Imunodiagnóstico

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Métodos de Imunodiagnóstico 
Introdução 
Os métodos de imunodiagnóstico são essenciais para o 
diagnóstico e acompanhamento de muitas doenças 
infecciosas e autoimunes, mas também são metodologias 
úteis para testes imunocromatográficos como o teste 
rápido na gravidez. O princípio desses testes envolve a 
reação antígeno-anticorpo, destacando-se os princípios: 
● Afinidade: ​capacidade do anticorpo de se ligar a 
um determinado antígeno. Tende a aumentar 
com exposições consecutivas ao patógeno. Um 
anticorpo de baixa afinidade tende a dissociar a 
ligação, o que gera um teste pouco sensível. 
● Avidez: ​é a força pela qual o anticorpo se liga a 
um antígeno, também aumenta no decorrer das 
respostas imunes. 
 
● Especificidade: ​é a chance de aquela ligação 
antígeno-anticorpo representar a confirmação 
daquela determinada doença. Isso porque alguns 
epítopos podem ser semelhantes ou 
compartilhados entre as espécies ou cepas, o que 
pode gerar reações cruzadas e 
‘’falsos-positivos’’ para uma doença. 
 
Objetivos 
Os testes de imunodiagnóstico podem ser utilizados para 
detecção, quantificação e caracterização dos antígenos 
(teste direto) e anticorpos produzidos (indireto/passivo). 
Sempre que se deseja verificar o antígeno, o teste deve 
conter um anticorpo para detectá-lo, ao passo que 
quando se deseja detectar um anticorpo, o teste deve 
fornecer o antígeno. Assim, é importante para verificar a 
dinâmica de produção dos anticorpos, podendo ser 
importantes marcadores para resposta terapêutica e 
prognóstico do paciente. São divididos em de reagentes 
não marcados (reação de precipitação, reação de 
aglutinação, reação de floculação), ou marcados (RIA, 
ELISA, Imunofluorescência e Quimioluminescência). 
Reagentes Não Marcados 
São aqueles em que não há marcação de antígenos ou 
anticorpos, visualizando-se a reação antígeno-anticorpo. 
Reação de precipitação: ​nessa metodologia, utilizam-se 
antígenos e anticorpos solúveis (não carregados por 
moléculas ou células). As técnicas variam e incluem 
reação em gel, em lâmina, em placas e em tubo. Quando 
o antígeno e o anticorpo, reagem, tornam-se insolúveis e 
por isso, se precipitam. A técnica é utilizada por meio de 
colocação de antígenos e anticorpos em locais 
específicos, podendo ser em discos, imunodifusão radial 
ou dupla, observando-se linhas visíveis a olho nu, que 
correspondem à área de precipitação. É útil para detectar 
antígenos (observar doença em atividade) como fator 
reumatóide, ou anticorpos, como anti-Histoplasma. Essa 
técnica é de execução simples e possui baixo custo, 
porém pode levar até 48 horas de incubação. 
 
Reação de aglutinação: ​nesse teste, ou o antígeno ou o 
anticorpo estará aglutinado a uma partícula, como o 
látex ou uma hemácia. Nesse caso, compra-se o antígeno 
ou o anticorpo conjugado e coloca-se o soro do paciente 
para verificar se há ou não aglutinação. Os principais 
usos diretos são a triagem sanguínea (reação de 
hemaglutinação), titulação de proteína C reativa (PCR), 
fator reumatóide, teste de gravidez ou indiretamente para 
o ASLO (anti-estreptolisina O, um anticorpo para esse 
epítopo do ​Streptococcus pyogenes​). Em relação às 
vantagens, é que se trata de um teste simples, acessível, 
de curto período de incubação e que pode facilmente ser 
quantificado pela diluição de antígenos e anticorpos. 
 
