eBOOK_Genética_e_ Biologia_Molecular_No_Diagnostico_De_Sars_Cos_2

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Genética e
Biologia
Molecular no
diagnóstico
de SARS-coV
Prof. Dra. Marcela Funaki dos Reis
O QUE É O
CORONAVÍRUS?
Os coronavírus (CoV) são uma grande
família de vírus que causam doenças que
vão da gripe comum à doenças mais
severas, como a Síndrome Respiratória do
Oriente Médio (MERS-CoV) e Síndrome
Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV).
O coronavírus descoberto mais recentemente
causa a doença do coronavírus, a COVID-19.
O QUE É
COVID-19?
COVID-19 é a doença infecciosa causada
pelo coronavírus descoberto mais
recentemente. Este novo vírus e doença
eram desconhecidos antes do surto
começar em Wuhan, China, em
Dezembro de 2019.
SARS-COV-2 é o
nome dado ao novo
coronavírus.
COVID-19 a
doença causada por
este vírus.
Como o vírus foi
identificado?
 Zhu et al. (2020) identificaram um novo vírus
causador de pneumonia e seguida foi logo
nomeado como SARS-COV19, em seguida
como COVID-19. 
 Lu et al. (2020) realizaram sequenciamento
de nova geração e de Sanger em amostra de
líquido de lavagam broncoaleolar e isolados de
culturas obtidos de 9 paciente internados, 8
dos quais relataram ter visitado o mercado de
frutos do mar de Huanan em Wuahn na China. 
 A análise filogenética dessas amostras e de
outros coronavírus foram utilizadas para
determinar a história evolutiva e inferir sobre a
sua provável origem. 
 Atualmente o genoma completo do vírus esta
depositado e disponível em NCBI - National
Center for Biotechnology Information como
Reference Sequence NC_045512, (Wu et al.
2020) onde pode ser acessado análise e
estudos.
Qual a origem
do Vírus?
 A origem específica do vírus não é totalmente
esclarecida, mas no início do surto a hipótese foi
de um salto viral entre um animal selvagem e um
ser humano no mercado de frutos do mar de
Huanan em Wuhan, China, durante novembro de
2019 (ORTIZ-PRADO et al 2020). 
 A partir deste ponto as investigações focaram
na busca pelo hospedeiro intermediário. Com
isso rapidamente veio a associação com
morcegos sugerindo que estes vírus são
intimamente relacionados, apontando este
animal como provável reservatório natural, assim
como os camelos são para MERS e as civetas são
para SARS. 
 Os vírus do gênero betacoronavírus
provavelmente infectam morcegos a dezena de
milhões de anos e possivelmente desde a origem
dos próprios morcegos.
 Neste reservatório natural existem cepas de
diferentes virulências, ou seja, baixa, média e alta
capacidade de infectar humanos. 
 Em um estudo molecular utilizando recursos de
bioinformática Lu et al. (2020) compararam os
dados (contigs) contra bancos de dados de
proteínas não redundantes e como resultado deste
alinhamento as amostras se mostraram
intimamente relacionadas aos betacoronavírus do
tipo SARS de morcegos (bat-SL-CoVZC45.2). 
 E este resultado fez sentido porque o SARS-CoV
juntamente com o coronavírus tipo Bat_SARS
formam uma linhagem distinta dentro do
subgênero do sarbecovírus (Zhu et al., 2020). 
 Em outro estudo Paraskevis et al. (2020)
analisaram o nível de similaridade genética entre
2019-nCoV e o BatCoV RaTG13 (Figura 1) e
sugeriram que este último não fornece a variante
exata que causou o surto em humanos, mas é
muito provável a hipótese de que o SARS-CoV
tenha se originado de morcegos.
Figura 1. Árvore filogenética de máxima verossimilhança (ML) inferida em
diferentes regiões genômicas, conforme indicado pela análise Simplot.  A
sequência 2019-nCoV é mostrada em vermelho e as estrelas indicam que nós
importantes receberam 100% de bootstrap e 1 suporte de probabilidade
posterior. Fonte: Adaptado de Paraskevis et al. (2020). 
 A resposta esta na evolução que surge de
variação no genoma, e essa variação ocorre por
dois mecânicos: mutação e recombinação. 
 A mutação de maneira bem simples ocorre por
substituição, perda ou inserção nucleotídeos,
sendo a verdadeira fonte de novidades genéticas,
já a recombinação aumenta a variabilidade
genética por novas combinações. 
 A variabilidade genética encontrada no vírus
sugere o que chamamos de pontos quentes de
mutações, ou seja, existem regiões específicas
suscetíveis a ocorrências de mutações. 
