Diagnósticos laboratoriais das infecções virais (vias de infecção, coletas e métodos imunológicos) - Virologia Clínica

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Nas últimas décadas, o diagnóstico das 
infecções virais tem emergido como uma importante 
ferramenta na medicina, contribuindo de maneira 
precisa na identificação de patógenos e direcionando 
o seu tratamento. 
 Alerta na Saúde Pública – reconhecimento de 
estirpe com potencial pandêmico 
 Sugerir programa de controle de mosquitos. 
 Determinar a etiologia e curso de uma infecção 
viral; 
 Identificação rápida e precisa de patógenos em 
pacientes imunocomprometidos; 
 Triagem de infecções em bancos de sangue; 
 Diagnosticar doenças congênitas 
 Encefalites – ZIKA. 
 Diferenciar viroses com sintomas semelhantes; 
 Determinar o prognóstico ou a conduta a ser 
tomada com o paciente; 
 Avaliar a eficácia do tratamento antiviral. 
VIAS DE INFECÇÃO 
 Existe diversas portas de entradas para o 
vírus adentrar o nosso organismo. 
 Conjuntiva; 
 Trato digestivo; 
 Pele; 
 Trato respiratório; 
 Trato urogenital. 
 
 
 
 
ESPÉCIMES CLÍNICOS 
Um dos mais importantes fatores para um 
diagnóstico apurado na virologia está relacionado 
com a maneira com que a amostra clínica é 
manuseada. 
 
COLETAS DE ESPÉCIMES 
O tempo da coleta em relação ao 
aparecimento da doença, a quantidade, a qualidade 
do material colhido, o tempo antes de ser processado 
e as condições do transporte para o laboratório são 
importantes variáveis a serem destacadas. 
TECIDOS – BIÓPSIAS 
 Verrugas. 
 Vesículas. 
 
CUIDADOS DOS ESPÉCIMES 
CLÍNICOS – ISOLAMENTO 
 O tempo de colheita em relação ao aparecimento 
da doença: 
 Fase aguda da doença 
 Colher no sítio de replicação viral 
 A qualidade e quantidade do material colhido; 
 Condições de armazenamento e transporte: 
 Amostras em meio de cultura com salina e 
tamponada em pH 7,2 
 Adição de antibiótico e antifúngico 
Amostras 
biológicas
Sangue
Urina
Fezes
Líquidos 
corporais
Tecidos 
(biópsias)
Secreções
FRESCO PARAFINIZADO CONGELADO
diagnóstico laboratorial das infecções virais 
AULA 4 – VIROLOGIA CLÍNICA 
 diagnóstico virológico 
 
 
 
  O tempo antes de ser processado: 
 Imediatamente processado ou mantido 
refrigerado ou em gelo 
 + de 24 h sem processamento → estocar em 
70°C* 
*Comprometimento de alguns vírus (herpes vírus). 
CUIDADOS DOS ESPÉCIMES 
CLÍNICOS – SOROLÓGICO 
 Soro de fase aguda (colhido nos primeiros dias 
da doença) – IgM; 
 Amostras de fase convalescente colhido dentro 
de 2 a 4 semanas. 
 A fase de convalescência é entendida 
como uma fase de transição entre a 
enfermidade e a total recuperação e cura. 
 A amostra pode ser mantida a 4°C 
 as imunoglobulinas são estáveis no soro ou 
plasma. 
 Caso o período de estocagem seja prolongado, o 
material deverá ser mantido a –20°C ou –70°C. 
MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO 
LABORATORIAL 
As técnicas utilizadas no diagnóstico virológico 
podem ser realizadas com base em 4 parâmetros: 
 Isolamento e identificação viral; 
 Sorologia para detecção de antígenos e/ou 
anticorpos; 
 Detecção direta da partícula viral; 
 Amplificação de ácidos nucléicos virais. 
ISOLAMENTO DO VÍRUS: MODELO 
ANIMAL 
 Em desuso para diagnóstico; 
 O uso de camundongos, em geral, está limitado 
ao isolamento de arbovírus e vírus da raiva 
 Realização de exames histopatológicos dos 
órgãos afetados e/ou testes sorológicos para 
a identificação do vírus isolado. 
 Primatas são utilizados apenas para isolamento 
de vírus não cultiváveis em outros hospedeiros. 
 Ex.: Avaliar neurovirulência de algumas 
vacinas, como a Sabin contra a Poliomielite. 
 
 
 
 ISOLAMENTO DO VÍRUS: OVOS 
EMBRIONADOS 
 Os ovos embrionados continuam sendo 
utilizados para isolamento de vírus aviários, FLUV 
e para a produção de alguns tipos de vacinas virais. 
 Várias vias de inoculações podem ser usadas: 
 Influenza – saco amniótico 
 Caxumba – cavidade alantoica 
 Herpes – membrana corioalantóica 
 Também utilizado na produção de Vacinas. 
 
ISOLAMENTO DO VÍRUS: CULTIVO 
CELULAR 
 O uso do cultivo celular para isolamento 
viral teve início após 4 importantes fatos: o emprego 
das técnicas assépticas cirúrgicas; a descoberta dos 
antibióticos; o desenvolvimento de um meio de 
cultura para manutenção de células in vitro e 
técnicas de cultura celular em monocamadas. 
 
 linhagens primárias (20 passagens); 
 linhagens secundárias (100 passagens). 
CULTIVO CELULAR – EFEITO CITOPÁTICO 
(ECP) 
No que diz respeito à observação da 
propagação viral em culturas de células permissivas, 
várias abordagens podem ser realizadas a fim de 
detectar a presença da propagação viral nas células 
inoculadas. 
 Produção de partículas infecciosas para estudos 
posteriores e produção de vacinas e 
metodologias de detecção; 
 Isolamento de vírus previamente desconhecidos. 
 
