Reações de fixação do complemento

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Reações de Fixação 
do Complemento
Universidade Federal da Bahia
Instituto de Ciências da Saúde
ICSA 29- Imunodiagnóstico
Docente: Ricardo Wagner Portela
Discentes: Ian Andrade e Mariana Coutinho
Sistema Complemento
● Formado por proteínas expressas na membrana plasmática ou 
solúveis no plasma sanguíneo;
● São sintetizadas por hepatócitos e por macrófagos e são 
ativadas por 3 diferentes vias:
○ Via da Lectina ligadora de manose.
○ Via alternativa.
○ Via clássica .
Via clássica é a via do teste de 
fixação de complemento
● Ativada diretamente pelo patógeno ou 
indiretamente por anticorpos que se ligam na 
superfície do patógeno.
■ Anticorpo + antígeno → complexo de 
ataque à membrana → rompimento da 
membrana
● Presença de C1 que é ativada por IgM e IgG.
Via Clássica
LimpezaOpsonização
Funções do Sistema Complemento
01 02
03 04
Recrutamento 
de células 
inflamatórias
Microrganismos 
ou partículas 
recobertas por 
anticorpos
Destruição ou 
dissolução da 
membrana 
plasmática 
celular + MAC
Restos de 
células mortas 
no sangue 
Anafilaxia Lise celular
Características gerais do método
Método sorológico:
➔ Variação da técnica de Hemaglutinação.
➔ Determinar ou semi-quantificar a presença de: 
➔ Anticorpos (Ac) - Fixação do complemento. 
➔ Antígenos (Ag) - Inibição da fixação do complemento.
Fundamentos
Ativação do sistema complemento:
➔ Complexo Ag-Ac.
➔ Formação de Complexo de Ataque a Membrana (MAC).
Lise da membrana celular:
➔ Só quando o Ac se liga ao Ag adsorvido na hemácia.
➔ Ocorre a hemólise.
Soro teste01
Sistema 
complemento02
Sistema hemolítico 
(hemácias + antígenos)03
04
Centrífuga de 
microtubos05
Microtubos06
Estufa incubadora07
Materiais
R$ 2.475,00
R$ 109,00 - Cx (500 un)
Antígeno purificado 
(inibição da fixação do 
complemento)
R$ 2.249,07
Como o método 
é realizado
TESTE FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO
 Ag presente Ag ausente
SORO DO 
PACIENTE
1. O Soro do paciente (amostra) 
➔ é incubado para inativação do complemento.
Ag
01 02
Anticorpo do Soro.
Antígeno Específico.
Ac do Soro.
 Ag presente Ag ausente
SORO DO 
PACIENTE
2. Quantidade padrão do complemento adicionada. 
Ag
01 02
S. Complemento.
Anticorpo do Soro.
Antígeno Específico.
Ac do Soro.
S. Complemento.
 Ag presente Ag ausente
SORO DO 
PACIENTE
3. Eritrócitos cobertos com Ac são adicionados em quantidade padrão.
Ag
01 02
S. Complemento.
Anticorpo do Soro.
Antígeno Específico.
Sistema Hemolítico
(Hemacias com Ag 
adsorvidos).
Sistema Hemolítico
(Hemacias com Ag 
adsorvidos).
Ac do Soro.
S. Complemento.
 Ag presente Ag ausente
SORO DO 
PACIENTE
4. Lise da membrana celular (Hémolise) 
Ag
01 02
S. Complemento.
Anticorpo do Soro.
Antígeno Específico.
Sistema Hemolítico
(Hemacias com Ag 
adsorvidos).
Sistema Hemolítico
(Hemacias com Ag 
adsorvidos).
Ac do Soro.
S. Complemento.
Teste PositivoTeste Negativo
Interpretação dos resultados
Se não houver Ac específicos para o Ag, 
não ocorre hemólise e nem liberação da 
(hemoglobina). 
No caso de encontrar o complexo 
Ag-Ac, o complemento é ativado e 
leva a lise das hemácias.
Inibição da Fixação do Complemento
Ag Ag ausente
SORO DO 
PACIENTE
S. Complemento.
Anticorpo monoclonal.
