Introdução à Cromatografia

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Princípios 
 É um processo de separação de substâncias químicas 
presentes em uma mistura através de uma coluna que 
retém alguns compostos por mais tempo que os outros. 
 CROMATOGRAFIA 
(Adaptado de Harris – Quantitative Chemical Analysis) 
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Princípios 
 É um processo físico-químico de separação de 
misturas, identificação e quantificação de seus 
componentes. 
 CROMATOGRAFIA 
 O primeiro componente da mistura a sair da coluna é o 
que fica menos absorvido na coluna. 
 O último componente da mistura a atravessar a coluna 
é o que fica mais fortemente absorvido na coluna. 
 Para realizar uma separação cromatográfica, precisa-se 
basicamente de: COLUNA, FASE MÓVEL (FM), FASE 
ESTACIONÁRIA (FE) e um DETECTOR. 
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 É o solvente que se move através da coluna 
 FASE MÓVEL (FM) 
 Pode ser um líquido ou um gás 
 É a substância que fica fixa dentro da coluna. 
 FASE ESTACIONÁRIA (FE) 
 Pode ser um sólido ou um líquido que, em 
geral, está covalentemente ligado às partículas 
do sólido ou às paredes da coluna capilar oca. 
Princípios 
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  A separação ocorre devido a partição do soluto entre a FM 
e a FE. 
 Pensem ... 
Princípios 
 Se eu tenho uma FE polar e uma mistura constituída de 
uma espécie polar e outra apolar, qual das duas eluirá 
primeiro? 
 ELUENTE:  Fluido que entra na coluna. 
 ELUATO:  Fluido que emerge ao final da coluna. 
 ELUIÇÃO:  É o processo de passagem de um líquido ou 
de um gás por uma coluna cromatográfica. 
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(Adaptado de Skoog – Fundamentos de Química Analítica) 
 Respondem ao 
soluto quando 
estes saem da 
coluna 
cromatográfica, 
gerando um 
cromatograma. 
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 Gráfico que mostra a resposta do detector em função do 
tempo de eluição. 
 CROMATOGRAMA 
 Cada pico corresponde a uma substância diferente, 
eluída da coluna. 
Princípios 
 Pensem ... 
 Se o detector for um espectrofotômetro, qual será o sinal 
analítico? 
 E se for um amperímetro? E se for um condutivímetro? E 
se for um Espectrômetro de Massas? 
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 Considere a separação cromatográfica de uma mistura de 
A, B e C, cujo detector seja UV-VIS. Sabe-se que o 
comprimento de onda selecionado é 295 nm e que a ordem 
de eluição é a seguinte: 
 Exemplo 1 
Princípios 
 A = 3 min.  B = 5 min.  C = 10 min. 
 a) Sabendo que εA = 1500 ; εB = 500 e εC = 2000, desenhe o 
perfil do cromatograma. 
 b) Sabendo que εA = 0 ; εB = 500 e εC = 2000, desenhe o 
perfil do cromatograma. 
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 Considere as separações cromatográficas das misturas 
abaixo, cujo detector seja UV-VIS, funcionando em 295 nm e 
a FE uma coluna de caráter polar. Representes os 
respectivos cromatogramas. 
 Exemplo 2 
Princípios 
 a) 
 A: Muito Polar ; εA = 500 
 B: Polar ; εb = 1000 
 C: Apolar ; εc = 2000 
 b) 
 A: Apolar ; εA = 500 
 B: Polar ; εb = 1000 
 C: Muito polar ; εc = 2000 
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 Exemplo 2 – continuação ... 
Princípios 
 c) 
 A: Muito Polar ; εA = 500 
 B: Polar ; εb = 0 
 C: Apolar ; εc = 2000 
 d) 
 A: Apolar ; εA = 500 
 B: Polar ; εb = 1000 
 C: Muito polar ; εc = 2000 
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 Exemplo 2 – continuação ... 
Princípios 
 e) 
 A: Muito Polar ; εA = 500 
 B: Polar ; εb = 0 
 C: Pouco polar ; εc = 2000 
 f) 
 A: Muito apolar ; εA = 500 
 B: Apolar ; εb = 1000 
 C: Muito apolar ; εc = 2000 
 Façam o exercício 2, considerando uma coluna com FE 
com caráter apolar. 
 Exemplo 3 
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  TERMOS COMUNS 
 Considere a separação cromatográfica (CG) de uma 
mistura de octano, nonano e uma espécie desconhecida. 
Para esta separação, empregou-se o metano (CH4) como FM. 
