriza a presença do amido, (BIOQUÍMICA PRÁTICA UFPR,2020). Portanto, é possível concluirque há presença de amido ou amilose. Logo após, o tubo de ensaio da reação de Lugol foi aquecido a 100ºC para um novo teste e o resultado mostrou que a solução perdeu a coloração azul intensa. Assim, conclui-se que o amido perdeu sua estrutura helicoidal e liberou as moléculas de iodo. Resfriando novamente o tubo, jogando água em temperatura ambiente, notou-se que o amido retomou sua estrutura helicoidal, capturando novamente as moléculas de iodo, voltando a ter coloração azul escura. Figura 25 – Reação de Lugol. Fonte: www.youtube.com. 2020. 4.1.3 Precipitação das soluções. Foram feitos dois testes para a precipitação do amido e em ambos ocorreu a precipitação. Posteriormente a filtração e a adição do reativo de Lugol, a solução dos tubos de ensaio, apresentava uma coloração alaranjada, o que caracteriza a não presença de amido em solução. Porém, quando se testou o reativo de Lugol no que foi retido pelos filtros, constatou a presença de amido em ambos. http://www.youtube.com/ Figura 26 – Reação de Lugol no material retido no filtro. Fonte: www.youtube.com. 2020. 4.2 EXPERIMENTO DA AULA 2. 4.2.1 Resultados da curva de calibração. Processo utilizado durante o experimento para determinação de açucares redutores. E os valores encontrados foram expressos nos gráficos abaixo. Gráfico 1 –Absorbâncias encontradas. Fonte: Acervo pessoal, 2021. 0 0,107 0,263 0,58 1,129 1,315 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Absorbância http://www.youtube.com/ Gráfico 2 - Curva de calibração. Fonte: www.youtube.com. 2020. 4.2.2 Resultados dos processos de hidrólise. Em relação ao reativo de Lugol, percebeu-se que, chegando ao final das etapas, pode-se observar que a medida em que o tempo de hidrólise foi passando, a coloração da reação do Lugol foi diminuindo, tanto para a hidrólise ácida quanto para a enzimática, revelando que no começo havia mais amido que no final. Para descobrir o que acontece em relação à presença de açúcares redutores foi feito o teste do DNS. Os resultados mostraram que, conforme o tempo da hidrólise vai passando, as colorações das soluções vão se intensificando e a intensidade da reação do DNS vai aumentando, ou seja, aumenta a concentração de açúcares redutores na solução. O gráfico abaixo representa os resultados obtidos, deixando claro que a intensidade da cor do Lugol diminui ao longo do tempo de reação em detrimento do aumento da intensidade da cor observado para a reação do DNS. http://www.youtube.com/ Gráfico 3 – Intensidade da hidrólise/tempo Fonte: www.youtube.com. 2020. 4.2.3 Absorbância das soluções do DNS. Através das absorbâncias encontradas pelas reações do DNS e pela equação da curva de calibração, foi possível encontrar a concentração de açucares redutores presentes. Gráfico 4 – Produção de açucares redutores. Fonte: www.youtube.com. 2020. http://www.youtube.com/ http://www.youtube.com/ 5. CONCLUSÃO. Foi possível concluir que, a partir do que se foi evidenciado durante as aulas, o amido possui características de dois polissacarídeos. O experimento com os fragmentos de batata misturados com água destilada e obtendo, por fim, uma solução opalescente (coloração da reação), foi de extrema importância para que pudesse ser observado a comprovação de que o amido é encontrado em grânulos nos vegetais. Também foi possível compreender formas de identificar os carboidratos, sendo eles de aspectos específicos para o amido, utilizando a reação de Lugol e, de forma geral, a reação de Molisch. Tais aspectos também foram importantes para a equipe ao observarmos os resultados das hidrólises ácidas e enzimáticas do amido, pois foi possível notar os comportamentos das reações com o passar do tempo e como isso pode afetá- las. REFERÊNCIAS ALCÂNTARA, et al. Elaboração e utilização de um aplicativo como ferramenta no ensino de Bioquímica: carboidratos, lipídios, proteínas e ácidos nucleicos. Revista de Ensino de Bioquímica, v. 13, n. 3, p. 54-72, 2015. Aula #10 – Extração e Caracterização do Amido. BIOQUÍMICA PRÁTICA UFPR. Disponível em: https://www.youtube.com/watch?v=3uWhsz6NDUg. Acesso em: 13 de maio, 2021. Aula #11 - Hidrólise Ácida e Enzimática do Amido. BIOQUÍMICA PRÁTICA UFPR. Disponível em: https://www.youtube.com/watch?v=qLu4h10mEdM&t=413s. Acesso em: 13 de maio, 2021. MARTINEZ, Marina. Béquer. Disponível em: https://www.infoescola.com/materiais-de- laboratorio/bequer/. Acesso em: 13 de maio, 2021. MILOS, Luan. Qual é a importância das vidrarias e reagentes em laboratório de biologia? Disponível em: https://brainly.com.br/tarefa/20790503#:~:text=As%20vidrarias%20s%C3%A3o%20muito% 20importantes,subst%C3%A2ncias%20e%20analisar%20rea%C3%A7%C3%B5es%20qu%C 3%ADmicas. Acesso em: 13 de maio, 2021. LAMBOQUI. Funil analítico. Disponível em: https://www.laborquimi.com.br/funil- analitico#:~:text=O%20funil%20anal%C3%ADtico%20%C3%A9%20utilizado,como%20estr iado%20o%20funil%20raiado. Acesso em: 13 de maio, 2021 QUEVEDO, Renata Tomaz. Materiais e equipamentos de laboratório. Disponível em: https://www.infoescola.com/quimica/material-de-laboratorio/. Acesso em: 13 de maio, 2021. KASVI. Espectrofotometria: Análise da concentração de soluções. Disponível em: https://kasvi.com.br/espectrofotometria-analise-concentracao-solucoes/. Acesso em: 13 de maio, 2021. https://www.youtube.com/watch?v=3uWhsz6NDUg https://www.infoescola.com/materiais-de-laboratorio/bequer/ https://www.infoescola.com/materiais-de-laboratorio/bequer/ https://brainly.com.br/tarefa/20790503#:~:text=As%20vidrarias%20s%C3%A3o%20muito%20importantes,subst%C3%A2ncias%20e%20analisar%20rea%C3%A7%C3%B5es%20qu%C3%ADmicas https://brainly.com.br/tarefa/20790503#:~:text=As%20vidrarias%20s%C3%A3o%20muito%20importantes,subst%C3%A2ncias%20e%20analisar%20rea%C3%A7%C3%B5es%20qu%C3%ADmicas https://brainly.com.br/tarefa/20790503#:~:text=As%20vidrarias%20s%C3%A3o%20muito%20importantes,subst%C3%A2ncias%20e%20analisar%20rea%C3%A7%C3%B5es%20qu%C3%ADmicas https://www.laborquimi.com.br/funil-analitico#:~:text=O%20funil%20anal%C3%ADtico%20%C3%A9%20utilizado,como%20estriado%20o%20funil%20raiado https://www.laborquimi.com.br/funil-analitico#:~:text=O%20funil%20anal%C3%ADtico%20%C3%A9%20utilizado,como%20estriado%20o%20funil%20raiado https://www.laborquimi.com.br/funil-analitico#:~:text=O%20funil%20anal%C3%ADtico%20%C3%A9%20utilizado,como%20estriado%20o%20funil%20raiado https://www.infoescola.com/quimica/material-de-laboratorio/ https://kasvi.com.br/espectrofotometria-analise-concentracao-solucoes/
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