 O oposto disto é que também já foi determinado
que existem regiões que são altamente
conservadas, ou seja, não sofrem mutações. 
 Essas características genômicas e sua potencial
associação com características de vírus e virulência
em humanos precisam de mais atenção e
provavelmente serão esclarecidos num futuro
próximo.
Mas afinal, como
isso é possível?
Como um vírus que infecta uma
espécie pode
passar a infetar outra?
Estrutura do
SARS-Cov-2
E a relação com seu genoma
 O SARS-Cov-2 é um vírus de RNA, fita simples,
poliadenilado e de sentido positivo, sendo o maior
genoma de RNA conhecido para vírus com 30kB
(Kahn, Mclntosh, 2005). 
 
 Esse genoma é organizado na ordem de um
complexo da região 5' não traduzida (UTR) -
replicação (orf 1ab) - proteínas estruturais (Spike (S)
- Envelope (E) - Membrana (M) - Nucleocapsídeo (N)
- 3′-UTR e quadros de leitura aberta não estruturais
(ORFs), Figura 2.
 Segundo Almazán et al. (2014) os primeiros dois
terços do genoma codificam o gene da replicase. A
tradução de ambas as ORFs resulta na síntese de
duas poliproteínas que são processadas por
proteinases virais para liberar os componentes do
complexo replicação-transcrição. 
 O terço final do genoma inclui os genes que
codificam as proteínas estruturais S, E, M e N, bem
como as proteínas específicas do gênero e
características de cada CoV, que são expressas a
partir de um de RNAm.
Figura 2. Estrutura e genoma do vírus SARS-CoV-2. 
(A) Existem quatro proteínas estruturais como segue: spike (S),
glicoproteína de superfície (roxo);  proteína da membrana (M),
(laranja); proteína do nucleocapsídeo (N), (azul); e proteína do envelope (E),
(verde). O RNA genômico é mostrado envolto na proteína N. 
(B) O genoma SARS-CoV-2 é organizado na ordem de 5′-replicase (ORF1a/
b) - proteínas estruturais [spike (S) - envelope (E) - membrana (M) -
nucleocapsídeo (N)] - 3 ′. Fonte: Heng L. et al. (2020). 
QUAIS SÃO OS
SINTOMAS DA
COVID-19?
Os sintomas mais comuns de COVID-19
são: febre, cansaço e tosse seca. Algumas
pessoas têm dores e desconfortos,
congestão nasal, coriza, garganta
inflamada ou diarreia.
Testes
diagnósticos
Existem basicamente duas categorias de testes
os diretos que envolvem a detecção do RNA viral
usando testes de amplificação de ácidos nucleicos
(Nucleic Acid Amplifcation Tests NAAT) como a RT-
qPCR e os indiretos baseados na resposta
imunológica do paciente visando a detecção dos
anticorpos  IgA, IgM e IgG.
 Qual é o melhor teste? Na verdade ambos
apresnetam elevada sensibilidade e especificidade,
parâmetros fundamentais para um diagnóstico
seguro. Então, a pergunta correta seria quando
usar o teste baseado em NAAT e quando usar o
teste sorológico (Figura 3). Daí a resposta é
baseada na carga viral, desenvolvimento dos
sintomas e positividade em cada teste
considerando um paciente realmente positivo
para COVID-19. 
Figura 3. A relação temporal entre carga viral, sintomas e positividade em testes
diagnósticos. O início dos sintomas (dia 0) é geralmente 5 dias após a infecção
(dia –5). Nesta fase inicial correspondente à janela ou período assintomático, a
carga viral pode estar abaixo do RT-PCR limiar e o teste pode dar resultados
falso-negativos. O mesmo acontece no final da doença, quando o paciente está
se recuperando. Seroconversão geralmente pode ser detectado entre 5–7 dias
e 14 dias após o início dos sintomas; portanto, na primeira fase da doença, a
fase sorológica os testes têm maior probabilidade de dar resultados falso-
negativos. A linha preta pontilhada no gráfico ilustra a sensibilidade do ensaio
quimioluminescente como derivado da folha de dados de um teste comercial
(Abbott Diagnostics, EUA). Ig, imunoglobulina; RT-PCR, transcrição reversa-PCR;
SARS-CoV-2, síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2. Fonte: Adaptado
de La Marca et al. (2020).
