CICLO DO ÁCIDO CÍTRICO

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Universidade Estadual do Ceará / Faculdade de Veterinária
Bioquímica Veterinária II
Prof. Dr. Genário Sobreira Santiago
CICLO DO ÁCIDO CÍTRICO
1. INTRODUÇÃO
O ciclo do ácido cítrico (também chamado ciclo de Krebs ou ciclo dos ácidos tricarboxílicos) desempenha diversos papéis no metabolismo. É a via final para onde converge o metabolismo oxidativo de carboidratos, aminoácidos e ácidos graxos, em que seus esqueletos carbonados são convertidos a CO2. Essa oxidação fornece energia para a produção da maior parte do ATP na maioria das células animais, incluindo humanos. 
O ciclo ocorre totalmente na mitocôndria e, portanto, está bastante próximo das reações de transporte de elétrons, que oxidam as coenzimas reduzidas geradas pelo ciclo. O ciclo do ácido cítrico é uma via aeróbia, pois o O2 é necessário como aceptor final dos elétrons. A maior parte das vias catabólicas do organismo converge para o ciclo do ácido cítrico.
Figura 1
Origem do acetil CoA e sua oxidação
Algumas reações, tais como o catabolismo de determinados aminoácidos, produzem intermediários do ciclo e são denominadas reações anapleróticas. O ciclo do ácido cítrico também participa em diversas reações sintéticas importantes. Por exemplo, o ciclo funciona na formação de glicose a partir de esqueletos carbonados de alguns aminoácidos e fornece blocos construtivos para a síntese de alguns aminoácidos e do heme. Portanto, esse ciclo não deve ser visto como um ciclo fechado, mas sim como um ciclo de tráfego, com compostos que entram e saem de acordo com as necessidades do organismo.
O grupo acetila na forma de acetil coenzima A – acetil CoA – é um intermediário comum no metabolismo de quase todos os compostos biológicos, podendo ser formado a partir de carboidratos, lipídeos e aminoácidos. Qualquer que seja a fonte, grande parte dela é oxidada a CO2 e H2O, mas qualquer excesso pode ser utilizado para a biossíntese de ácidos graxos, colesterol e corpos cetônicos, como se pode ver na figura 1.
A figura 2 mostra uma visão geral do ciclo. Ele começa com uma condensação de acetil CoA com oxaloacetato para formar citrato e termina com a regeneração do oxaloacetato. Este atua como transportador para os dois átomos de carbono da acetil- CoA no processo cíclico, sendo regenerado em seu final.
A oxidação completa da acetil-CoA via ciclo de Krebs, produz duas moléculas de CO2. Quatro pares de elétrons são retirados dos substratos e transferidos, via cadeia respiratória, para o oxigênio molecular. Três pares são removidos pelo NAD+ formando três NADH e o par restante é removido por uma flavoproteína formando FADH2. 
	A oxidação dos NADH e do FADH2, pela cadeia respiratória, produz onze moléculas de ATP por fosforilações oxidativas. Uma molécula de GTP é formada a partir de GDP, H3PO4 (Pi) e energia, fornecida pela hidrólise de um intermediário do ciclo rico em energia. Este processo denomina-se fosforilação em nível de substrato para distingui-la da fosforilação oxidativa realizada na cadeia respiratória.
2. REAÇÕES DO CICLO
	No ciclo de Krebs o oxaloacetato é primeiramente condensado ao acetato, e a seguir regenerado, na medida em que o ciclo é completado. Entretanto, essas reações não devem ser encaradas somente como um círculo fechado, e sim como um circulo de trânsito, com compostos entrando e saindo conforme requerido.
Figura 2. Ciclo do ácido cítrico
2.1. Descarboxilação oxidativa do piruvato
		O complexo piruvato desidrogenase é um complexo multienzimático localizado na matriz mitocondrial. Ele converte o piruvato, o produto final da glicólise aeróbica, em acetil-CoA, um importante combustível para o ciclo de Krebs (figura 3). A irreversibilidade da reação impede a formação de piruvato a partir de acetil-CoA, e explica por que a glicose não pode ser formada a partir de acetil-CoA na gliconeogênese. Estritamente falando, o complexo piruvato desidrogenase não é parte do ciclo de Krebs, mas é uma fonte importante de acetil-CoA – o substrato de dois carbonos para o ciclo.
Figura 3
Descarboxilação oxidativa do piruvato
2.1.1. Enzimas componentes
	O complexo piruvato desidrogenase é um agregado multimolecular de três enzimas: piruvato descarboxilase, diidrolipoil transacetilase e diidrolipoil desidrogenase. Cada uma delas catalisa uma parte da reação geral (figura 4). Sua associação física liga as reações na sequência apropriada, sem a liberação de intermediários.
2.1.2. Coenzimas
	O complexo piruvato desidrogenase contém cinco coenzimas que agem como transportadoras ou oxidantes para os intermediários da reação mostrada na figura 4.
2.1.3. Inibição pelo produto
	O complexo enzimático é inibido pela acetil-CoA, que se acumula quando é produzida mais rápido do que pode ser oxidada pelo ciclo de Krebs. A enzima também é inibida por níveis elevados de NADH, o qual ocorre quando a cadeia transportadora de elétrons está sobrecarregada de substrato e o oxigênio é limitado.
Figura 4
Mecanismo de ação do complexo piruvato desidrogenase. TPP=pirofosfato de tiamina; L=ácido lipóico.
2.1.4. Modificação covalente
	O complexo piruvato desidrogenase existe nas duas formas: uma ativa, não fosforilada, e uma inativa, fosforilada (figura 5). As duas formas são interconvertidas por duas enzimas separadas, uma quinase e uma fosfatase. A quinase é ativada por um aumento na relação acetil-CoA/CoA ou NADH/NAD+. Um aumento na relação ADP/ATP, o qual sinaliza um aumento da demanda para a produção de energia, inibe a quinase e permite à fosfatase produzir mais enzima ativa, não fosforilada.
Figura 5
Regulação do complexo piruvato desidrogenase
2.2. Síntese do citrato a partir de acetil-CoA e oxaloacetato
	A condensação de acetil-CoA e oxaloacetato para formar citrato é catalisada pela citrato sintase. Essa condensação aldólica apresenta o equilíbrio bastante deslocado na direção da síntese do citrato. A reação utiliza um intermediário do ciclo de Krebs (oxaloacetato) e produz outro intermediário deste ciclo (citrato). Assim, a entrada de acetil-CoA neste ciclo não leva à produção ou consumo líquidos de intermediários de intermediários do ciclo.
2.2.1. Inibidores
	 A citrato sintase é inibida por ATP, NADH, succinil-CoA e acil-CoA, derivados dos ácidos graxos (figura 8). A velocidade da reação também é determinada pela disponibilidade de substratos.
Figura 6
Formação do α-cetoglutarato a partir de acetil CoA e oxaloacetato
Figura 7
Formação do malato a partir do α-cetoglutarato
2.2.2. Outras funções do citrato
	O citrato, além de ser um intermediário no ciclo de Krebs, fornece uma fonte de acetil para a síntese citossólica de ácidos graxos. O citrato também inibe a PFK-1, a enzima determinante da velocidade da glicólise e ativa a acetil-CoA carboxilase, a enzima limitante da velocidade da síntese dos ácidos graxos.
	
