Aula 3 - Fatores Intrínsecos e Extrínsecos (1)

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FATORES INTRÍNSECOS E EXTRÍNSECOS QUE 
CONTROLAM O DESENVOLVIMENTO 
BACTERIANO E FÚNGICO
Prof. MSc. Rafael Carvalho
Cultura de microorganismos
 A cultura de microrganismos consiste no crescimento de populações 
microbianas em meios de cultura laboratoriais. 
 Uma cultura que tem apenas um tipo de microrganismo é conhecida 
por cultura pura (seletiva), uma cultura que tem mais do que um tipo 
de microrganismo é uma cultura mista (não seletiva). 
 A cultura de microrganismos consiste num passo rotineiro do exame 
microbiológico, sendo feito simultaneamente com o exame 
microscópico (identificação das características morfológicas – cocos, 
bacilos, vibriões e espiroquetas).
Crescimento Bacteriano
 Crescimento Bacteriano = Multiplicação (número)
 Estão aumentando em número e se acumulando em colônias
 Tempo de Geração
• Varia entre espécies
• Condições ambientais 
(temperatura, etc.)
Toda bactéria tem seu ambiente ideal onde encontra condições ótimas 
de crescimento. 
Ciclo do Crescimento Bacteriano
Fase LAG (adaptação)
 Atividade de preparação intensa para crescimento da população
 Pouca ou nenhuma divisão
 Demanda de tempo para a biossíntese de moléculas essenciais (enzimas e 
metabólitos)
 Quando ocorre:
◼Repique de cultura (antiga)
◼ Inóculo de baixa viabilidade
◼Transferência de uma cultura em meio enriquecido para um meio mais 
pobre (seletivo)
Fase LOG (exponencial)
 multiplicação intensa em intervalos regulares
Divisão celular intensa e constante
 Tempo de geração atinge um mínimo constante
Momento de maior atividade metabólica
Quando ocorre:
◼Condições ótimas de temperatura, nutriente, pH, etc...
Ciclo do Crescimento Bacteriano
Fase estacionária
 Diminuição das taxas de crescimento e aumento do número de 
mortes
 Taxa de morte de iguala à taxa de crescimento
 População se estabiliza em números
 Quando ocorre:
◼Diminuição de nutrientes
◼Produção de resíduos tóxicos (produtos bacterianos)
◼Mudança de pH
◼Etc...
Fase de morte celular
 Fase de declínio onde a população se reduz ou até mesmo se 
extingue
 Taxa de morte é maior que a taxa de crescimento
 Apesar de ser uma fase exponencial é mais lenta que a fase log (pode 
levar dias, meses ou anos)
 Quando ocorre:
◼Esgotamento de nutrientes
◼Acúmulo de resíduos tóxicos (produtos bacterianos)
◼Mudança de pH
◼Etc...
Ciclo do Crescimento Bacteriano
Com a cultura de microrganismos pretende-se
• Aumentar a quantidade de microrganismos, que por vezes, ocorrem em número 
reduzido na amostra, para facilitar posteriormente a identificação.
• Procurar isolar os tipos de microrganismos existentes numa população microbiana 
mista.
• Diferenciar entre grupos de microrganismos através da aparência macroscópica das 
colônias e das reações bioquímicas com o meio.
• Caracterizar e identificar os microrganismos através das características das suas 
colônias
• Quantificar microrganismos.
Fatores (químicos e físicos) que influenciam no 
crescimento bacteriano 
Fatores Físicos
Temperatura
pH
Pressão Osmótica
Fatores Químicos
Carbono, Nitrogênio, 
Oxigênio
Nutrientes
Fatores orgânicos de 
crescimento
FATORES FÍSICOS
TEMPERATURA
 Temperatura Mínima, Ótima e Máxima Microorganismos: (TEMPERATURA)
• Psicróficos: 10 – 20ºc 
• Mesófilos: 20 – 40ºc 
• Termófilos: acima de 40ºc
• Termófilos extremos: >80ºc
FATORES FÍSICOS
pH
• A maioria das bactérias
cresce numa faixa estreita
e perto da neutralidade
(6,5-7,5)
• Fungos tem faixa de pH
ótimo menor (5-6)
• Produção de ácido
(fermentação) → inibição
do crescimento
 Neutrófilas
Bactérias patogênicas → pH ótimo neutro (6,5 e 7,5)
Fungos → pH ótimo levemente ácido (5 a 6)
◼Leveduras vs. Bolores
 Acidófilas (ex. Helicobacter pylori)
