Resumo Mét. Exp. de Física em Biociências - Microscopia Confocal

Prévia do material em texto

MÉT. EXP. DE FÍSICA EM BIOCIÊNCIAS 
 
Microscopia Confocal 
 
 
 
Conceitos básicos 
A microscopia confocal é uma variedade da 
microscopia óptica e um aperfeiçoamento da 
microscopia de fluorescência convencional. 
Como é um tipo de microscopia óptica, há 
fatores importantes como a resolução e a 
importância da abertura numérica das lentes 
e do comprimento de onda que ilumina a 
amostra para calcular essa resolução. E, 
sendo um aperfeiçoamento da microscopia de 
fluorescência, a lente objetiva desempenha, 
também, o papel da lente condensadora – 
possuindo o mesmo NA (número de 
abertura). 
 
Fenômenos ondulatórios 
A luz é uma onda eletromagnética que, 
quando se propaga e encontra certo meio, 
como um obstáculo ou uma superfície que 
separa duas regiões, esta interage com ele, 
gerando alguns comportamentos específicos, 
tais quais a refração e a reflexão. No entanto, 
a luz tem o fenômeno ondulatório de difração 
– que é a propriedade de contornar 
obstáculos. Na difração, quando um feixe de 
luz passa por uma fenda ou encontra um 
objeto, a imagem formada apresenta apenas 
franjas de interferência, isto é, aparecem 
zonas claras e escuras no contorno do objeto. 
 
 
 
 
 
 
O disco de Airy é a representação da imagem 
de um ponto, onde o centro representa a luz 
vinda do objeto (plano focal) e os discos ao 
redor representam a luz difratada pelo objeto. 
Na imagem, é possível ver que as franjas de 
interferência, ou seja, os círculos em volta do 
centro do disco de Airy influenciam 
diretamente na resolução dos pontos da 
imagem. Quanto maior os discos de 
interferência ou maior a luz difratada, menor 
a resolução. 
Padrão de dispersão da luz: As bordas de 
cada PSF (função de espalhamento de luz no 
ponto) correspondem à intensidade da luz 
difratada e o centro corresponde à 
intensidade da luz proveniente do objeto, ou 
seja, do ponto em foco. 
No microscópio, os pontos de luz desfocados 
correspondem à luz que está sendo difratada 
do objeto, não à luz do plano focal. 
 
 
Quanto maior a NA da objetiva, mais intensa é 
a luz proveniente do plano focal, enquanto a 
intensidade da luz difratada é menor e menos 
dispersa, o que influencia diretamente no 
contrate da imagem e, consequentemente, em 
sua resolução. 
Resumindo, o raio do disco de Airy define a 
resolução lateral (ou seja, os eixos “x” e “y”), 
enquanto a amplitude a axial no PSF define a 
profundidade do foco (eixo “z”). Os efeitos da 
difração de luz (luz fora de foco) são mais 
deletérios quanto mais espessas são as 
MÉT. EXP. DE FÍSICA EM BIOCIÊNCIAS 
 
Microscopia Confocal 
 
 
 
amostras, pois mais luz na imagem é 
proveniente de áreas desfocadas em relação 
às áreas em foco. Assim, amostras com mais 
de 1 uM já podem apresentar áreas 
desfocadas e as de 5-10 uM apresentam muita 
luz de fundo (background). Já as amostras 
com 10-20 uM apresentam grande 
espalhamento de luz e significativa perda de 
resolução e, por fim, as de +20uM aparecem 
distorções denominadas de aberrações e 
anomalias. Em amostras com mais de 40um 
de espessura a luz fora de foco se sobrepõe 
a luz em foco, levando a extinção da imagem, 
tornando-a completamente embaçada. 
Para resolver esse problema, foi idealizados 
o conceito e os princípios que definem a 
confocalidade. 
 
Experimento Pinhole 
Foi criado um dispositivo físico que impede 
que fótons oriundos de outros planos na 
amostra – ou seja, fora do plano focal – 
cheguem até a lente objetiva. Esse dispositivo 
é um pequeno disco metálico com um orifício 
no centro – denominado pinhole. O pinhole se 
localiza alinhado com o ponto focal da 
objetiva e instalado na frente do detector da 
imagem (olho humano ou câmera). 
Assim, a luz de um único plano focal incide 
através de uma pequena abertura, o pinhole 
confocal. Os raios de luz provenientes de 
outros planos focais não são corretamente 
alinhados com o pinhole, sendo eliminados da 
imagem. A consequência de uma imagem que 
contém somente a informação de um único 
plano focal é a produção do corte óptico, o que 
evita a necessidade de submeter a amostra a 
processamentos físicos, como o fatiamento 
em micrótomos – o que gera artefatos. O 
corte óptico pelo pinhole também viabiliza a 
observação de amostras frescas ou vivas. 
 