(Adaptado de Harris – Quantitative Chemical Analysis) 
Princípios 
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  TERMOS COMUNS 
 Observa-se na Figura da imagem anterior que cada 
substância sai da coluna em um determinado tempo (TR). 
Princípios 
 Observa-se também que o solvente (FM), também elui 
através da coluna, em um determinado tempo (Tm). 
 É o tempo necessário, a partir da injeção, para que um 
determinado soluto alcance o detector. 
 TEMPO DE RETENÇÃO (Tr) 
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Princípios 
 É o tempo de retenção de um componente não retido 
pela FE, ou tempo de retardamento da FM – (IUPAC). 
 TEMPO MORTO (Tm) ou “VAZIO” 
 Fornece a velocidade da FM, que é igual a velocidade 
média de movimento das moléculas da FM. É um 
importante parâmetro na identificação de picos dos 
analitos. 
 É o tempo adicional necessário para o soluto percorrer o 
comprimento da coluna, além do tempo necessário para o 
solvente, que não sofre retenção, percorrer o mesmo 
caminho. 
 TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO (Tr’) 
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Princípios 
 Considere os seguintes cromatogramas. 
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Princípios 
 Observe que os componentes da mistura não foram 
separados de maneira eficiente. 
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Princípios 
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Princípios 
 Quanto maior a retenção do analito, maior é seu fator de 
capacidade. 
 FATOR DE CAPACIDADE (k ou k’) ou FATOR DE RETENÇÃO 
 Deve ser medido periodicamente para avaliação da 
degradação da coluna. 
 Também chamado de razão de retenção ou razão de 
partição. 
 Quando Kx é próximo de 1, significa que o analito x 
emerge em um tempo próximo ao eluente. 
 Quando Kx é maior que 20 ou 30, significa que o Tr é 
muito longo. 
 Ideal: entre 1 e 5 
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Princípios 
 Exemplo: (Adaptado do concurso para UFMA de 2016) 
 
a) 1,20 b) 2,20 c) 2,50 d) 1,98 e) 3,20 
 Em um cromatograma obtido utilizando a cromatografia 
líquida de alta eficiência, o tempo de retenção (tR) de um 
pico é de 160s e o tempo de retenção de uma amostra que 
não teve interação com a fase estacionária foi de 50s. Qual 
o fator de capacidade (k’)? 
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Princípios 
 Relação entre os tempos ajustados de cada espécie. 
 RETENÇÃO RELATIVA (α) 
 Quanto maior a retenção relativa, maior é a separação 
entre dois componentes. 
 Nesta equação > 
 Então, α será > 1. 
 Como tempo de retenção relativa = tr – tm, podemos 
escrever a expressão acima da seguinte maneira: 
 
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Princípios 
 Ex. 1: Uma mistura de benzeno, tolueno e metano foi 
injetada em um cromatógrafo a gás. O metano produziu um 
pico fino após 42 s, enquanto o benzeno necessitou de 251 
s e o tolueno foi eluído em 333 s. Determine o tempo de 
retenção ajustado, o fator de capacidade e a retenção 
relativa para cada substância. 
(Adaptado de Harris – Análise Química Quantitativa) 
Parâmetro / Analito Benzeno Tolueno 
Tempo de retenção ajustado 209 291 
Fator de Capacidade 4,98 6,93 
Retenção Relativa 1,39 
 RESPOSTAS: 
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Parâmetros Quantitativos 
 A eficiência de uma separação está relacionada, dentre 
diversos fatores, à qualidade da coluna cromatográfica. 
 EFICIÊNCIA DE SEPARAÇÃO 
 Historicamente, a destilação era o meio de separação 
mais poderoso para se separar compostos voláteis. Neste 
sentido, os estudos relacionados à eficiência de separação 
de uma coluna cromatográfica são baseados nos mesmos 
princípios. 
 Considere a coluna de destilação da próxima imagem. 
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Parâmetros Quantitativos 
 Kc = Constante de distribuição 
 [A]FE = Conc. Do analito na FE 
 [A]FM = Conc. Do analito na FM 
 Quanto maior a quantidade de pratos, maior será o 
número de etapas de equilíbrio e melhor será a separação. Uma coluna de destilação era dividida em seções (pratos). 
 Em cada prato, há um equilíbrio entre o líquido e o vapor. 
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Parâmetros Quantitativos 
 EFICIÊNCIA DE SEPARAÇÃO 
 Considera-se que uma 
coluna cromatográfica é 
dividida em seções discretas 
onde o soluto se encontra 
em equilíbrio com a FM e a 
FE. 