 Alcalinófilas (ex. Vibrio cholerae)
FATORES FÍSICOS
pH
Organismo 
pH
Mínimo Ótimo Máximo 
BACTÉRIAS (maioria) 4,5 6,5 a 7,5 9,0
Acetobacter sp 4,0 5,4 a 6,3 -
Bacillus subtilis 4,2 a 4,5 6,8 a 7,2 9,4 a 10,0
Clostridium botulinum 4,8 a 5,0 6,0 a 8,0 8,5 a 8,8
Escherichia coli 4,3 a 4,4 6,0 a 8,0 9,0 a 10,0
Lactobacillus (maioria) 3,0 a 4,4 5,5 a 6,0 7,2 a 8,0
Propionibacterium 4,7 6,2 a 7,0 7,5
Proteus vulgaris 4,4 6,0 a 7,0 8,0
P. aeruginosa 5,6 6,6 a 7,0 8,0 a 9,0
Salmonella 4,5 a 5,0 6,0 a 7,5 8,0 a 9,6
Staphylococcus aureus 4,0 a 4,7 6,0 a 7,0 9,5 a 9,8
LEVEDURAS 1,5 a 3,5 4,0 a 6,5 8,0 a 8,5
Pichia 1,5 - -
Saccharomyces cerevisae 2,0 a 2,4 4,0 a 5,0 -
BOLORES 1,5 a 3,5 4,5 a 6,8 8 a 11
Aspergillus niger 1,2 3,0 a 6,0 -
Mucor - 3,0 a 6,1 9,2
Penicillium 1,9 4,5 a 6,7 9,3
Rhizopus nigricans - 4,5 a 6,0 -
FATORES FÍSICOS
PRESSÃO OSMÓTICA
 Dizem-se halófilos (do grego halo - sal + filo - amigo) os organismos 
extremófilos que podem desenvolver-se em ambiente com altas 
concentrações de sal
FATORES FÍSICOS
PRESSÃO OSMÓTICA
• Halotolerantes resistem ou crescem em concentrações de
sal de (1-6%);
• halófilos moderados (6-15%);
• halófilos extremos de (15-30%) podendo sobreviver em
até 32% (limite de saturação do NaCl),
Atividade da Água (Aw ou AA)
 Água pura = 1,00
 Dependente de outros fatores ⇒ temperatura, disponibilidade de 
nutrientes, pH e outros
Aa = Atividade da água
Redução da atividade de água no alimento
1) Adição de soluto: sal, açúcar, glicerol 
2) Remoção da água: desidratação e 
congelamento
Diminuição da Aw = aumento da duração da fase LAG e a diminuição do crescimento 
microbiano
Halófilos - organismos extremófilos que podem desenvolver-se em ambiente com altas 
concentrações de sal
Fatores (químicos e físicos) que influenciam no 
crescimento bacteriano 
Fatores Físicos
Temperatura
pH
Pressão Osmótica
Fatores Químicos
Carbono, Nitrogênio, 
Oxigênio
Nutrientes
Fatores orgânicos de 
crescimento
Fatores químicos
Nitrogênio
• Atmosfera → Fixação de Nitrogênio
• Formação de amônia (NH3)
• Compostos inorgânicos de nitrogênio (sais de amônio)
• Compostos orgânicos de nitrogênio (aminoácidos)
Fatores químicos: Oxigênio
Competição entre microrganismos 
 Antagonismo
 Ex: Bactérias produzem ácido láctico ⇒ meio ácido para a maioria dos
microrganismos
 Sinergismo
 Ex: leveduras degradam o ácido láctico ⇒ crescimento de outros
microrganismos
Fatores químicos
outros elementos
 Enxofre (S): síntese de aminoácidos e vitaminas
 Fósforo (P): síntese de ácidos nucléicos e fosfolipídeos / ATP
 Potássio (K), Cálcio (Ca), Magnésio (Mg): cofatores enzimáticos
Redução parcial ou total do O2 por outros gases = prolonga o 
tempo de armazenamento dos alimentos
Vitaminas 
Complexo B, biotina, ácido pantotênico
Carne: muita vitamina B 
Frutas: pouca vitamina B 
Bactérias Gram-positivas: não sintetizam 
Bactérias Gram-negativas, leveduras e bolores: sintetiza
Um estudo brasileiro divulgado na revista
científica ”Metabolism” sugere que os níveis
de vitamina D circulantes no organismo
podem influenciar o perfil da flora intestinal
e, consequentemente, o risco de desenvolver
doenças cardiovasculares e metabólicas.
Constituintes antimicrobianos 
 Substâncias que apresentam a capacidade de retardar ou 
impedir a multiplicação microbiana. 
 Podem ser: 
Deterioração de Produtos
 Fatores intrínsecos e extrínsecos de crescimento microbiano.
 Tipo e quantidade do microrganismo (carga microbiana) 
NO PRODUTO...
 Mudança de coloração (pigmentação)
 Alteração e formação de odores
 Produção de gases
 Alteração da viscosidade
 Desestabilização de emulsões
 Presença de toxinas
 Redução da biodisponibilidade
 Inativação do sistema conservante
Algumas notáveis, outras imperceptíveis aos sentidos humanos.
