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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ENGENHARIA DE ALIMENTOS LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA AULA PRÁTICA 1: PIPETAGEM E DILUIÇÃO DE SOLUÇÕES Karolyne de Moraes Nunes 201703639 GOIÂNIA 2019 1. Introdução Uma solução é uma mistura homogênea de dois ou mais componentes, ou seja, a composição da mistura é a mesma em todos os pontos. No caso das soluções aquosas, estas são preparadas por diluição, que consiste em adicionar água na solução mais concentrada com concentração já conhecida. Considerando que a quantidade de soluto não se altera pode-se descrever o valor da nova concentração baseando-se na equação CiVi= CfVf . Prepara-se soluções diluídas a partir de soluções mais concentradas. Neste caso, pipeta-se um volume da solução concentrada e transfere-o para um tubo completando seu volume com o solvente. Assim, a concentração diminuirá. 2. Materiais e Métodos Usou-se para fazer o experimento: a) 4 Tubos de ensaio b) 1 Béquer c) 1 Proveta d) 1 Bastão de vidro e) Corante Vermelho de Metila f) Água destilada g) Ácido Clorídrico 2,0 M. h) Pipeta i) Banho-maria A solubilização do corante já estava feita para realização dessa aula. Fez-se uma diluição seriada, pipetou-se 4mL de água destilada em 4 tubos de ensaio, completou-se o volume do tubo 1 com 1mL de vermelho de metila. Pipetou-se 1mL da solução presente no tubo 1 e o transferiu para um segundo tubo completando seu volume para 5mL. Fez-se o mesmo para mais dois tubos. Analisou-se a diferença entre as cores do tubo e calculou-se a porcentagem de corante de cada diluição feita. 3. Resultados e Discussões Porcentagem de vermelho de metila em cada diluição: Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 = 20% = 4% = 0,8% = 0,16% Durante a diluição seriada, houve diferença nas cores dos quatro tubos, essa mudança de cor deve-se ao fato da diminuição de concentração, ou seja, quanto mais água é adicionada menor é a quantidade de corante e ácido então mais clara será a solução. 4. Conclusão Pode-se dizer que o experimento foi bem sucedido pois ocorreu o que era esperado, ou seja, a concentração do vermelho de metila diminuiu. 5. Referências Pereira, M. Roteiros das aulas práticas de bioquímica, biofísica e biologia molecular oferecido pelo Instituto de Ciências Biológicas da UFG. Goiânia 2019/2. UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ENGENHARIA DE ALIMENTOS LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA AULA PRÁTICA 2: pH E TAMPÃO Karolyne de Moraes Nunes 201703639 GOIÂNIA 2019 1. Introdução O tampão é feito a partir de um ácido fraco e um sal, formado pela reação desse ácido com uma base forte, ou então, por uma base fraca e um sal formado pela reação dessa base com um ácido forte. Utiliza-se soluções tampão para que se mantenha um pH constante a medida que se adiciona alguma substância no meio. A determinação do valor do pH está relacionada ao logaritmo negativo de sua concentração hidrogeniônica, e expressa seu caráter ácido ou básico, ou seja: 2. Materiais e métodos 2.1 Material · 11 Tubos de ensaio; · Pipetas graduadas ou volumétricas de 1 e 10 mL; · Pipetas Pasteur descartável; · Tampões de pH 4; 5; 6; 7; 8; 9 e 10; · Indicador Universal; · Hidróxido de Sódio (NaOH) 0,1 M (mol/L); · Ácido Clorídrico (HCl) 0,1 M (mol/L); · Agitador de tubos (vórtex). 