2.3. Isomerização do citrato
	O citrato é isomerizado a isocitrato pela aconitase (figura 6)
2.4. Oxidação e descarboxilação do isocitrato
	A isocitrato desidrogenase catalisa a descarboxilação oxidativa irreversível do isocitrato, originando a primeira de três moléculas de NADH produzidas pelo ciclo, e a primeira liberação de CO2 (figura 2). Esta é uma das etapas limitantes da velocidade do ciclo de Krebs. A enzima é ativada por ADP – níveis elevados de ADP mitocondrial sinalizam uma necessidade de geração de um fosfato de energia mais alta (ATP). A enzima é inibida por ATP e NADH, cujos níveis estão elevados quando a célula possui depósitos abundantes de energia (figura 8).
Figura 8
A. Produção de coenzimas reduzidas e CO2 no ciclo de Krebs. B. Inibidores e ativadores do ciclo
2.5. Descarboxilação oxidativa de α-cetoglutarato
	A conversão de α-cetoglutarato em succinil-CoA é catalisada pelo complexo α-cetoglutarato desidrogenase (figura 7). O mecanismo desta descarboxilação é similar àquele usado para a conversão de piruvato em acetil-CoA. A reação libera o segundo CO2 e produz o segundo NADH do ciclo. O equilíbrio da reação está deslocado nadireção do succinil-CoA, um tioéster de alta energia semelhante ao acetil-CoA.
2.5.1. Coenzimas
	As coenzimas requeridas são o pirofosfato de tiamina, ácido lipóico, FAD, NAD+ e CoA. Cada uma funciona no mecanismo catalítico de forma análoga à descrita para o complexo piruvato desidrogenase.
2.5.2. Inibidores
	A enzima é inibida por ATP, GTP, NADH, succinil-CoA, mas não é regulada pelas reações de fosforilação/desforilação, como descrito para o complexo piruvato desidrogenase.
2.6. Clivagem de succinil-CoA
	A succinato tioquinase cliva a ligação tioéster de alta energia do succinil-CoA (figura 7). Esta reação e acoplada a fosforilação de GDP a GTP. O conteúdo de energia do GTP é o mesmo que do ATP, e os dois nucleosídeos são interconversíveis pela reação da nucleosídeo difosfato quinase:
GTP + ADP GDP + ATP
2.6.1. Fosforilação em nível de substrato
	A geração de GTP a partir de succinil-CoA é um exemplo de fosforilação em nível de substrato, no qual a produção de um fosfato de alta energia é acoplada à conversão de substrato em produto, em vez de resultar da fosforilação oxidativa.
2.6.2. Fontes e destinos do succinil-CoA
	O succinil-CoA também é formado a partir de ácidos graxos com número ímpar de átomos de carbono, e do propionil-CoA derivado do metabolismo dos aminoácidos de cadeia ramificada. O succinil-CoA é usado na biossíntese do heme.
2.7. Oxidação do succinato
	O succinato é oxidado a fumarato pela succinato desidrogenase, produzindo a coenzima reduzida FADH2. O FAD, e não o NAD+, é o aceptor de elétrons, pois o poder redutor do succinato não é suficiente para reduzir o NAD+. O malonato, um ácido carboxílico, inibe reversivelmente a succinato desidrogenase.
2.8. Hidratação do fumarato
	O fumarato é hidratado até malato em uma reação livremente reversível, catalisada pela fumarase.
2.9. Oxidação do malato
	O malato é oxidado a oxaloacetato pela malato desidrogenase. Esta reação produz o terceiro e último NADH do ciclo (figura 9).
Figura 9
Formação de oxaloacetato a partir do malato
 
