Relatório - Bioquímica 4 - Prática (Lipases)_3

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
BIOQUÍMICA 4 - BQ004
RELATÓRIO – AULA PRÁTICA
ATIVIDADE LIPOLÍTICA DA LIPASE DE CANDIDA RUGOSA
ALUNOS:
ARNON DE MELO ANDRADE
BRUNA RAFAELA SILVA DE ALMEIDA
							CARLOS EDUARDO LEMOS EBBERS
							CARLOS VINÍCIUS PEREIRA
							KELLEN CRUZ
							LUCAS JOSÉ DE ALENCAR DANDA
							MARIA CRISTIANE BEZERRA
							NATÁLIA JULIANE SANTANA
							VITOR BESSONI
RECIFE, 2013
1.	Dosagem de atividade lipolítica de Candida Rugosa
	Teste
	Substrato (pNPM)
	Tampão
	Lipase
	Absorbância
	
	
	
	
	0”
	15”
	30”
	45”
	60”
	75”
	90”
	120”
	1
	2,0mL
	---
	0,5mL
	0,073
	0,275
	0,308
	0,326
	0,335
	0,338
	0,339
	0,339
	2
	2,0mL
	0,1mL
	0,4mL
	0,049
	0,253
	0,295
	0,316
	0,325
	0,331
	0,334
	0,336
	3
	2,0mL
	0,3mL
	0,2mL
	0,049
	0,172
	0,224
	0,264
	0,288
	0,304
	0,314
	0,327
	4
	2,0mL
	0,4mL
	0,1mL
	0,037
	0,075
	0,113
	0,156
	0,188
	0,214
	0,236
	0,266
	5
	2,0mL
	0,450mL
	0,05mL
	0,050
	0,074
	0,099
	0,122
	0,144
	0,164
	0,182
	0,214
	Branco
	2,0mL
	0,5mL
	---
	0,0
	0,0
	0,0
	0,0
	0,0
	0,0
	0,0
	0,0
2.	Cálculo da Atividade Relativa da Enzima
	Foram selecionados, para cálculo da Atividade Relativa Enzimática, os intervalos de tempo entre 0" e 60", de todos os testes. Seguem os valores:
	Teste
	60"
	0"
	Δ60" (60"-0")
	1
	0,335
	0,073
	0,262
	2
	0,325
	0,049
	0,276
	3
	0,288
	0,049
	0,179
	4
	0,188
	0,037
	0,151
	5
	0,144
	0,050
	0,094
1M pNP	–––	1,32x104 M-1.cm-1 		
X		–––	MA Δ60"		
		
Onde:	1M pNP = p-Nitrofenil 1M;
	1,32x104 M-1.cm-1 = Coeficiente de Absorção molar do pNP;
	MA Δ60" = Média aritmética da diferença de valores obtidos entre 60" e 0";
	2X = Atividade Relativa da enzima.
Desenvolvendo:
X = MA Δ60" / 1,32x104 M-1.cm-1
X = 0,1924 / 1,32x104 M-1.cm-1
X = 1,45x10-5
Atividade Relativa da enzima = 2,9x10-5 M/min./mL
Como o valor para a unidade internacional se dá em 1mL, há necessidade de ajustar o valor de X multiplicando por 2, por conta da quantidade de enzima que foi utilizada durante o procedimento (0,5mL).
3.	Cálculo da Atividade Específica da Enzima
Atividade Relativa da enzima		–––	mg de enzima dissolvida na solução
		Y			–––	1000mg de enzima
Obs.: Cálculo importante para determinar a pureza da enzima utilizada. Não é possível para ser calculado nesse teste, pois não foi fornecido o valor em mg de enzima utilizado na solução usada no experimento.
4.	Gráficos
	
	Neste gráfico, observamos que os valores de densidade óptica (DO) obtidos através do espectrofotômetro aumentam com o passar do tempo. Isto se dá por conta da atividade enzimática da lipase que, com o passar do tempo, se liga a mais substrato formando o produto de coloração amarela. O aparelho, ajustado para realização da leitura em 410nm, absorve mais energia óptica devido o aumento gradual do produto de coloração característica.
	Como enzima típica de cinética michaeliana, à velocidade máxima (Vmax), todos os centros ativos estão ocupados (saturados) com substrato, ou seja, não existe enzima livre para ligar mais substrato e a concentração do complexo enzima-substrato é igual à concentração de enzima. Nos teste 1 e 2 é fácil de observar o platô gerado por esta característica da dinâmica enzimática nos tempos 90" à 120".
	
	O aumento da [E] (concentração de enzima) em cada teste demonstra bem a dinâmica de velocidade em relação a [E]. Em todos os testes, a concentração de substrato permaneceu intacta e somente a [E] foi mudada para sinalizar as mudanças de velocidade e caracterizar o poder catalítico da enzima. 
	O gráfico 2 esboça exatamente esta característica. O intervalo de tempo (minuto) foi escolhido entre 0" e 60" onde há maior concentração de substrato e maior variação na velocidade de reação para facilitar a observação. A leve divergência no teste de 500μL, que apresentou menor absorbância/min em relação ao teste de 400μL deve-se a erros sistemáticos na realização do procedimento técnico.