Atividade enzimática e desnaturação proteica

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OBJETIVO 
 
Verificar o efeito dos parâmetros pH e temperatura na atividade da enzima amilase salivar. 
 
 
INTRODUÇÃO 
 
Enzimas são polímeros biológicos que catalisam as reações químicas que possibilitam a vida. A 
presença e manutenção de um conjunto completo e balanceado das enzimas são essenciais 
para a quebra dos nutrientes para fornecer energia e blocos de construção química. Dessa 
forma, o glicogênio e o amido, ingeridos na dieta, são hidrolisados por enzimas denominadas 
de alfa-amilases, enzimas da saliva e das secreções pancreáticas que quebram as ligações 
glicosídicas alfa 1-4 entre as unidades de glicose. 
A enzima alfa-amilase salivar, em condições específicas de pH 6,8 e temperatura 37°C, catalisa 
a hidrólise das ligações alfa-1,4 da cadeia glicosídica do polissacarídeo amido. A hidrólise do 
amido, catalisada pela alfa-amilase, é considerada parcial e os produtos resultantes são uma 
mistura de moléculas de glicose, maltose e dextrina limite, que é um tipo de glicosana não 
degradável pela ação catalisadora da alfa-amilase salivar devido apresentar ligações do tipo 
alfa-1,6 nas extremidades das cadeias. A hidrólise das ligações alfa-1,6 pode ser catalisada por 
uma enzima intestinal específica. 
A hidrólise do amido pode ser evidenciada na presença de iodo. Devido à hidrólise, o tamanho 
da cadeia glicosídica do amido diminui e a reação com o iodo não ocorre, deixando de ser 
evidente a coloração azul arroxeada característica de amido na presença de iodo. 
 Amido + iodo – cor azul 
 Amilodextrina + iodo – cor roxa 
 Eritrodextrina + iodo – cor vermelha 
 Acrodextrina + iodo – cor amarela escuro 
 Maltose + iodo – cor amarela 
 Glicose + iodo – cor amarela 
 
O efeito da temperatura sobre a velocidade das reações enzimáticas é duplo. A velocidade da 
reação aumenta com o aumento da temperatura até que um máximo seja atingido, num 
mecanismo denominado de ativação térmica. Acima da temperatura de atividade enzimática 
máxima, ocorre diminuição da velocidade da reação devido ao processo de desnaturação 
proteica. 
 
AULA PRÁTICA 07 - EXPERIÊNCIA – Atividade enzimática e desnaturação proteica 
 
 
As enzimas apresentam atividade máxima em um determinado valor ou faixa de pH, 
denominado de pH ótimo. A variação do pH afeta o caráter iônico dos grupos carboxila e 
amina dos aminoácidos, o que pode acarretar alterações conformacionais da molécula e 
impedir a ligação do substrato no sítio ativo da enzima, alterando sua atividade. 
 
MATERIAL, EQUIPAMENTOS E REAGENTES 
 
 Tubos de ensaio 
 Copo descartável 
 Pipetador automático 100-1000 µL 
 Ponteiras 
 Banho-maria 
 Gelo 
 
 
PROCEDIMENTOS 
 
Parte A - Coleta da enzima: Coletar 1,0 mL de saliva e diluir na proporção 1:4 com tampão 
fosfato pH 6,8 (1,0 mL de saliva + 3,0 mL de tampão). Reservar a saliva diluída para ser 
utilizada em etapas posteriores. 
Parte B - Caracterização de padrões 
1. Identificar 2 tubos de ensaio e proceder conforme esquema abaixo: 
Tubos Teste Reagente 
Padrão de não 
hidrólise 
2 mL de amido 2 gotas de Lugol 
Padrão de hidrólise 
total 
2 mL de glicose 2 gotas de Lugol 
 
2. Homogeneizar e observar. 
3. Coloração azul-arroxeada evidencia a formação de complexo de iodo com o 
polissacarídeo amido, caracterizando um padrão indicativo de que não ocorreu 
hidrólise. 
4. Coloração amarela caracteriza padrão de hidrólise total do amido. 
 