 Estas seções discretas são denominadas PRATOS 
TEÓRICOS. 
 A retenção de um determinado composto em uma dada 
coluna pode ser descrita pelo número de Etapas de Equilíbrio 
entre a injeção e a eluição. 
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Parâmetros Quantitativos 
 Quanto maior o número de Etapas de Equilíbrio (MAIOR 
número de pratos teóricos), melhor é a separação, e mais 
ESTREITA será a banda quando o composto emergir. 
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Parâmetros Quantitativos 
(Adaptado de Harris – Quantitative Chemical Analysis) 
 Uma curva ideal deve ter o perfil de uma curva gaussiana. 
 h = altura. 
 Wb = largura da base do triângulo 
 Como uma coluna é dividida em várias seções, dizemos 
que ela possui um número de pratos (N) e um 
comprimento. Assim... 
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 Prato Teórico (N): 
Coluna Cromatográfica 
 ALTURA equivalente a um prato teórico (H) 
 L = comprimento da coluna 
 Quanto maior N (ou menor a H), melhor 
a separação e mais estreito é o pico. 
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Coluna Cromatográfica 
 Exemplo: (Adaptado do concurso para analista – SEGEP/MA de 
2016) 
 
 Em um procedimento analítico utilizando a técnica de 
cromatografia gasosa, um determinado analito apresentou um 
tempo de retenção de 10 minutos e a largura do seu pico na base 
foi igual a 2 minutos, como mostra o cromatograma na figura 
abaixo. 
Com base nesses dados para o referido analito, o número de 
pratos teóricos da coluna é igual a: 
 (A) 50. (B) 100. (C) 200. (D) 400. (E) 500. 
 
Início da injeção 
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Coluna Cromatográfica 
dc df H N 
0,10 0,25 0,081 370370 
0,25 0,25 0,156 192308 
0,32 0,32 0,200 150000 
0,32 0,50 0,228 131579 
0,32 1,00 0,294 102041 
0,32 5,00 0,435 68966 
0,53 1,00 0,426 70423 
0,53 5,00 0,683 43924 
2,16 10% 0,549 3643 
2,16 5% 0,500 4000 
 Capilar, L = 30 m 
 Empacotada, L = 2 m 
 dc = diâmetro da coluna em mm 
 df = espessura da FE em µm 
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 Ex. 1 a): Um soluto, com tempo de retenção de 400 
segundos tem uma largura a meia altura de 8,0 segundos 
em uma coluna de 12,2 m de comprimento. Determine o 
número de pratos e a altura de prato da coluna. 
(Adaptado de Harris – Explorando a Química Analítica) 
Coluna Cromatográfica 
 RESPOSTAS: 
 N = 1,39 x 104 
 H = 8,74 x 10–4 
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 Ex. 1 b): Se o número de pratos é constante e igual a 
13875, qual é a largura de um pico que corresponde a um 
composto eluído em 600 segundos? 
(Adaptado de Harris – Explorando a Química Analítica) 
Coluna Cromatográfica 
 RESPOSTA: 
 Largura a meia altura = 12 seg 
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 Ex. 2: Uma substância, com Tr de 407 s, tem um pico com 
largura de 13 s na base e uma coluna de 12,2 m de 
extensão. Determine o número de pratos e a altura do prato. 
 RESPOSTA: 
 N = 1,57 x 104 e H = 0,78 mm 
Coluna Cromatográfica 
(Adaptado de Harris – Análise Química Quantitativa) 
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 Considere a separação de dois solutos através de uma 
coluna cromatográfica. 
Coluna Cromatográfica 
(Adaptado de Harris – Análise Química Quantitativa) 
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 Parâmetro que avalia a separação dos picos vizinhos 
 RESOLUÇÃO (R) 
Coluna Cromatográfica 
 Tempos de retenção próximos 
 Recomendação em QA: 
 R ≥ 2 
 Para separar bem é necessário uma 
certa diferença nos tr’s. Assim, um 
MAIOR Δ tr implica numa MAIOR 
resolução e, consequentemente, numa 
MENOR sobreposição. 
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 A resolução de uma coluna é uma medida quantitativa da 
sua capacidade de separação de dois analitos “A” e “B”. 
Assim, este parâmetro pode ser também calculado da 
seguinte maneira: 
 RESOLUÇÃO (R) 
Coluna Cromatográfica 
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  Ex. 3: As substâncias A e B têm tempos de retenção de 16,40 min. e 17,63 min., respectivamente, em uma coluna de 
30 cm. Um composto não-retido passa através da coluna em 
1,30 min. As larguras do pico na linha de base para os 
compostos A e B são 1,11 min. e 1,21 min. respectivamente. 
