Testes sorológicos

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Diagnostico sorológico das infecções 
Infecção com a maioria dos microorganismos 
 Anticorpos específicos 
Aplicações: 
- Determina o status imunológico do indivíduo 
- Opção única para detectar infecção prévia 
Detecção de anticorpos: Importância Diagnóstica infecção 
Imunoglobulinas – Produzidas em resposta a estímulos antigênicos 
- Moléculas funcionais e heterogêneas que se ligam aos antígenos 
para ação efetora 
- 5 classes: IgM, IgG, IgA, IgD e IgE 
✓ Detecção de IgM: 
- Infecção recente (infecção aguda) 
✓ Detecção de IgG: 
- Infecções anteriores 
- Pacientes vacinados 
 
Característica do anticorpo 
 
 
 
Interações AG-AC 
 
- Ligações não covalentes 
- Reversíveis 
Produzindo anticorpos policlonais 
 
Obtido pela imunização com antígeno que apresenta vários epítopos; 
Vários clones de linfócitos B; Anticorpos apresentam 
heterogeneidade; 
Produzindo anticorpos monoclonais 
- Fusão celular entre uma célula B normal produtor de anticorpo e 
uma de linhagem de mieloma (câncer de linfócito B) - Hibridoma; 
 
 
 
- O anticorpo policlonal liga-se a múltiplos epítopos em um antígeno 
- Os anticorpos monoclonais só podem se ligar a um único epítopo 
 
Método sorológico 
Reagentes não marcados (A ligação do Ac altera o estado físico do 
Ag) 
- Reação de aglutinação 
- Reação de precipitação 
Reagentes marcados 
- RIA 
- ELISA 
- IF, citometria de fluxo 
- Western Blotting 
Imunofluorescência 
- Baseia-se na capacidade das moléculas de Ac se ligarem 
covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade 
específica com o Ag. 
- Fluorocromos 
O resultado é analisado em microscópio de fluorescência. 
 
Imunofluorescência direta 
 
 
 
Imunofluorescência indireta 
 
 
 
 
Imunofluorescência 
 
Exemplo 
Sífilis - Testes treponêmicos 
 
Imuno-histoquímica 
- Detecção de células infectadas em cortes histológicos 
- As amostras são, então, incubadas com substratos enzimáticos 
(quando Ac está marcado com enzima), gerando uma coloração 
castanha ou vermelha, que reflete a distribuição do antígeno alvo no 
tecido/célula analisado. 
Citometria de fluxo 
Princípio: Cito (celula)+metria (medida) + fluxo (movimento) 
- Imunofluorescência modificada – FACS classificador de células 
ativado por fluorescência 
- Usado para contar as diferentes sub-populações de células 
(ex:TCD4, TCD8) 
 - Usado para acompanhar a progressão da AIDS 
- Separação de células marcadas por fluorescência 
- Anticorpos dirigidos contra moléculas de membrana ou Antígenos 
do Conjunto de Diferenciação (CD) 
- Cada Ac é marcado com um fluorocromo diferente 
- Teste qualitativo e quantitativo 
 
 
Gráfico de análise de leucócitos (com fluorescência) 
 
Reações de aglutinação 
- Direta: Detectam anticorpos contra quantidades relativamente 
grandes de antígenos celulares como hemácias, bactérias e fungos 
- Indireta (Passiva): Os Anticorpos contra antígenos solúveis podem 
ser detectados por testes de aglutinação. Os antígenos são 
adsorvidos em partículas como bentonita ou mais frequentemente 
esferas de látex minúsculas. 
 
 
Sistema ABO – grupos sanguíneos 
 
Teste de coombs 
 
O fator Rh é um dos dois grupos de antígenos eritrocitários de 
importância clínica, envolvido nas reações transfusionais hemolíticas e 
na Doença Hemolítica do Recém-Nascido (DHRN ou Eritroblastose 
fetal). 
Material analisado: sangue – Hemaglutinação (Quando reações de 
aglutinação envolvem a agregação de hemácias) 
Teste de coombs direto: consiste em detectar a presença de IgG 
ligados às hemácias de um indivíduo – detecção anemia hemolítica. 
Teste de coombs indireto: consiste em associar hemácias padrão 
Rh+ e soro (do paciente) e então adicionar o reagente de Coombs 
(anticorpo de coelho anti-Ig humana) – transfusões e gestante Rh 
negativo e parceiro com fator Rh positivo e/ou desconhecido 
Teste de coombs direto 
 
 
 
Teste de coombs indireto 
 
Diluição seriada 
- Uma diluição seriada é basicamente uma série de diluições simples 
que amplifica o fator de diluição. 
- A fonte da amostra para diluição de cada etapa vem da diluição 
anterior. 
- Todas as diluições na série têm o mesmo fator de diluição, em que 
a amostra da diluição anterior é usada para fazer a diluição 
subsequente. 
- Por exemplo, se eu tiver uma diluição 1/2, meu fator de diluição é 2. 
Todas as diluições seguintes serão multiplicados por 2. 
- 1/2 * 2 = 1/4 * 2 = 1/8 * 2 = 1/16 … 
- O objetivo desse tipo de diluição é ir diminuindo progressivamente 
a quantidade de soluto (amostra) em relação ao diluente. 
 
Técnica utilizada nos testes para o diagnóstico das sífilis: 
Aglutinação de partículas (TPPA) 
VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) 
 
Tenho um resultado de VDRL positivo. Faço a diluição seriada e 
constato que a última reatividade ocorreu na diluição de 1/256. Esse é 
o resultado do exame, que a gente chama de título da reação. 
Teste imunoenzimático – ELISA 
Elisa direto 
- Anticorpo primário é usado para capturar primeiro um antígeno 
- Um anticorpo secundário conjugado a uma enzima que também 
reconhece epitopos no antígeno 
- Após a adição do cromógeno, um espectrofotômetro mede a 
absorbância do produto final, que é diretamente proporcional à 
quantidade de antígeno capturado 
- Concentrações mais altas resultam em uma cor final mais escura. 
 
Elisa indireto 
O ELISA indireto é usado para quantificar anticorpos específicos para 
antígenos no soro do paciente para o diagnóstico da doença. 
- O antigénio do agente de doença suspeito está ligado a placas de 
microtítulo. 
- O anticorpo primário vem do soro do paciente, que é 
subsequentemente ligado pelo anticorpo secundário conjugado à 
enzima. 
- A medição da produção do produto final nos permite detectar ou 
quantificar a quantidade de anticorpo específico para o antígeno 
presente no soro do paciente. 
 
 
Microplate ELISA for HIV antibody: coloured wells indicate reactivity 
Western Blotting 
Detecção de Proteínas 
 
 
Testes rápidos 
Testes rápidos são aqueles cuja execução, leitura e interpretação 
dos resultados são feitas em, no máximo, 30 minutos. Além disso, 
são de fácil execução e não necessitam de estrutura laboratorial. 
Imunocromatografia de fluxo lateral (lateral flow) 
Utilizam uma membrana de nitrocelulose subdividida em quatro áreas. 
- Área de amostra (A), onde é aplicada a amostra e a solução 
tampão. 
- Área intermediária (I), que contém o conjugado, geralmente 
composto de ouro coloidal ligado a anticorpos (imunoglobulinas). 
- Área de teste (T), que contém os antígenos fixados à membrana 
de nitrocelulose, onde se lê o resultado da amostra testada. 
- Área de controle (C), local de controle da reação e que permite a 
validação do teste. 
 
COVID – 19 -> busca de anticorpos 
 
 
 
 
 
 
 
Lateral flow resultados 
 
 
COVID – 19 -> busca de antígeno