CONSIDERAÇÕESTambém é importante ressaltar que desde a
identificação do SARS-Cov-2 como o
responsável pela covid-19 foi grande foi e
continua sendo o empenho e os desafios para o
estabelecimento de um protocolo para voltado
a um diagnóstico seguro. Assim, o protocolo
atual foi desenvolvido e otimizado para o
detecção do novo Coronavírus por entidades
respeitáveis como o Hospital Universitário
Charité de Genebra, Centers for Disease
Control (CDC) nos Estados Unidos, OMS entre
outros centros.                
Existem diferentes procotolos em aplicação
atual que diferem entre si geralmente pela
escolha de primers para amplificação do RNA
viral. Dentre os diferentes protocolos também
não será discutido aspectos relacionados aos
méritos de cada teste, mais sim o entendimento
de como estes testes funcionam relacionando
aos aspectos da genética e da biologia
molecular.
 Amostragem
RT-qPCR
Extração do
RNA viral
 Para realização deste teste, primeiramente
discutiremos o processo de amostragem para
obtenção do RNA viral. Esta técnica segue as etapas
indicadas na Figura 4:
Figura 4: Etapas para realiação da RT-qPCR. 
RT-pPCR
 Para obter RNA viral o processo de amostragem
visa coletar secreções contendo células
potencialmente contaminadas pelo vírus. Assim, é
recomendada a coleta com swab de amostra
nasofaríngea. 
 Quando não for possível as alternativas aceitáveis
segundo Shereen et al. (2020) são uma coleta
orofaríngea,  uma da concha nasal média ou
lavagem nasofaríngea, aspirado ou amostra de
aspirado nasal ou ainda trato respiratório inferior
quando disponível. 
 O mesmo autor aponta que embora o vírus possa
ser detectado em outras amostras como sangue e
fezes, estes geralmente são menos confiáveis do
que amostras provenientes do trato respiratório,
pois esta nesta região que se espera maior carga
viral. 
 As amostras em seguida são encaminhadas para
extração de RNA com kits de extração aprovados
para esta finalidade.
Amostragem
Extração do
RNA viral
 O SARS-Cov-2 é um vírus de RNA, logo os kits de
extração são particularmente aplicados a este tipo
de ácido nucleico que reconhecidamente
apresenta estabilidade inferior quando comparado
ao DNA. 
 Outro aspecto relevante diz respeito ao fato de
que a desempenho da reação de RT-pPCR é
dependente da qualidade do RNA extraído em
termos de quantidade, pureza e integridade desta
amostra para não gerar principalmente falsos
negativos em pacientes clinicamente suspeitos
para covid-19. 
 Diferentes kits estão disponíveis para esta
finalidade, cada um com uma metodologia
aplicada. Para fins de exemplificação podemos citar
o QIAamp DSP Viral RNA Mini Kit da Qiagen
baseado na extração e purificação em membrana
de sílica (QIAGEN, 2012); MagNA Pure 96 System da
ROCHE que é um método de extração e purificação
automatizado de elevado rendimento e tempo de
execução inferior a 1 hora para 96 amostras
(ROCHE, 2020). 
Extração do
RNA viral
 Existem muitos outros kits disponíveis para esta
finalidade, mas ambos seguem basicamente o
seguinte fluxograma de extração do RNA viral
(Figura 5):
 
- Lise da célula do hospedeiro para liberar o RNA
viral;
- Inativação de possíveis nucleases capazes e clivar
o RNA viral;
-Precipitação de proteínas, DNA e outros
contaminantes; 
- Purificação e eluição/ressuspenção do RNA alvo. 
Figura 5. Protocolo básico de extração de RNA. Fonte: Adaptado de Addgene
(2020).
 Em seguida a amostra de RNA viral se presente
na amostra do paciente estará prontamente
disponível para a RT-qPCR.
Controles da
Reação 
 Controles na reação são importantes, pois
asseguram a confiabilidade no teste. 
 Basicamente são utilizados um controle negativo,
um positivo e as vez um controle interno. 
 
 O controle negativo consiste em uma reação
contendo todos os reagentes da reação menos a
amostra. Então, geralmente no lugar da amostra é
colocado água ultrapura livre de DNA e RNA. Assim,
na reação o controle negativo não apresentará
amplificação. 
 O controle positivo é uma amostra padronizada
do vírus SARS-Cov-2 ou amostra obtida de um
paciente positivo para COVID-19. O controle
positivo pode ser obtido comercialmente ou é um 
 componente integrante dos kits de COVID-19. 
 
 Já o controle interno auxilia na exclusão de falsos
negativos. Podemos exemplificar pelo teste STAT-
NAT®-COVID-19 (SENTINEL, 2020) que utiliza o
canal Hex/VIC multiplexado com os alvos virais que
permite a análise do RNA viral extraído e de todo o
processo sem a necessidade de testes adicionais. 