Coluna Cromatográfica 
(Adaptado de Skoog – Princípios de Análise Instrumental 
(exemplo 26,1))  Calcule: 
 a) A resolução da coluna. 
 b) O número médio de pratos na coluna. 
 c) A altura de prato. 
 d) O comprimento da coluna necessário para ter uma 
resolução de 1,5. 
 e) O tempo necessário para eluir a substância B da 
coluna com Rs de 1,5. 
 f) A altura de prato necessário para uma resolução de 
1,5 na coluna original de 30 cm e no tempo original. 
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 A equação descreve a altura do prato em função da 
vazão (u). 
 EQUAÇÃO de van Deemter 
Alargamento das Bandas 
 Caminhos Múltiplos 
 Difusão Longitudinal 
 Tempo de Equilíbrio 
 Estes parâmetros são determinados pela coluna, FE, FM e 
temperatura. 
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Alargamento das Bandas 
 Assim que o soluto entra na coluna, as moléculas tendem 
a se difundir nas extremidades, como se estivessem se 
espalhando. 
 DIFUSÃO LONGITUDINAL 
 É uma tendência natural e inevitável, que se inicia no início 
da coluna. 
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Alargamento das Bandas 
 A passagem do soluto através da coluna é controlada por 
meio da vazão. 
 DIFUSÃO LONGITUDINAL 
 Quanto maior a vazão, menor é o tempo dentro da coluna e 
menor é a difusão. 
 Assim, quanto mais rápido o fluxo (maior frequência 
analítica), mais estreitos os picos se apresentarão. 
 onde u = vazão em mL/min. 
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Alargamento das Bandas 
 Quanto menores as partículas da FE, menor será o 
alargamento frente a este mecanismo. 
 CAMINHOS MÚLTIPLOS 
 Este processo não ocorre em uma coluna capilar. 
(Adaptado de Harris – Quantitative Chemical Analysis) 
 Ocorre em qualquer coluna empacotada com partículas 
sólidas, independentes da vazão. 
 Ao entrar na coluna, o soluto passará por caminhos 
aleatórios. Assim, o soluto sairá em tempos diferentes, 
levando a um alargamento. 
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Alargamento das Bandas 
 O soluto necessita de um tempo finito para alcançar o 
equilíbrio entre as FM e FE. 
 TEMPO DE EQUILÍBRIO 
 Se o equilíbrio é lento, o soluto na FE tende a ficar para 
trás do soluto na FM, provocando o alargamento. 
 Quanto maior a vazão, menor é a zona de alargamento 
através desse mecanismo. 
 Dentro de uma coluna, o soluto está em equilíbrio com as 
duas fases: FE e FM. 
(Adaptado de Harris – Quantitative Chemical Analysis) 
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Alargamento das Bandas 
 TEMPO DE EQUILÍBRIO 
 Ao contrário da difusão longitudinal, o alargamento 
devido à velocidade de equilíbrio é proporcional à vazão (u). 
 OBSERVAÇÕES 
 Vazão  MAIOR alargamento por difusão. 
 Vazão  MAIOR alargamento pela 
velocidade finita de transferência de 
massa (equilíbrio não alcançado). 
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Alargamento das Bandas 
 OBSERVAÇÕES 
 vai ocorrer de qualquer maneira, mas deve ser 
mínimo. 
 Necessita-se então de vazões intermediárias, onde ocorre 
um alargamento mínimo, mas com uma resolução ótima. 
 PRÁTICA 
 Deve-se encontrar uma vazão que atende a análise e sua 
demanda. 
 Escolhe-se uma composição de solvente adequado, que 
permita uma boa separação. 
 Trabalha-se com temperaturas adequadas. 
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Alargamento das Bandas 
 PRÁTICA 
 Cabe lembrarque o equilíbrio entre as fases é obtido 
mais rapidamente com o aumento da temperatura. 
 Uma maior temperatura pode melhorar a resolução 
(equilíbrio alcançado mais rapidamente), permitindo 
uma separação mais rápida, sem a perda de 
resolução. 
 Uma vez que os parâmetros para avaliar a Eficiência de 
uma coluna é a “H”, relaciona-se a altura de pratos (H) com 
os parâmetros de alargamento, da seguinte maneira: 
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Alargamento das Bandas 
 Para cada FM, há uma condição em que H é menor. 
Em todos os casos, a melhor condição ocorre numa 
vazão intermediária. 
(Adaptado de David Harvey – Modern Analytical Chemistry)