3. ESTEQUIOMETRIA DO CICLO DE KREBS
	A equação geral balanceada para a oxidação completa da acetil CoA é:
Acetil CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2 H2O 
2 CO2 + 3 NADH + FADH2 + GTP + 3 H+ + CoA
	Quadro 1. Reações do ciclo de Krebs e da cadeia respiratória
	Acetil CoA + oxaloacetato + H2O
	
	Citrato + CoA-SH 
	Citrato
	
	Isocitrato
	Isocitrato + NAD+
	
	α-cetoglutarato + NADH + H+
	NADH + H+ + 3 ADP + 3 Pi + 1/2O2
	
	NAD+ + 4 H2O + 3 ATP
	α -cetoglutarato + NAD+ + CoA-SH
	
	Succinil-CoA + NADH + H+ + CO2
	NADH + H+ + 3 ADP + 3 Pi + 1/2O2
	
	NAD+ + 4 H2O + 3 ATP
	Succinil CoA + GDP + Pi + H2O
	
	Succinato + GTP + CoA-SH + H2O 
	GTP + ADP
	
	GDP + ATP
	Succinato + FAD
	
	Fumarato + FADH2
	FADH2 + 2 ADP + 2 Pi + 1/2O2
	
	FAD + 3 H2O + 2 ATP
	Fumarato + H2O
	
	L-malato
	L-malato + NAD+
	
	Oxaloacetato + NADH + H+
	NADH + H+ + 3 ADP + 3 Pi + ½ O2
	
	NAD+ + 4 H2O + 3 ATP
	Acetil CoA + 12 ADP + 12 Pi + 2 O2
	
	2 CO2 + 13 H2O +CoA-SH + 12 ATP 
	Fonte: FIGUEIREDO (1999)
 
	Como esta reação é realizada em etapas pelas reações do ciclo do ácido cítrico, é útil examinar-se a estequiometria em detalhes.
	Há quatro reações de oxidação. Em cada uma delas, um par de elétrons e um par de prótons são removidos dos substratos e transferidos para três moléculas de NAD+ e uma molécula de FAD. Como vemos no quadro 1, a oxidação destas quatro coenzimas, por meio da cadeia respiratória, resulta na redução de quatro átomos de oxigênio, formando-se quatro moléculas de H2O. Onze outras moléculas de água são formadas nas reações de fosforilação de onze moléculas de ADP (quadro 1).
Figura 10
Principais origens da acetil CoA na célula e seu mais importante destino metabólico via ciclo de Krebs e cadeia respiratória
	Examinando-se as reações do ciclo, pode-se notar que duas moléculas de água foram consumidas nas reações de formação do citrato e do L-malato.
	Duas moléculas de CO2 são produzidas nas reações do ciclo, exatamente nas etapas de formação do α-cetoglutarato e da succinil-CoA. Estas duas moléculas de CO2 são equivalentes aos dois átomos de carbono do acetil-CoA (figura 1 e quadro 1).
	A reação de descarboxilação do α-cetoglutarato, análoga à reação de descarboxilação do piruvato, é irreversível; as demais reações do ciclo de Krebs são reversíveis. Por isso, embora apresentando reações reversíveis, o ciclo de Krebs não pode funcionar na direção reversa.
	Onze moléculas de ATP são biossintetizadas a partir de ADP, Pi e energia fornecida pela oxidação de três moléculas de NADH e uma molécula de FADH2, através da cadeia respiratória. A molécula restante de ATP é biossintetizada a partir de GTP e ADP; o GTP formou-se, por fosforilação em nível de substrato quando da hidrólise de succinil-CoA. O quadro 1 mostra as reações do ciclo de Krebs e o armazenamento de energia, na forma de ATP.
	A oxidação completa do ácido acético no calorímetro libera 209.000 cal. Quando uma molécula de ácido acético, ativada sob a forma de acetil-CoA, é oxidada até CO2 e H2O no ciclo de Krebs, 144.000 cal são armazenadas em doze moléculas de ATP, correspondente a um rendimento de 66 %.
	A figura 10 mostra as principais origens do acetil-CoA, o ciclo de Krebs e a cadeia respiratória integrados.
4. REGULAÇÃO DO CICLO DE KREBS
4.1. Regulação por ativação e inibição da atividade enzimática
	Em contraste à glicólise a qual é regulada primariamente pela fosfofrutocinase, o ciclo de Krebs é controlado pela regulação de várias atividades enzimáticas (figura 8). As mais importantes destas enzimas reguladoras são a citrato sintase, isocitrato desidrogenase e complexo α-cetoglutarato desidrogenase. 
4.2. Regulação pela disponibilidade de ADP
4.2.1. Efeitos do ADP elevado