2.2 Métodos e resultados 1. Preparar uma bateria de 7 tubos de ensaio. Adicionar ao primeiro tubo 1 ml de solução tampão pH 4, no segundo tampão pH 5, e assim sucessivamente até o tampão pH 10. Adicionar a cada tubo 9 ml de água destilada e 5 gotas do indicador universal. Esta bateria irá constituir a escala padrão de pH. pH 4 5 6 7 8 9 10 Cor Laranja Amarelo Verde limão Verde água Azul claro Azul escuro Roxo 2. Preparar outra bateria de 4 tubos de ensaio e numerá-los de 1 a 4. Adicionar 5 gotas do indicador universal a cada tubo. 3. Aos tubos 1 e 3 adicionar 10 ml de água destilada. 4. Aos tubos 2 e 4 adicionar 1 ml de solução tampão pH 7 e mais 9 ml de água destilada. 5. Determinar o pH de cada solução, transferindo os resultados para o quadro abaixo em anexo. Proceder da mesma maneira para cada etapa do experimento. 6. Adicionar 1 gota de NaOH 0,1 M aos tubos 1 e 2. Observar. 7. Por meio de uma pipeta, soprar o ar expirado dentro da solução do tubo 1 Durante 15 segundos. Notar a mudança de cor da solução. Determinar o pH. 8. Soprar no tubo 2 durante 1 minuto. Observar. 9. Adicionar aos tubos 3 e 4 quatro gotas de HCI 0,1 M. Observar a mudança de coloração e determinar o pH. 10. Continuar a adição de HCI ao tubo 4, gota a gota. Determinar quantas gotas de HCI devem ser adicionadas até que se obtenha a mesma coloração do tubo 3. A) Pela adição de base (álcali): Tubo Adição 1 Adição 2 Adição 3 1 Água destilada (pH=6) 1 gota de NaOH 0,1 mol/L (pH=10) Ar expirado por 15s (pH=6) 2 Tampão (pH=6) 1 gota de NaOH 0,1 mol/L (pH=7) Ar expirado por 1min (pH=7) B) Pela adição de ácido: Tubo Adição 1 Adição 2 3 Água destilada (pH=6) 4 gotas de HCl0,1 mol/L (pH=4) 4 Tampão (pH=6) 4gotas de HCl 0,1 mol/L (pH=7) Foram necessárias 19 gotas de HCI 0,1 mol/L no tubo 4 para se obter o mesmo pH (coloração) do tubo 3. 4. Conclusão Observou-se que as soluções tamponadas conseguem manter o pH do meio, enquanto as não tamponadas podem se tornar mais ácidas ou básicas de acordo com a solução que é adicionada a ela. Os que contêm um tampão não variam tanto, pois o CO2 reage com o H2O formando H+, logo, é difícil que haja mudança. 5. Referência Roteiros das aulas práticas de bioquímica, biofísica e biologia molecular oferecido pelo Instituto de Ciências Biológicas da UFG. Goiânia 2019. UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ENGENHARIA DE ALIMENTOS LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA AULA PRÁTICA 3: DETERMINAÇÃO DO ESPECTRO DE ABSORÇÃO DE CORANTES E CONSTRUÇÃO DA CURVA PADRÃO Karolyne de Moraes Nunes 201703639 GOIÂNIA 2019 1. Introdução A espectrofotometria de absorção é um método em que se analisa a quantidade de radiação eletromagnética absorvida por um determinado material. Como acontece em nível molecular, cada molécula de substância absorve radiação de forma única, ou seja,a quantidade de radiação absorvida por uma substância em um comprimento de onda dependerá de sua estrutura, sendo, portanto, uma propriedade característica pra cada molécula de substância. 2. Materiais e métodos 2.1 Material · 6 Tubos de Ensaio; · Solução de Azul de Bromofenol 0,01mg/mL; · Solução de Metilorange 0,01mg /mL; · Espectrofotômetro; · Papel milimetrado; · Vórtex 2.2 Métodos e resultados Determinou-se o espectro de absorção da solução de ABF e da solução de MO, procedendo às leituras nos comprimentos de onda abaixo indicados. Utilizou-se água destilada como branco para calibrar o aparelho em absorbância igual a zero. λ 415 445 460 490 520 535 550 580 610 640 ABF 0,041 0,046 0,054 0,093 0,181 0,264 0,365 0,655 0,385 0,029 MO 0,342 0,446 0,481 0,374 0,165 0,075 0,031 0,006 0,005 0,003 TUBO ABF OU MO H2O (mL) ABS (460NM) CONCENTRAÇÃO B --- 5,0 0 0 1 1,0 4,0 0,113 0,002 2 2,0 3,0 0,185 0,004 3 3,0 2,0 0,243 0,006 4 4,0 1,0 0,396 0,008 5 5,0 --- 0,527 