 
Parte C - Avaliação do efeito do pH na atividade enzimática 
1. Identificar 3 tubos de ensaio e proceder conforme esquema abaixo: 
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 
2 mL amido 2 mL amido 2 mL amido 
2 mL tampão fosfato pH 6,8 2 mL HCl 2 mL NaOH 
500 µL saliva 500 µL saliva 500 µL saliva 
20 minutos em banho-maria a 37°C 
2 gotas de Lugol 2 gotas de Lugol 
2 gotas de Lugol (ou quantidade 
suficiente para observar coloração) 
 
2. Agitar e observar a coloração. 
3. Comparar com a coloração das soluções padrões e verificar a hidrólise de cada 
amostra. 
 
Parte D - Avaliação do efeito da temperatura na atividade enzimática 
1. Identificar 3 tubos de ensaio e proceder conforme esquema abaixo: 
Tubo 1 
Tubo 2 
Tubo 3 
2 mL amido 2 mL amido 2 mL amido 
2 mL tampão fosfato pH 6,8 2 mL tampão fosfato pH 6,8 2 mL tampão fosfato pH 6,8 
 
5 minutos a 37°C 
5 minutos gelo 5 minutos água fervente 
 
500 µL saliva 
 
500 µL saliva 
 
500 µL saliva 
 
20 minutos a 37°C 
20 minutos gelo 20 minutos água fervente 
2 gotas de Lugol 2 gotas de Lugol 2 gotas de Lugol 
2. Agitar e observar a coloração. 
3. Comparar com a coloração das soluções padrões e verificar a hidrólise de cada amostra. 
 
 
RESULTADOS 
 
Parte B - Caracterização de padrões 
Tubos Teste Reagente Resultado 
Padrão de não 
hidrólise 
2 mL de amido 2 gotas de Lugol 
Padrão de hidrólise 
total 
2 mL de glicose 2 gotas de 
Lugol 
 
 
Parte C - Avaliação do efeito do pH na atividade enzimática 
Tubos Condições Experimentais RESULTADOS 
1 amido + enzima – pH 6,8 – 37°C 
2 
 
amido + enzima – pH ácido - 37°C 
3 
 
 
amido + enzima – pH básico – 37°C 
 
Parte D - Avaliação do efeito da temperatura na atividade enzimática 
Tubos Condições Experimentais RESULTADOS 
1 amido + saliva - 20 minutos – pH 6,8 – 37°C 
2 amido + saliva - 20 minutos – pH 6,8 – gelo 
3 amido + saliva - 20 minutos – pH 6,8 – água fervente 
 
 
 
PERGUNTAS 
 
1 – Explique o processo de desnaturação de uma proteína. 
2 – Quais fatores podem afetar a atividade das enzimas, alterando a velocidade de uma 
reação? Explique o porquê. 
3 – Qual o princípio da utilização do iodo para verificação da hidrólise do amido pela amilase 
salivar? 
 
 
 
 
 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
BRACHT, Adelar; ISHII-IWAMOTO, Emy Luiza (Org.). Métodos de laboratório em bioquímica. 
Barueri, SP: Manole, 2003. xv, 439 p. ISBN 8520413382. 
CHAMPE, P.C.; HARVEY, R.A. Bioquímica ilustrada. 5.ed. Porto Alegre: Artes Médicas, 2012. 
COMPRI-NARDY, Mariane B.; OLIVEIRA, Carolina de; STELLA, Mercia Breda. Práticas de 
laboratório de bioquímica e biofísica: uma visão integrada. Rio de Janeiro: Guanabara 
Koogan, 2011. 199 p. 
LUCENA, M.N. Bioquímica Experimental: um guia prático para jovens pesquisadores. 1 ed. 
Rio de Janeiro: Interciência, 2019. 290 p. 
ROSA, Gilber. Química analítica: práticas de laboratório. Porto Alegre Bookman 2013 1 
recurso online (Tekne). ISBN 9788565837705. 
STRYER, L.; BERG, J. M.; TYMOCZKO, J. L.; GATTO, J. R.; GREGORY, J. Bioquímica. Editora 
Guanabara Koogan. 7° Edição, 2014.