 
 
 
 
Fluorescência 
A fluorescência é um caso da 
fotoluminescência – que é caracterizada pela 
emissão de luz por certas moléculas induzida 
por irradiação luminosa, sejam por 
comprimentos de onda visíveis ou não. A 
fotoluminescência pode ser dividida em duas: 
a fosforescência (a liberação de luz ocorre de 
forma retardada) e a fluorescência (a 
liberação de luz ocorre de forma instantânea). 
Na fluorescência a luz emitida é sempre de 
um comprimento de onda mais longo do que 
a da luz de excitação. Isso se dá porque 
quando uma molécula recebe luz em 
determinado comprimento de onda, uma 
parte dessa energia é absorvida, logo, os 
elétrons saem do estado basal, permanecem 
por determinado tempo no estado excitado e 
depois voltam para o estado basal. O restante 
da energia não absorvida é liberada em forma 
de luz. Portanto, como uma parte da energia 
foi utilizada, a luz emitida terá menos energia 
do que a luz que a excitou. É importante 
relembrar que comprimentos de onda 
menores possuem maior energia e 
comprimento de onda maiores possuem 
menos energia. 
Fluoróforos ou fluorocromos são moléculas 
com propriedades fluorescentes naturais e 
artificiais. Para fluorescer, as moléculas 
apresentam uma série de estruturas de anéis 
aromáticos e muitas ligações duplas, que 
favorecem a ressonância do elétron para que 
esse permaneça algum tempo em estado 
MÉT. EXP. DE FÍSICA EM BIOCIÊNCIAS 
 
Microscopia Confocal 
 
 
 
excitado. O espectro de excitação-emissão é 
característico de cada fluoróforo, ou seja, 
cada molécula possui um perfil de curva de 
excitação-emissão específica, sendo 
necessário conhecer essa curva para 
configurar a aquisição de imagens de 
materiais fluorescentes. 
O objetivo é usar fontes de luz para excitação 
da amostra utilizando comprimentos de onda 
próximos a o do pico da curva de excitação, 
onde terá mais eficiência pois será possível 
excitar a amostra com menos intensidade de 
luz. O mesmo serve para detecção, deve-se 
usar filtros que detectam os comprimentos de 
ondas que estão próximos ao pico da curva de 
emissão dos fluoróforos, onde a emissão será 
mais intensa. Quando não se tem a fonte de 
luz de excitação (filtro de excitação ou laser) 
que pegue o pico da curva, é necessário que o 
comprimento de onda da luz de excitação se 
encontre, pelo menos, dentro da curva de 
excitação – caso contrário, a amostra não 
será excitada. O mesmo ocorre para a 
emissão: o filtro utilizado para receber a luz 
emitida pelos fluoróforos deve englobar pelo 
menos uma parte dos comprimentos de onda 
que estão inseridos na curva – caso contrário, 
nada será detectado. 
Exemplo de fluoróforos: DAPI (marcador de 
núcleo), Eosina, Alexa Fluor (diversos tipos). 
 
Microscópio de Fluorescência 
Uma fonte de luz branca chega ao filtro de 
excitação, por onde passam apenas os 
comprimentos de onda de interesse para 
determinado fluorófomo. A luz que passa pelo 
filtro encontra o espelho dicroico, que reflete 
todos os comprimentos de onda em direção à 
amostra. Essa luz excita o fluorófomo e este 
emite uma luz em um comprimento de onda 
 
 
 
maior, que será captada pela lente objetiva e 
irá passar direto pelo espelho dicroico e 
chegará ao filtro de emissão. Esse filtro 
permite a passagem de comprimentos de 
onda que estejam na faixa do fluorófomo 
específico. Em seguida, essa luz emitida 
chega aos olhos do observador ou de uma 
câmera. 
 
 
Microscopia de fluorescência 
convencional x confocal 
O microscópio de fluorescência convencionalé conhecido como microscópio de campo 
(wide field), pois ilumina todo o campo da 
amostra de uma única vez e recebe a luz 
emitida toda de uma vez. Já o microscópio 
confocal é conhecido como microscópio de 
escaneamento, pois a fluorescência é captada 
ponto a ponto por todo o campo. 
As fontes de luz para a microscopia de 
fluorescência convencional são fontes de luz 
branca de diversos materiais: lâmpadas de 
filamento incandescente de mercúrio ou 
xenônio (são flexíveis, relativamente de baixo 
custo, necessitam de alinhamento; 200 a 300 
horas de vida útil para a luz de mercúrio), 
metal halide com fibra óptica liquida 
(geralmente contém mercúrio, não requer 
alinhamento; 2000h de vida útil) ou LED 
(diversas cores, comprimento de onda de 
excitação restrito, dispensa filtro de 
excitação). 
MÉT. EXP. DE FÍSICA EM BIOCIÊNCIAS 
 
Microscopia Confocal 
 
 
 
Na microscopia confocal, no entanto, a fonte 
de luz é o laser – um instrumento óptico-
eletrônico que emite radiação coerente, em 
um feixe estreito, de baixa convergência e 
com comprimento de onda definido 
(monocromático). O laser dispensa filtro de 
excitação, porém requer controle de 
intensidade (AOTF – Acousto-Optic Tunable 
Filter), pois sua potência é maior do que a da 
luz branca normal. A AOTF é um modulador 
acústico-óptico constituído por um transdutor 
que gera ondas sonoras em um material, 
como vidro (telúrio) ou de quartzo. Desse 
modo, direcionam e controlam a intensidade 
de luz do laser, permitindo realizar uma 
mudança rápida de sintonização para 
diferentes comprimentos de onda. Além 
disso, é possível regular várias linhas de 
lasers simultaneamente – sendo, assim, 
capazes de substituir os filtros de excitação. 
 