0,01 4. Referência Roteiros das aulas práticas de bioquímica, biofísica e biologia molecular oferecido pelo Instituto de Ciências Biológicas da UFG. Goiânia 2019. UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ENGENHARIA DE ALIMENTOS LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA AULA PRÁTICA 4: TITULAÇÃO DA GLICINA COM UMA BASE Karolyne de Moraes Nunes 201703639 GOIÂNIA 2019 1. Introdução A titulação é uma técnica volumétrica em que através da medição rigorosa de volumes é possível determinar a concentração de uma solução utilizando outra solução cuja concentração é conhecida (solução padrão). Chama-se curva de titulação uma representação gráfica que mostra a maneira como varia o logaritmo de uma concentração crítica com a quantidade de solução titulante adicionada. Nessa curva tem um ponto de virada queé chamado de ponto de equivalência. 2. Materiais e Métodos · Glicina 0,05M · Hidróxido de Sódio (NaOH) 0,1M · pHmetro · Béquer · Proveta · Bastão de vidro · Placa de Petri para apoiar o béquer · Papel toalha Colocou-se 30mL de glicina em um béquer em seguida, utilizando o pHmetro, mediu-se o pH da solução. Adicionou-se 2mL de NaOH e novamente mediu-se o pH. Fez-se esse processo por mais 30 vezes, até que o volume final de NaOH fosse 60mL. Feito isso, fez-se uma tabela para melhor análise dos dados e para que fosse possível a construção do gráfico da curva de titulação. 3. Resultados e Discussões Após a coleta dos dados, completou-se a tabela com os valores de ph medidos durante o experimento: Etapa do experimento Glicina 0,05 M (mL) NaOH (0,1M) (mL) pH 1 -- -- 1,32 2 -- 2,0 1,39 3 -- 2,0 1,53 4 -- 2,0 1,69 5 -- 2,0 1,84 6 -- 2,0 2,05 7 -- 2,0 2,28 8 -- 2,0 2,54 9 -- 2,0 2,90 10 -- 2,0 4,56 11 -- 2,0 8,88 12 -- 2,0 9,49 13 -- 2,0 9,81 14 -- 2,0 10,07 15 -- 2,0 10,39 16 -- 2,0 10,57 17 -- 2,0 10,87 18 -- 2,0 11,29 19 -- 2,0 11,81 20 -- 2,0 12,35 21 -- 2,0 12,45 22 -- 2,0 12,63 23 -- 2,0 12,72 24 -- 2,0 12,80 25 -- 2,0 12,87 A partir da tabela fez-se a curva de titulação, colocando na abscissa o volume de NaOH e na ordenada o pH da solução: 4. Conclusão Pode-se dizer que o experimento bem sucedido, pois os valores de pH coletados estavam de acordo com o esperado. 5. Referências Gutz, I. G. R.; Cálculo de pH e Análise de Dados de Titulação oferecido pelo Instituto de Quimíca da USP, São Paulo 2006. Pereira, M. Roteiros das aulas práticas de bioquímica, biofísica e biologia molecular oferecido pelo Instituto de Ciências Biológicas da UFG, Goiânia. UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ENGENHARIA DE ALIMENTOS LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA AULA PRÁTICA 5: DETERMINAÇÃO COLORIMÉTRICA PELA REAÇÃO DE BIURETO Karolyne de Moraes Nunes 201703639 GOIÂNIA 2019 1. Introdução Biureto é o nome dado à estrutura originada a partir da decomposição da uréia, quando essa é submetida a uma temperatura de, aproximadamente, 180°C. As ligações existentes na molécula de biureto são muito parecidas com as ligações peptídicas estabelecidas entre os aminoácidos durante a formação de peptídeos e, finalmente, das proteínas. 