	O consumo de energia devido à contração muscular, reações biossintéticas ou outros processos resulta na hidrólise de ATP em ADP e Pi. O resultante aumento na concentração de ADP acelera a velocidade das reações que utilizam ADP para gerar ATP, a mais importante das quais é a fosforilação oxidativa. A produção de ATP aumenta até que atinja a velocidade de consumo de ATP pelas reações que requerem energia.
4.2.2. Efeito do ADP de baixo
	Se o ADP está presente em concentrações limitantes, a formação de ATP por fosforilação oxidativa diminui devido à falta de aceptor de fosfato (ADP). A velocidade da fosforilação oxidativa é proporcional à [ADP][Pi]/[ATP]. Isto é conhecido como controle respiratório da produção de energia. A oxidação de NADH e FADH2 pela cadeia respiratória também cessa se o ADP é limitante. Isto ocorre porque os processos de oxidação e fosforilação são intimamente acoplados e devem ocorrer simultaneamente. À medida que o NADH e FADH2 se acumulam, suas formas oxidadas tornam-se depletadas, provocando a inibição da oxidação de acetil-CoA no ciclo de Krebs, devido à falta de coenzimas oxidadas. 
5. LEITURA
“Como nasceu a idéia do ciclo do ácido cítrico”
	Esta é uma questão muito natural, pois a existência de um ciclo tão complexo para a oxidação dos grupos acetil de dois carbonos até , através do ácido cítrico de 6 carbonos, pode parecer desnecessariamente complicada e em desacordo com o princípio da economia máxima da lógica bioquímica das células vivas.
	O ciclo do ácido cítrico foi, pela primeira vez, postulado como a via de oxidação do piruvato nos tecidos animais em 1937 por Sir Hans Krebs. A ideia do ciclo ocorreu-lhe durante um estudo sobre o efeito apresentado pelos ânions de vários ácidos orgânicos sobre a velocidade de consumo do oxigênio por suspensões de músculos peitorais de pombo durante a oxidação do piruvato.
	O músculo peitoral do pombo é usado durante o vôo e tem uma velocidade de respiração muito alta, sendo, assim, especialmente apropriado para o estudo da atividade oxidativa. Investigações anteriores realizadas por Albert Szent-Györgyi, na Hungria, haviam demonstrado que certos ácidos orgânicos dicarboxílicos com 4 átomos de carbono na molécula e sabidamente presentes em tecidos animais, os ácidos succínico, fumárico,málico e oxaloacético estimulavam o consumo de oxigênio pelo músculo.
	Krebs confirmou estas observações e descobriu que os mesmos ácidos também estimulavam a oxidação do piruvato. Além disso, ele verificou que a oxidação do piruvato pelo músculo também era estimulada pelos ácidos de 6 átomos de carbono e tricarboxílicos – cítrico, cis-aconítico e isocítrico, como também pelo ácido α-cetoglutárico que tem 5 átomos de carbono na molécula. As estruturas desses ácidos estão mostradas na figura 2. Nenhum outro ácido orgânico de ocorrência natural, quando testado, mostrou possuir tal atividade. A ação estimuladora dos ácidos ativos era notável uma vez que mesmo a adição de diminutas quantidades de qualquer um deles podia promover a oxidação de quantidades várias vezes maior de piruvato.
	A segunda observação importante feita por Krebs foi a de que o malonato (figura 11), um inibidor competitivo da desidrogenase succínica inibia a utilização aeróbica do piruvato pelas suspensões, não importando a adição de qualquer um dos ácidos orgânicos possuidores de atividade estimuladora. Isto indicava que o succinato e a desidrogenase succínica deviam ser componentes essenciais das reações enzimáticas envolvidas na oxidação do piruvato. Mais ainda, Krebs encontrou que quando o malonato é usado para inibir a utilização aeróbica do piruvato por suspensões de tecido muscular ocorre um acúmulo de citrato, de α-cetoglutarato e de succinato no meio de suspensão, sugerindo que o citrato e o α-cetoglutarato são convertidos normalmente em succinato quando o malonato não está presente.
Figura 11
Malonato é análogo do succinato e potente inibidor competitivo da enzima succinato desidrogenase
	