AgAg do soro.
Sistema Hemolítico
Sistema Hemolítico
Ac 
monoclonal.
S. Complemento.
Interpretação dos resultados
Teste PositivoTeste Negativo
➔ Se o Ag pesquisado for ausente na amostra.
➔ O Ac monoclonal irá se ligar ao Ag 
adsorvido na membrana das hemácias.
➔ Ativando o complemento e causando a 
hemolise.
➔ Se o Ag pesquisado for presente na amostra.
➔ Os Ac monoclonais ficarão ocupados.
➔ Não havendo hemólise e nem liberação do 
material intracelular.
Baixo Custo Boa especificidade
Vantagens
01 02
Boa sensibilidade
03
Falso-negativo
Falso-positivo
Desvantagens
● Diluições inadequadas
● Contaminações nas soluções 
(gerando efeito anticomplementar)
● Sensibilização insuficiente de 
hemácias.
● Hemácias fragilizadas (Velhas)
● Soro não-inativado
● Baixa especificidade 
(Dependendo do Ag adsorvido na 
hemácia)
 Aplicações na saúde humana e animal
Teste de Fixação do Complemento é usado como teste de confirmação 
Objetivo
Verificar a proporção de soros com resultado positivo no antígeno 
acidificado tamponado (AAT) que tem resultado positivo confirmado pela 
Reação de Fixação do Complemento.
Introdução
● Programa de controle e erradicação da brucelose bovina faz a vacinação e o 
diagnóstico 
○ Identificar fontes de infecção 
○ Aplicação de medidas de profilaxia 
○ Redução da taxa de enfermidade
● Testes sorológicos para o diagnóstico
○ Baseados em detecção de IgG1 
○ Isotipos associados à infecção por Brucella abortus
Introdução
● Triagem para diagnóstico 
○ Antígeno acidificado tamponado (AAT)
○ Resultado negativo: animais livres de infecção
○ Resultado positivo: teste confirmatório
■ Evitar eutanásia de animais incorretamente por conta de falso-positivos
Materiais e métodos: teste do AAT
30 µL soro + 
30 µL de 
antígeno 
padronizado 
pH 3,65 + corado com rosa de 
Bengala (Instituto Biológico de 
São Paulo)
Se aglutinar → 
reação postiva
Mistura 
homogeinizada 
por 4 min e 
leitura
Análise de 2.784 de soro de 
fêmeas positivas no AAT
Materiais e métodos:Fixação do Complemento
Antígeno com 
Brucella abortus 
119/3 + soro de 
cobaia 
(complemento)
Cinco unidades hemolíticas 50% 
(hemácia de carneiro sensibilizadas com 
hemolisina (anticorpo de coelho contra 
hemácia de ovino)
Soro +: 25% de 
fixação na diluição 
1:4
Materiais e métodos: Análise de dados
Cálculo da 
proporção de 
positivos na 
fixação
p 土 z . √[p . (1 - p) / n] 
sendo: p = proporção de resultados positivos;
 q = 1 - p;
 z = nÌvel de confiança;
 n = n˙mero de amostras examinada
Resultados
● Intervalo de confiança de 95% de probabilidade
○ 70,6% a 74,0% positivos na triagem e no teste confirmatório
Resultados
Conclusão
● PNCEBT adotou como teste 
○ Triagem por AAT + testes confirmatórios 
● Teste de fixação do complemento apresenta maior sensibilidade para detectar 
IgG1 
● Proporciona maior sensibilidade e maior rapidez na adoção de medidas 
sanitárias.
Introdução
➔ Os profissionais de saúde são frequentemente expostos a essas infecções no ambiente 
clínico e, portanto, estão especialmente sob risco de adquirir essas doenças.
➔ O ensaio de fixação do complemento (CF), e o ELISA são comumente usados para 
detectar a presença de anticorpos contra esses vírus
Sarampo (Measles morbillivirus). Varicela (varicela-zóster).
Objetivo
O objetivo do presente estudo foi analisar e comparar a prevalência de 
anticorpos IgG direcionados contra os vírus do sarampo e varicela em 
amostras de soro de uma grande série de profissionais de saúde empregados 
em um hospital universitário japonês, usando o ensaio de CF (Fixação do 
Complemento e ELISA (Ensaio imunoenzimático). 