Infecções Decorrentes de Produtos Contaminados
NO CONSUMIDOR...
 Pode provocar INFECÇÕES ou INTOXICAÇÕES
Presença de patógenos primários / toxinas
Carga Microbiana
Resistência do Hospedeiro
◼ Imunocomprometidos
MANOBRAS ASSÉPTICAS PARA SEMEADURA DOS MICRORGANISMOS 
NOS MEIOS DE CULTURA
 são técnicas que impedema entrada de micro-organismos onde estes não são desejados
 Impedir com que micro-organismos presentes no ar ou depositados sobre as diversas
superfícies com a poeira, venham a contaminar materiais estéreis do laboratório como meios
de cultura, soluções e equipamentos ou, ainda, culturas puras de micro-organismos.
 Os microrganismos após serem cultivados no meio de cultura podem ser analisados e
identificados, por meios seletivos e diferenciais, série bioquímica e pelas técnicas de
coloração (Gram, Ziehl Neelsen, etc).
MEIOS DE CULTURA
Meios de cultura
 Os meios nutritivos são líquidos (caldo nutritivo) ou gelatinosos (agar nutriente, contendo 1,5-
2% do polissacarídeo agarose).
 Meios seletivos permitem que apenas certas bactérias cresçam e suprimam a reprodução de
outras
 Condições necessárias para o crescimento → Temperatura ótima de proliferação → Maioria
das bactérias patogênicas humanas → 37oC.
 Bactérias são geralmente cultivadas sob condições atmosféricas → 5% de CO2.
Por que usa CO2?
 O carbono está presente na maioria das substâncias que compõem as células.
 As bactérias podem utilizar o carbono inorgânico existente no ambiente, na
forma de carbonatos ou de CO2 como única fonte de carbono → São nestes caso
chamadas de autotróficas.
 Os microrganismos que obrigatoriamente requerem uma fonte orgânica de
carbono são denominados heterotróficos e as principais fontes, são os
carboidratos.
ÁGAR NUTRIENTE
Simples, de fácil preparo e barato, é utilizado na
análise de água, alimentos e leite como meio para
cultivo de amostras submetidas a exames
bacteriológicos e isolamento de organismos para
culturas puras.
ÁGAR MACCONKEY
Destinado para o crescimento de bactérias
Gram negativas (E. Coli) e indica a fermentação
de lactose. Colônias de bactérias que
fermentam lactose tornam o meio rosa choque e
as bactérias que não são fermentadoras de
lactose tornam o meio amarelo claro.
https://www.plastlabor.com.br/news/156-importancia-meios-de-cultura-o-que-pra-que-serve
https://www.plastlabor.com.br/meios-de-cultura-clinica/meios-de-cultura-em-placas/agar-macconkey-90x15mm
ÁGAR SANGUE
De coloração vermelha
escura e opaca, oferece
excelentes condições de
crescimento para a maioria
dos microrganismos.
ÁGAR SALMONELLA-SHIGELLA
Possui componentes que inibem
microrganismos gram positivos.
Permite selecionar e isolar espécies
de Salmonella e Shigella em
amostras de fezes, alimentos e
água
ÁGAR CHOCOLATE
Crescem neste meio quase todos os
tipos de microrganismos. À base do
meio, é adicionado sangue de cavalo,
carneiro ou coelho em temperatura alta,
o que faz com que as hemácias lisem,
liberando hemina e hematina, compostos
fundamentais para o crescimento dos
microrganismos exigentes → Isolamento
de Haemophylus spp. e Neisseria spp.
https://www.plastlabor.com.br/meios-de-cultura-clinica/meios-de-cultura-em-placas/placa-agar-sangue-de-cavalo-5-90x15mm
https://www.plastlabor.com.br/meios-de-cultura/%C3%A1gar-salmonella-shigella-90x15mm
https://www.plastlabor.com.br/meios-de-cultura-clinica/meios-de-cultura-em-placas/pl-agar-chocolate-90mm
ÁGAR SABOURAUD
De coloração amarelo claro, oferece
excelentes condições de crescimento para a
maioria dos fungos leveduriformes e
filamentosos → Candida ssp.
ÁGAR MANITOL
De coloração rosa, oferece excelentes condições para
isolamento de estafilococos, diferenciando as espécies
coagulase-negativas de S. Aureus → alta concentração de sal.