2. Materiais e Métodos · Tubos de ensaio · Caseína 1% · Glicina 1% · NaOH 1,0 mol/L · Reativo de Biureto (sulfato de cobre 0,5%) · Água destilada · Espectrofotômetro · Vórtex Separou cinco tubos de ensaio, o conteúdo que foi adicionado em cada tubo encontra-se na tabela abaixo: B = branco; G = glicina Reativos B G 1 2 3 Água destilada(mL) 1,0 - - - - Solução de glicina (mL) - 1,0 - - - Solução de caseína(mL) - - 0,2 0,6 1,0 Água destilada(mL) - - 0,8 0,4 - NaOH 1,0mol/L 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 Reativo de Biureto 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 Feita a adição de cada solução nos devidos tubos, levou ao vórtex para que ocorresse uma melhor homogeneização e transferiu-se 1mL de cada solução para uma cubeta, para que fosse possível a leitura no espectrofotômetro. Fez-se a leitura em 540nm. 3. Resultados e discussões Os resultados de absorbância observados, foram: Resultado Tubo B Tubo G Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Absorbância - 0,031 0,119 0,137 0,170 O tubo que absorve mais energia é o tubo 3, enquanto o tubo G que contém glicina não absorve muito, por ser um aminoácido isolado, então não reage com o biureto pois o cobre só se liga a partir de três aminoácidos. Após a adição do sulfato de cobre, todos os tubos apresentaram uma mudança de cor (violeta) porém a cor ia sendo menos intensa no decorrer dos tubos. Pode-se dizer que quanto mais violeta a cor da solução do tubo, maior é a concentração de proteínas. 4. Conclusão O experimento foi bem sucedido. A reação é positiva para as substâncias que contém 2 grupos carboamínicos (-CO-NH2) ligados diretamente ou através de um único átomo de carbono ou nitrogênio. Para que a reação do biureto seja positiva há necessidade da presença de pelo menos duas ligações peptídicas na molécula, portanto, aminoácidos e dipeptídeos não dão reação do biureto positiva. 5. Referências Pereira, M. Roteiros das aulas práticas de bioquímica, biofísica e biologia molecular oferecido pelo Instituto de Ciências Biológicas da UFG, Goiânia 2019/2. UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ENGENHARIA DE ALIMENTOS LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA AULA PRÁTICA 6: DOSAGEM DE AÇÚCAR REDUTOR PELO MÉTODO DE ADNS (ÁCIDO 3,5-DINITROSSALICÍLICO) Karolyne de Moraes Nunes 201703639 GOIÂNIA 2019 Introdução Um método empregado para quantificação de açúcares redutores é o ADNS (ácido 3,5-dinitrossalicílico). Tal método baseia-se na redução, em meio alcalino, para 3,5-dinitrosalicilato, obtendo como produto 3-amino 5-nitro salicilato. Pela estequiometria a máxima absorção da luz ocorre a 540nm. Materiais e Métodos · Solução padrão (glicose 5mM) · Solução problema (glicose 100mM) · Reativo: ADNS (ácido 3,5-dinitrossalicílico) · Água destilada · Pipetas graduadas · Tubos de ensaio · Espectrofotômetro · Banho-maria a 100°C · Vórtex Separou-se sete tubos de ensaio, enumerando-os de 1 a 5 e dois tubos denominados B e SP. O que foi adicionado em cada tubo encontra-se na tabela abaixo: Tubo Solução de glicose (mL) Água destilada (mL) ADNS (mL) B - 1,0 1,0 SP 0,1 0,9 1,0 1 0,2 0,8 1,0 2 0,4 0,6 1,0 3 0,6 0,4 1,0 4 0,8 0,2 1,0 5 1,0 - 1,0 Feito a adição de cada solução nos devidos tubos, agitou-se os tubos no vórtex pra que ocorresse uma melhor homogeneização.Aqueceu em banho-maria a 100°C por 5 minutos e resfriou os tubos em uma bacia com gelo. Completou o volume dos tubos para 15mL com água destilada. Em seguida, colocou-se 1mL de cada solução dos tubos em suas respectivas cubetas, para que fossem observadas no espectrofotômetro à 540nm. Resultados e Discussões Tubos Abs 540nm Concentração (mM) B 0,0 - SP 0,140 0,03 1 0,186 0,06 2 0,312 0,13 3 0,434 0,2 4 0,515 0,26 5 0,583 0,33 Os cálculos das concentrações usou a seguinte fórmula C1V1=C2V2. Dessa maneira a absorbância e as concentrações calculadas foram: A partir da tabela fez-se a curva padrão de glicídio redutores: Conclusão Pode-se dizer que obteve-se resultados satisfatórios. Observou-se que a concentração foi aumentando proporcionalmente com as leituras