 Vamos iniciar esclarecendo que para o diagnóstico
baseado na RT-qPCR temos duas técnicas de PCR
combinadas: a Transcrição Reversa do RNA viral (RT-
PCR) e a sua potencial quantificação por Real Time
(qPCR). Veremos as duas técnicas separadamente
por fins didáticos. 
 Caso você não saiba do que se trata uma reação
de PCR, leia a explicação do Quadro 1.
Quadro 1. Explicação breve sobre a PCR convencional (ATAWODI, ATAWODI,
DZIKWIi; 2010).
RT-pPCR
Princípio da técnica: A técnica de reação em cadeia da polimerase – PCR
consiste basicamente em amplificar uma região-alvo no DNA específica.
Amplificar significa neste sentido aumentar o número de cópias da região alvo
no DNA. 
Reagentes: Para amplificar o DNA na reação de PCR precisamos dos blocos de
construção do DNA, ou seja, nucleotídeos que neste caso são trifosfatados, por
isso são denominados dNTPs (Adenina, Timina, Citosina e Guanina). Precisamos
dos primers que delimitam o início e fim da região-alvo a ser amplificada pela
enzima. Os primers são oligonucleotídeos sintéticos complementares a região-
alvo. É utilizado um par de primers, o foward que estabelece o início e o reverse
que indica o fim da amplificação. Também é necessário a enzima Taq-
polimerase que além de amplificar suporta as temperaturas necessárias para
cliclagem. E por fim, como é utilizado uma enzima, precisamos garantir um pH
adequado com o uso de um tampão especifico e um cofator para eficiência
enzimática. 
Ciclagem: A ciclagem consiste em um programa de alternância de
temperaturas por tempos específicos estabelecidos em um equipamento
chamado Termociclador. Um programa de ciclagem básico envolve a elevação
da temperatura (±94ºC) para promover desnaturação do alvo rompendo as
pontes de hidrogênio que mantém o DNA em dupla-fita. Em seguida ocorre a
etapa de anelamento com o resfriamento do termociclador com a finalidade
dos primers anelarem ao alvo. (nesta etapa temperatura é variável e
dependente da Tm (Melting Tempeture) dos primers). Por fim, na etapa de
extensão (72ºC) a enzima taq-polimerase copia de maneira complementar o
alvo segindo as orientações estabelecidas pelos primers. As três etapas de
ciclagem se repetem cerca de 30 a 40 vezes amplificando o alvo gerando
teoricamente bilhões de cópias. 
Resultado convencional: Na PCR convencional o resultado é baseado na
presença ou ausência do produto de amplificação (amplicon) em uma
eletroforese em gel de agarose.
RT-PCR
PCR por Transcrição Reversa
 A reação em cadeia da polimerase por transcrição
reversa (RT-PCR) é uma adaptação da PCR
convencional aplicada à análise de RNAs em geral
(Figura 6).
 Todo o princípio é baseado no uso da enzima
transcriptase reversa, daí o nome
da técnica. Nesta reação uma molécula de cDNA (DNA
complementar) é transcrita de maneira reversa pela
enzima transcriptase reversa, ou seja, esta enzima é
capaz de produzir uma molécula de DNA a partir da
cópia complementar e reversa do RNA viral. 
 Este momento é muito crítico, pois a transcriptase
reversa copia todos os RNAs presentes na amostra do
paciente, incluindo RNAs do paciente, do vírus (caso
presente) bactérias que colonizam esta região. Assim,
na próxima etapa é necessário selecionar
corretamente o alvo de amplificação, ou seja, somente
o cDNA do vírus SARS-Cov-2.
 Este momento é muito crítico, pois a transcriptase
reversa copia todos os RNAs presentes na amostra do
paciente, incluindo RNAs do paciente, do vírus (caso
presente) bactérias que colonizam estaregião. Assim,
na próxima etapa é necessário selecionar
corretamente o alvo de amplificação, ou seja, somente
o cDNA do vírus SARS-Cov-2.
 Em seguida esta molécula de cDNA é utilizada para
amplificação das regiões-alvo específicas para cada
protocolo de identificação de SARS-Cov-2.
Figura 6. Esquema de representação da RT-PCR. 1, indica a produção do cDNA
a partir do RNA de SARS-Cov-2. 2. Etapa de amplificação. Fonte: Adaptado de
Fraga, Meulia, Steven Fenster (2014). 
qPCR
Real Time PCR ou PCR quantitativa
 Nesta etapa o cDNA do vírus amplificado permitindo a
identificação da presença ou ausência do SARS-Cov-2 na
amostra do paciente confirmando ou excluindo o
diagnóstico de COVID-19. 