 
O Efeito Citopático ou CPE se refere a alterações 
na morfologia em células individuais ou grupos de 
células induzidas pela infecção viral, as quais são 
observadas ao microscópio óptico. 
TESTE DE HEMADSORÇÃO: 
 O teste de hemadsorção, que se refere à 
capacidade de hemácias aderirem à superfície de 
células infectadas por certos tipos de vírus, serve 
para detectar a replicação de vírus que expressam 
hemaglutininas (proteínas que se ligam aos 
receptores de ácido siálico na superfície de 
hemácias) na membrana celular. 
No teste de hemadsorção ocorre a interação entre 
o ácido siálico presente na superfície da hemácia e 
a hemaglutinina viral presente na superfície da 
célula infectada. 
TESTE DE HEMAGLUTINAÇÃO 
Certos vírus são capazes de aglutinar 
hemácias de animais de diferentes espécies; esse 
fenômeno é denominado hemaglutinação viral. Os 
vírus se ligam diretamente aos receptores 
constituídos de ácido siálico presentes na superfície 
das hemácias. 
 Positivo: a ligação de partículas virais a estes 
receptores resulta no agrupamento visível dessas 
 
 
 
 
hemácias que se depositam no fundo da placa, 
formando um tapete. 
 
 Negativo: caso não haja a presença de vírus 
hemaglutinante no material pesquisado, as 
hemácias irão depositar-se no fundo da placa em 
forma de botão. 
 
 
A hemaglutinação viral não é uma reação 
sorológica, porque esta não envolve a ligação 
antígeno-anticorpo. A capacidade de hemaglutinar 
é restrita a alguns vírus, sendo importante a espécie 
do animal de origem da hemácia. 
IDENTIFICAÇÃO DO VÍRUS ISOLADO 
 Para a identificação do vírus isolado em 
culturas de células ou ovos embrionados, colhe-se o 
sobrenadante da cultura e líquido alantoico ou 
amniótico dos ovos, para execução de testes 
sorológicos clássicos, tais como teste de 
neutralização, de fixação do complemento ou de 
inibição da hemaglutinação, utilizando-se soros 
padrão contra os vírus pesquisados. 
 ELISA; 
 Imunofluorescência; 
SOROLOGIA PARA DETECÇÃO DE 
ANTÍGENOS 
Os princípios básicos do diagnóstico 
sorológico das infecções virais são os mesmos 
usados em sorologias para outras doenças 
infecciosas. A infecção pela maioria dos 
microrganismos, incluindo vírus, induz a formação 
de anticorpos específicos; estes, quando 
identificados no soro de um indivíduo, produzem 
evidências de que ele foi infectado por um 
determinado agente infeccioso. 
IMUNOFLUORESCÊNCIA 
 A técnica de imunofluorescência utiliza 
anticorpos marcados com corantes fluorescentes 
para revelar a formação de um imunocomplexo 
vírus-anticorpo. 
 Os anticorpos marcados são chamados de 
conjugados; 
 O corante fluorescente usado é o isotiocianato de 
fluoresceína (FITC), o qual produz uma 
fluorescência verde-amarelada. 
 
IMUNOPEROXIDASE 
A reação envolve o uso de anticorpos 
conjugados com a enzima peroxidase. A coloração 
pode ser direta ou indireta. 
 A técnica de imunoperoxidase (IP) requer uma 
etapa adicional, que consiste na adição de um 
substrato; 
 Nas áreas em que o conjugado se liga ao 
imunocomplexo, ocorrerá mudança de coloração 
devido à ação da enzima peroxidase no 
substrato.A preparação é analisada ao 
microscópio óptico. 
 
 
 
 
 
 
IMUNOENZIMÁTICO 
 A reação imunoenzimática é a base para 
muitos testes usados para a identificação de 
antígenos ou a detecção de anticorpos. 
 O sistema envolve anticorpos conjugados com 
enzimas. O resultado do teste é determinado por 
observação (avaliação qualitativa) ou medida 
espectrofotométrica (avaliação quantitativa) da 
mudança de cor, produzida pela ação da enzima 
sobre o seu substrato. 
 
IMMUNOBLOTTING/WESTERN BLOTTING
 Immunoblotting ou Western blotting é um 
imunoensaio em suporte sólido, que utiliza 
antígenos virais imobilizados para detectar 
anticorpos contra proteínas específicas. 
 A técnica é usada principalmente para 
confirmação ou teste suplementar, com o 
objetivo de verificar um resultado obtido em 
outro teste. 
 
DETECÇÃO DIRETA DA PARTÍCULA 
VIRAL 
 Microscopia eletrônica. 
 
AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDOS 
NUCLÉICOS 
 PCR: é uma técnica de amplificação usada para 
sintetizar, in vitro, sequências específicas de 
DNA. 
 RT-PCR: foi desenvolvida com o objetivo de 
automatizar a PCR, tornando-a mais eficiente, 
rápida e segura. Nesse ensaio, é possível 
acompanhar visualmente o progresso da 
amplificação do produto da PCR. 
SOROLOGIA PARA DETECÇÃO DE 
ANTICORPOS 
 O exame sorológico é usado para identificar 
a presença (ou revelar a ausência) de anticorpos 
relacionados a um patógeno no sangue do paciente e 
a presença do próprio patógeno.