• Colônias rodeadas por zona vermelha → Staphylococcus
aureus não patogênico
• Colônias rodeadas por zona amarela → S. Aureus
https://www.plastlabor.com.br/meios-de-cultura-clinica/meios-de-cultura-em-placas/placa-agar-sangue-de-cavalo-5-90x15mm
https://www.plastlabor.com.br/meios-de-cultura-clinica/meios-de-cultura-em-placas/placa-agar-sangue-de-cavalo-5-90x15mm
Caldos nutritivos
 O BHI (Infusão Cérebro e Coração) é um meio para cultivo de uma 
grande variedade de microrganismos, incluindo organismos 
fastidiosos, leveduras e fungos
 O TSA (trypticase soy agar) é um meio de cultura. É um meio não 
seletivo onde crescem diversas bactérias. O meio é rico em triptona e 
peptona, fonte de carboidratos, proteínas e lipídios para o 
desenvolvimento dos microorganismos verificados
As técnicas de manipulação de culturas envolvem
• Trabalhar em áreas submetidas previamente a limpeza e desinfecção, para reduzir o número de potenciais micro-
organismos contaminantes.
• Trabalhar dentro da “zona de segurança” (ou halo de segurança) do bico de Bunsen, ou seja, os recipientes (tubos de 
ensaio, placas de Petri, pipetas, etc) com meio de cultura devem ser abertos o mais próximo possível da chama do bico 
(uma área de 10cm ao redor da chama do Bico de Bunsen) sem que haja perigo de superaquecimento ou queimaduras.
• Flambar ao rubro alça ou agulha antes e após cada inoculação.
• Deixar esfriar o instrumento antes de obter o inóculo, dentro da zona de segurança, preferencialmente na parte interna 
do recipiente que contém o meio de cultura.
• Flambar rapidamente a boca dos tubos contendo microrganismos ou meio estéril, imediatamente após abri-los, ou 
antes de fechá-los. A tampa nunca deve ser colocada sobre a bancada, sendo retirada e mantida segura pelo dedo 
mínimo da mão, que detém a alça ou agulha durante a inoculação.
• Desembrulhar a pipeta estéril dentro da zona de segurança, flambá-la rapidamente e mantê-la nesta região durante 
todo o trabalho.
Técnicas de semeadura
 Transferência de inóculos bacterianos de um meio de cultura ou material a ser
analisado (secreções, alimentos) para um outro meio de cultura.
 Flambar a alça bacteriológica, deixar esfriar. Tocar em cima do inóculo feito
com o swab espalhando o mesmo com a alça fazendo estrias bem juntas em
cerca de um terço da superfície da placa, de modo gradativo vai se fazendo
outras estrias mais afastadas uma das outras em novas direções até esgotar o
material contido no inóculo
Objetivos da técnica de esgotamento
 Utilizada para obtenção de colônias isoladas em meio sólido.
 A técnica visa obter colônias isoladas de bactérias ou leveduras
presentes em materiais biológicos, permitindo a diferenciação de
diferentes tipos morfológicos.
 Consiste em depor sobre um ponto da superfície do meio uma
alíquota do material e depois espalhá-lo em três ou quatro setores
→ obter quantidades progressivamente menores do material.
Objetivos da técnica de esgotamento
Objetivos da técnica de esgotamento
 O sucesso da semeadura está em:
• não perfurar o meio;
• não voltar a alça sobre a estria
• pegar pequena quantidade de material para semear.
• SEMPRE trabalhar com todo material PRÓXIMO À CHAMA DO BICO DE
BUNSEN para evitar contaminação externa no seu experimento.
• SEMPRE flambar a alça bacteriológica QUANDO NECESSÁRIO.
Incubar a placa invertida em estufa bacteriológica à 36 ± 2 oC por 24 horas.
Após cerca de 24 horas avaliar as características morfológicas das colônias
isoladas. O ágar Sangue deve ser incubado em microaerofilia na mesma
temperatura, colocar as placas dentro de um jarra de vidro ou lata, acender
uma vela, deixar acessa dentro da jarra e fechá-la; a vela irá consumir boa
parte do oxigênio e gerar o aumento de dióxido de carbono.
Cálculo de meios de cultura: Conforme instrução do fabricante, sempre
diluindo em 1 litro de água ou proporcional (regra de 3)
Como identificar bactérias?
 Características morfológicas
➢ Forma (cocos, bacilo, vibrião, espirilo);
➢ Tamanho; pseudogrupos (clusters - Estafilo, cadeias - Estrepto, diplococos);
➢ Coloração (Gram-positiva, Gram-negativa);
➢ Flagelos (presença, ausência);
➢ Cápsula (sim, não);
➢ Esporos (forma, dentro da formação celular)
 Características fisiológicas
➢ Enzimas da cadeia respiratória (oxidases, catalases)
➢ Enzimas que decompõem carboidratos, álcoois, glicosídeos (por exemplo,
betagalactosidase)
➢ Enzimas do metabolismo de proteínas (por exemplo, gelatinase, colagenase)➢ Enzimas do metabolismo de aminoácidos (por exemplo, descarboxilases,
desaminases, urease)
Como identificar bactérias?