 Além, de diferenças em relação às enzimas polimerases
utilizadas (HotStart, Platinum, por exemplo) os testes
diferem quanto aos primers e sondas de amplificação
utilizadas. 
 Basicamente, primers são pequenas sequencias de
oligonucleotídeos composição conhecida, pois são
construídos de modo a serem complementares a alvo.
Neste ponto os protocolos diferem, pois cada um propõe
identificar a presença do vírus de acordo com a região que
potencialmente é mais conservada evitando problemas de
reação cruzada e falsos negativos ou positivos. 
 Uma vez que são os primers que garantem a
especificidade da reação de PCR e os protocolos diferem
neste requisito, Ortiz-Padro et al. (2020) resumiram as
posições dos conjuntos de primers e sondas mais utilizados
sugeridos pelo CDC americano (Figura 7). A sequencias
destes primers também podem ser observados na Tabela 1.
Figura 7.  conjuntos de primers e sondas listadas pela OMS para a reação de RT-
qPCR. CDC Estados Unidos (2019-nCoV_N1, N2 e N3),  Universidade de Hong
Kong (HKU-N e HKU-ORF1b_nsp14), Universidade de Charité, Berlin – Alemanha
(RdRp_SARSr e E), Instituto Nacional de Saúde da Tailândia (WH-NIC N), Instituto
Nacional de Doenças Infecciosas no Japão (NIID_2019-nCoV_N), CDC da China (N
e Orf1ab), Instituto Pasteur, Paris, França (nCoV_IP2, IP4 e E). E: gene da proteína
do envelope, S: gene da proteína spike; N: gene da proteína do nucleocapsídeo.
Nsp14: gene da proteína não estrutural 14, Orf1: fase de leitura aberta 1; RdRp:
gene da polimerase de RNA dependente de RNA; O número abaixo dos
amplicons são as posições do genoma listadas em SARS-CoV-2, GenBank
MN908947.3. Fonte: Extraído e modificado a partir de Ortiz-Padro et al. (2020).
Figura 7.  Primers e sondas para RT-PCR aplicados ao diagnóstivo de COVID-19.
Fonte: CDC Atlanta (2020)
 Definido o par de primers foward e reverse a
escolha da sonda de amplificação também é
importante. 
 Dois sistemas de detecção por sondas de
fluorescência são os mais empregados para SARS-
Cov-2: SYBR Green e Taq-Man, sendo esta última
de maior confiabilidade devido ao tipo de sinal
emitido que corresponde à amplificação somente
na etapa de extensão da PCR. 
 As sondas de detecção permitem a quantificação
do alvo de amplificação em tempo real, pois a
sonda emite uma fluorescência que é captada pelo
sistema da plataforma evidenciando a amplificação
do alvo. 
 A sonda de degradação taq-man (Figura 8)
também é um oligonucleotídeo complementar ao
alvo de amplificação duplamente marcada na
extremidade 5’ com um Repórter (fluoróforo)  e na
extremidade 3’ um Quencher (Inibidor de
fluorescência inespecífica), (WANG, 2017). 
Adicionar um pouquinho de texto
Figura 8. Sonda de hidrólise Taqman. Fonte: Sigma Aldrich (2020) 
 O uso desta sonda é baseada na atividade
exonuclease da DNA-polimerase que ao encontrar a
sonda durante a amplificação do alvo realiza a sua
degradação (Figura 9), e a sonda por sua vez ao ser
degradada libera o repórter que passa emitir a
fluorescência que será captada pela plataforma
gerando um gráfico/ curva que permite o cálculo da
Ct (Cycle Threshold), (Figura 10). 
 
Figura 9. Esquema representando a qPCR. Fonte: LeAnne Noll (2020).
Figura 10. Gráfico representando a curva indicativa de resultado positivo
para COVID-19 em azul e resultado negativo em vermelho. Cycle
Thresshold (CT). Fonte: Adaptado de BiteSizeBio (2020). 
 O uso da Ct fornece o valor indicativo da carga
viral do paciente no momento da realização do
exame, no entanto por estarmos em meio a uma
pandemia o resultado é emitido como qualquer
teste qualitativo, ou seja, apenas indicando
resultado positivo ou negativo para SARS-Cov-2, ou
seja, indicando a presença ou ausência do vírus na
amostra do paciente. E com isso, segue-se o
tratamento indicado.
Referências
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