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Obs.: os métodos tradicionais de precipitação podem 
não ser quantitativos para os antígenos ou anticorpos, o 
que mostra uma limitação do método. Porém, quando 
se coloca uma quantidade de antígeno/anticorpo 
conhecida nos poços (Método de Mancini), pode-se 
observar até que diluição o resultado é positivo, o que é 
útil para identificar a titulação dos antígenos ou 
anticorpos do paciente, podendo mostrar a intensidade 
da infecção ou da resposta imune do paciente. 
Obs.: a diluição de antígenos ou anticorpos é feita por 
meio da placa de hemaglutinação, em que se coloca uma 
quantidade exponencialmente menor do soro do 
paciente, sendo que quanto maior o título de 
anticorpos/antígenos, maior será a diluição em que 
aquela amostra ainda é positiva. 
Reação de floculação: ​comumente usado para a triagem 
de sífilis, mas não dá diagnóstico da doença. Esse 
exame, também conhecido por VDRL (Veneral Disease 
Research Laboratory- laboratório que patenteou), utiliza 
de antígenos artificiais semelhantes ao patógeno 
(colesterol, lecitina e cardiolipina) para verificar a 
produção de anticorpos, observando-se floculações 
principalmente microscópicos. Como os antígenos não 
são próprios da bactéria, resulta em baixa especificidade, 
tornando-o viável apenas com fito de triagem. Trata-se 
de um exame barato, com boa sensibilidade (quando 
realizado no período de produção dos anticorpos) e 
rápido, porém peca em especificidade e não detecta o 
isotipo do anticorpo (não discrimina entre IgM e IgG). 
 
Reagentes Marcados 
Nesses casos, os reagentes para detecção são marcados, 
quer por enzimas, radioisótopos ou moléculas produtoras 
de luz, o que torna os métodos complexos. 
RIA: ​o rádio imuno ensaio é um teste que detecta 
antígenos ou anticorpos marcados com radioisótopos, 
geralmente iodo ou trítio. Essa técnica possui as 
vantagens de ser um método de baixo custo, com alta 
sensibilidade e tempo curto, porém é muito pouco 
utilizada e pouco prática, uma vez que a manipulação de 
isótopos radioativos exige maiores equipamentos, maior 
fiscalização e cuidados relacionados à biossegurança. 
Nos locais em que é usada, usa-se para detecção do vírus 
da hepatite B, proteínas séricas, drogas e hormônios. 
⇒ Metodologia: ​no teste direto, o soro do paciente é 
colocado em uma placa contendo anticorpos junto ao 
antígeno marcado. Caso o paciente possua o antígeno, 
ele irá competir com os antígenos marcados, de modo 
que a radiação medida será menor. Na metodologia 
indireto, a inversa é verdadeira. 
 
ELISA: ​nesse caso, o reagente comprado é marcado com 
enzimas, quer de forma direta/sanduíche, indireta, ou de 
competição (menos utilizada). É um método muito 
utilizado para o β-HCG e para detecção do antígeno do 
HIV. As principais desvantagens relacionadas são 
relacionadas ao grande custo dos reagentes, que 
inviabiliza seu uso em grande escala. 
⇒ ELISA indireto: ​no ELISA indireto, inicialmente se 
lava a placa para retirar outros possíveis antígenos. 
Coloca-se o soro que, se contiver anticorpos, irá se ligar 
ao antígeno da placa. Posteriormente, lava-se a placa, 
retirando os anticorpos que não se ligaram ao antígeno. 
Usa-se um anticorpo contra aquele anticorpo. Realiza-se 
a lavagem para retirada de anticorpos livres. Por fim, 
adiciona-se o cromógeno que irá realizar iluminação da 
amostra se o anticorpo conjugado estiver presente. O 
espectrofotômetro permite identificar o título de 
anticorpos por meio das qualidades da luz emitida. 
 
⇒ ELISA direto: ​nessa metodologia, coloca-se 
inicialmente o soro do paciente e se acrescenta o 
anticorpo, realiza-se a lavagem e, em seguida, 
observa-se se há formação de luz. Caso não haja luz, 
significa que o anticorpo reagente foi retirado, pois no 
soro do paciente não havia antígenopara que se ligasse. 
 
⇒ ELISA sanduíche: ​no ELISA sanduíche, o reagente 
da placa será um anticorpo, ao qual o antígeno irá se 
ligar, sendo capturado. Caso no soro do paciente não 
haja o antígeno, ele será removido com a lavagem. Após 
isso, adiciona-se o anticorpo conjugado que caso não se 
ligue, sairá com uma nova lavagem. Caso se ligue ao 
antígeno, irá permanecer e reagir com o cromógeno, 
gerando luz. O espectrofotômetro permite quantificar o 
antígeno através das qualidades da luz emitida. 
 