Destas observações básicas e de outas evidências, Krebs concluiu que os ácidos di e tricarboxílicos citados acima podiam ser arranjados em uma sequência química lógica, onde cada passo é uma transformação química simples catalisada por uma enzima específica. Além disso, como a incubação de piruvato e oxaloacetato com tecido muscular macerado resultava no acúmulo de citrato no meio, Krebs também concluiu que esta sequência funciona de forma circular antes que linear, de tal forma que o seu início e o seu fim estão unidos. Para o elo que fechava o ciclo, e que estava faltando, ele propôs a reação:
	A partir destes experimentos simples e do raciocínio lógico, Krebs postulou o que ele chamou de ciclo do ácido cítrico como a via principal de oxidação dos carboidratos do músculo. Nos anos seguintes a sua descoberta o ciclo do ácido cítrico tem sido encontrado não apenas no músculo, mas em virtualmente todos os tecidos dos animais e plantas superiores e em muitos microrganismos aeróbicos. Por esta importante descoberta, Krebs recebeu o Prêmio Nobel de 1953, juntamente com Fritz Lipmann, o “pai” do ciclo do ATP.
	
6. BIBLIOGRAFIA
CHAMPE, P. C., HARVEY, R. A. Bioquímica Ilustrada. Porto Alegre: Artes Médicas, 1996, 446p.
FIGUEIREDO, A. F. S. Oxidações biológicas. In: VIEIRA, E. C., GAZZINELLI, G., MARES-GUIA, M. Bioquímica celular e biologia molecular. São Paulo: Atheneu, 1999. p. 151- 178.
LEHNINGER, A. L., NELSON, D. L., COX, M. M. Princípios de bioquímica. São Paulo: SARVIER. 1995, 839p.