Métodos
População de Estudo
● Total de 898 profissionais de saúde
● Empregados em qualquer departamento do (Shimane University Hospital).
● Independentemente da histórico de sarampo ou varicela, ou documentação 
de vacinação contra essas doenças. 
● A população do estudo compreendeu 299 homens e 599 mulheres com idade 
entre 21 a 65 anos.
Métodos
Detecção de anticorpos antivirais
➔ Amostras de sangue (8 ml).
➔ Centrifugadas à 200 g por 5 min a 4 ° C.
➔ Armazenadas a 4 ° C.
O teste de anticorpos contra o sarampo e varicela foi realizado usando um ensaio de CF 
(Fixação do Complemento) e Elisa. 
➔ Negativos se o título de anticorpos fosse <× 4 no ensaio de CF.
➔ Anticorpo soronegativo foram <0,5 para sarampo e <0,6 para varicela (Elisa). 
➔ Anticorpos soropositivos foram> 0,7 para sarampo e> 0,9 para varicela (Elisa e CF).
Métodos
Os títulos de anticorpos anti-sarampo e antivaricela foram medidos simultaneamente 
em amostras de soro de todos pacientes, usando o ensaio de CF e ELISA.
Resultados
Tabela 1. Resultados sorológicos para títulosde anticorpos anti-sarampo e antivaricela para detectar IgG, 
pelo ensaio de fixação do complemento (CF) e ELISA, usando amostras de soro de profissionais de saúde ( n 
= 898) empregados em um hospital universitário japonês.
Resultados
➔ Nenhum dos indivíduos soropositivos para sarampo detectado pelo teste de CF foi 
soronegativo conforme determinado por EIA
➔ Nenhum dos indivíduos identificados como soronegativos por EIA foi soropositivo de 
acordo com o teste de CF.
Resultados
➔ Nenhum dos indivíduos soropositivos para sarampo detectado pelo teste de CF foi 
soronegativo conforme determinado por EIA
➔ Nenhum dos indivíduos identificados como soronegativos por EIA foi soropositivo de 
acordo com o teste de CF.
Todos os indivíduos considerados soropositivos de acordo com o ensaio de CF também 
foram soropositivos de acordo com os resultados do EIA.
Resultados
CF (Fixação do complemento) EIA (Ensaio imunoenzimático)
SARAMPO:
67,8%
VARICELA:
83,2% 
SARAMPO:
94,0%
VARICELA:
97,6%
Sarampo (Measles morbillivirus). Varicela (varicela-zóster).
Conclusão
➔ Uma grande diferença entre o ensaio de FC e o Elisa em termos de sua 
capacidade de identificar profissionais de saúde que eram soronegativos ou 
soropositivos para anticorpos IgG anti-sarampo ou antivaricela foi demonstrada 
nesse estudo.
➔ Sugerindo, que realizar uma pesquisa de soroprevalência usando um Elisa, em 
vez de um ensaio de FC, determinaria com mais precisão a suscetibilidade a 
doenças evitáveis por vacinas, em ambientes de saúde.
Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. Imunologia Celular e Molecular. 2019. 9ª Edição,
Editora Guanabara Koogan.
Tizard IR. Imunologia Veterinária. 2019. 10ª edição, Editora Guanabra Koogan.
SHIBATA, Hiroshi et al. Comparative analysis of a complement fixation assay and enzyme 
immunoassay to determine the seroprevalence of measles and varicella in a survey of 
healthcare workers. Journal of international medical research, v. 41, n. 1, p. 224-230, 2013.
MEIRELLES-BARTOLI, R. B.; MATHIAS, L. A. USO DA REAÇÃO DE FIXAÇÃO DE 
COMPLEMENTO NA CONFIRMAÇÃO DE RESULTADOS POSITIVOS DO TESTE DO 
ANTÍGENO ACIDIFICADO TAMPONADO PARA O DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO DA 
BRUCELOSE BOVINA. Ars Veterinaria, v. 25, n. 2, p. 068-071, 2009.
Referências