 
Microscópio Confocal 
A imagem do microscópio confocal é feita 
pela varredura da amostra pelo feixe de laser. 
Primeiro, o laser percorre um caminho óptico 
perfeitamente alinhado com o eixo óptico da 
objetiva, preenchendo toda parte traseira da 
lente com luz. Dessa forma, a objetiva focaliza 
um volume limitado da amostra. 
Em seguida, dois espelhos rotatórios são 
usados para deslocar o feixe de laser na 
amostra: um para escanear em alta 
velocidade o eixo de “x” (que aparece como 
uma varredura horizontal na tela do 
computador) e outro para escanear, de forma 
um pouco mais lenta, o eixo de “y”. 
 
 
 
A luz do campo focal passa pelo espelho 
dicroico e o filtro de emissão e, por último, 
pelo pinhole do microscópio confocal. Os 
fótons alinhados ao pinhole são detectados 
por um detector de luz muito sensível 
chamado de tubo fotomultiplicador. 
 
O laser é deslocado pelo espelho que faz a 
rotação no eixo “x”, fazendo isso por linha – 
da superior até a inferior –, até o laser “ler” 
todo o campo da amostra. Toda a luz 
proveniente de fora do ponto focal é excluída 
da imagem, ou seja, a imagem é constituída 
apenas de um plano focal. Para adquirir 
imagens de todos os planos focais da amostra 
ao longo da espessura (ou seja, eixo “z”), é 
necessário deslocar a amostra em relação à 
lente objetiva, aproximando ou afastando-a. 
Isso é controlado pelo galvanômetro, que é 
posicionado na plataforma em que a amostra 
se encontra. Ou seja, através do software do 
microscópio, é possível controlar a distância 
da amostra em relação à objetiva e deslocar 
o ponto focal dentro da amostra, obtendo 
cortes ópticos de toda sua espessura. Com as 
imagens de todos os cortes ópticos, é 
possível reconstruir, com a ajuda de um 
software, a imagem 3D da amostra. 
O fotomultiplicador (PMT) é um dispositivo 
eletrônico que converte e amplifica os sinais 
luminosos, ou seja os fótons, em pulsos 
elétricos e transforma em pulsos elétricos 
em sinais digitais. Assim, o sinal analógico 
MÉT. EXP. DE FÍSICA EM BIOCIÊNCIAS 
 
Microscopia Confocal 
 
 
 
detectado é convertido no sinal digital, que 
contém as informação da posição do laser na 
imagem e a intensidade de luz que vem da 
amostra. Essas informações são 
interpretadas e exibidas na tela do 
computador por programas especializados. 
As imagens formadas são do tipo “mapa de 
pixel”, ou seja, cada ponto capturado da 
imagem corresponde a um pixel da imagem 
final. Dessa forma, o número de pontos por 
linha e o número de linhas definem a 
resolução física da imagem digitalizada. Além 
disso, a intensidade de fótons capturada em 
cada posição é plotada no mapa de pixels por 
diferentes tons de cinza, que variam na escala 
de 0 a 255 tons – sendo 0 a cor preta e 255 a 
cor branca. Isso quer dizer que a imagem 
gerada no confocal é sempre em preto e 
branco, porém pode ser colorida como 
desejado pelo usuário do software. 
Os dados obtidos na aquisição das imagens 
são guardados em arquivos do tipo bancos de 
dados e devem ser analisados e trabalhados 
em softwares de tratamento de imagem (a 
extensão depende do software do fabricante). 
Em resumo, a microscopia confocal é uma 
microscopia de fluorescência e de varredura 
a laser. Com ela, é possível criar imagens 
nítidas do objeto, principalmente comparadas 
à de fluorescência convencional. Nela é 
possível excluir da imagem a luz proveniente 
das áreas fora de foco, ou seja, a luz difratada 
com o uso do pinhole. Ao usar o pinhole, 
produz-se cortes ópticos da imagem e é 
possível uma visualização de mais detalhes, 
ou seja, uma maior resolução. Além disso, é 
viável reconstruir imagem em 3D de 
materiais biológicos fixados ou in vivo, 
diferentemente da microscopia eletrônica. In 
vivo, adquire-se imagens ao longo do tempo 
ao fazer vídeos em forma de time-lapse (4D).