⇒ ELISA competitivo: ​é uma metodologia em que além 
do soro do paciente e do anticorpo marcado, colocam-se 
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Ob2.: se houver excesso de antígeno ou anticorpo, pode 
haver o efeito zona, quando não há positividade de uma 
diluição, pois não há formação de complexos o suficiente 
para aglutinar. Por esse motivo, deve-se continuar a 
diluição, para diferenciar um efeito zona de um negativo. 
 
também antígenos inibidores para se ligar aos anticorpos 
marcados, mas seu uso clínico é menor que os outros. 
Imunofluorescência: ​nesse caso, detecta-se o antígeno ou 
anticorpo por meio da marcação com compostos 
fluorescentes (fluorocromo). Essa técnica também pode 
realizar a detecção direta ou indireta (IFI), dando origem 
também ao princípio da citometria de fluxo, que separa 
as células em populações de acordo com a cor que 
emitem, sendo essa cor um reflexo da molécula que se 
liga a ela. É uma técnica cara e inacessível, mesmo na 
microscopia imunofluorescente, que seria o método mais 
barato (apresentando o ônus de ser apenas qualitativo). 
A quantificação é por verificar até que título de diluição 
há imunofluorescência. As principais aplicações desse 
teste são o FTA-Abs (confirmatório de sífilis), detecção 
de espécies bacterianas, hormônios, parasitos e presença 
de anticorpos anti-DNA (pesquisa do FAN no Lúpus). 
 
⇒ Citometria de fluxo: ​é uma metodologia que tem base 
na imunofluorescência e permite identificar populações 
celulares por meio da densidade e complexidade. As 
células são liberadas uma a uma, passando por um laser 
e refletindo uma luz com características próprias que é 
captada por um detector, o qual, através disso, dará as 
características de complexidade e tamanho celular. Isso 
porque cada população celular é marcada por um 
fluorocromo diferente e por isso gera uma cor diferente, 
que é processada pelo aparelho. É utilizada para isolar 
populações celulares, determinar quantas e quais células 
brancas estão contidas numa amostra, distribuir células 
segundo seu antígeno e determinar seu tamanho, o que é 
útil no diagnóstico de leucemias e acompanhamento do 
HIV (taxas de CD4 e CD8). 
 
Western Blotting: inicialmente as proteínas são atraídas 
por eletroforese em um meio específico, sendo 
estratificadas conforme seu peso. Após isso se utiliza um 
anticorpo luminescente (marcado por isótopo ou que 
realiza reação enzimática) que permite quantificar 
aquela amostra com relação à proteína de interesse 
(antígeno ou anticorpo), por sua luminosidade. É ainda 
inacessível e é utilizada na confirmação do HIV. No 
teste há um controle (GAPDH, B-Actina), para garantir 
que todas as placas estejam com a mesma sensibilidade. 
 
Testes rápidos: ​são ensaios imunocromatográficos que 
podem detectar algum anticorpo no soro, ou antígeno no 
soro, urina, sangue e outros líquidos. É um teste barato, 
rápido e de fácil interpretação em que a proteína de 
interesse se difunde de forma semelhante ao western 
blot, sendo marcada pelo reagente que pode estar 
acoplado com corante ou enzimas. É utilizado para 
triagem gravídica e doenças infecciosas, tendo como 
principal desvantagem que alguns desses testes possuem 
ou baixa sensibilidade ou baixa especificidade e por isso 
dificilmente são suficientes para o diagnóstico.. 
 
Outros métodos 
Nesses métodos, utilizam-se princípios da ligação 
antígeno anticorpo, porém se utilizam também princípios 
biofísicos e bioquímicos. 
Nefelometria: ​consiste na análise dos imunoprecipitados 
utilizando a dispersão da luz. Assim, esse método irá 
detectar e medir a luz que sofre dispersão quando incide 
sobre o complexo antígeno e anticorpo. 
Turbidimetria: ​a turbidez é a diminuição da claridade da 
luz devido à reflexão, dispersão ou absorção dela pelas 
partículas da solução. Assim, o equipamento irá detectar 
a luz que incide, deduzindo a concentração por meio da 
atenuação da luz incidente. Em relação à nefelometria, 
ambas possuem boa sensibilidade e especificidade, 
sendo quantitativas, embora a turbidimetria possa 
utilizar um analisador bioquímico modificado, enquanto 
a nefelometria exige equipamento novo (maior custo). 
Quimioluminescência: ​emprega uma substância que gera 
uma reação química de luminescência que permite a 
detecção daquela reação antígeno-anticorpo. A emissão 
de luz é detectada por um equipamento próprio que 
processa e fornece um resultado. As principais 
vantagens do método são o acesso aleatório, automação, 
rapidez e possibilidade de realizar múltiplos testes, já a 
desvantagem é necessitar de um equipamento caro. 
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Obs.: o controle dos testes rápidos sempre devem estar 
presentes para que o teste seja válido. Naquela região 
há uma placa pronta com antígenos e anticorpos.