de absorbância feita no espectrofotômetro. Referências 1- Pereira, M. Roteiros das aulas práticas de bioquímica, biofísica e biologia molecular oferecido pelo Instituto de Ciências Biológicas da UFG. UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ENGENHARIA DE ALIMENTOS LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA AULA PRÁTICA 7: REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS Karolyne de Moraes Nunes 201703639 GOIÂNIA 2019 INTRODUÇÃO Uma proteína é um grande polipeptídeo, ou seja, resíduos de aminoácidos estão ligados entre si covalentemente, chamamos de ligação peptídica. É a união entre o grupo carboxila de um aminoácido com o grupo amina de outro aminoácido, liberando água. Esta sequência de aminoácidos é única para cada proteína específica e é determinada pelo gene. Todas contêm carbono, hidrogênio, nitrogênio e oxigênio, e quase todas contêm enxofre. Algumas proteínas contêm elementos adicionais, particularmente fósforo, ferro, zinco e cobre. Seu peso molecular é extremamente elevado. Todas as proteínas, independentemente de sua função ou espécie de origem, são construídas a partir de um conjunto básico de vinte aminoácidos, arranjados em várias seqüências específicas. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL MATERIAIS · Pipetas de 1mL (três), 2mL (três), 5mL; · 6 Tubos de ensaio (seis); · Banho-maria Béquer pequeno (100 mL); · Bastão de vidro; · Água destilada Clara de ovo diluída 4 vezes em NaCl 0,1%; · Ácido tricloroacético a 10%; · Acetato de chumbo a 10%; · Álcool etílico absoluto; · Cloreto de sódio 1,0 mol/L; · Solução saturadade sulfato de amônio (60%). METODOLOGIA Reações de precipitação com desnaturação Desnaturação pelo calor. Em um tubo de ensaio colocar 2mL da solução de clara de ovo e aquecer em banho-maria (2 a 3 minutos). Observar o resultado e anotar. Reação com acetato de chumbo. Em um tubo de ensaio colocar 1mL de solução de clara de ovo e 1mL de acetato de chumbo a 10%. Observar o resultado e anotar. Reação com álcool absoluto Em um tubo de ensaio colocar 1mL de solução de clara de ovo e álcool etílico absoluto até que se forme um precipitado. Observar o resultado e anotar. Reação com ácido tricloroacético (reagente dos alcalóides) Em um tubo de ensaio colocar 1mL da solução de clara de ovo e 1mL de ácido tricloroacético a 10%. Observar o resultado e anotar. Reação de precipitação sem desnaturação: "Salting-in" Em um tubo de ensaio colocar 3mL da solução de clara de ovo e acrescentar água destilada até que ocorra o aparecimento de um precipitado de globulinas. A seguir, acrescentar cloreto de sódio 1,0 mol/L até que ocorra a redissolução da proteína não desnaturada. Observar o resultado e anotar. "Salting-out" Em um tubo de ensaio colocar 5mL da solução de clara de ovo obtida no experimento anterior. Acrescentar 5mL de solução saturada de sulfato de amônio e observar a formação de precipitado. Acrescentar agora um pouco de água destilada para redissolver a proteína não desnaturada. Observar o resultado e anotar. RESULTADOS E DISCUSSÕES Tabela 01 – Dados experimentais das reações de precipitação com desnaturação. Reações de precipitação com desnaturação Resultado Desnaturação pelo calor Antes de aquecer estava túrgido, após o aquecimento ouve a potencialização da turgidez Reação com acetato de chumbo A solução se apresentou mais esbranquiçada Reação com álcool absoluto Com 1 mL uma parte precipitou. Com 2 ml houve a total precipitação Reação com ácido tricloracético Solução turva e com precipitações Tabela 02 – Dados experimentais das reações de precipitação sem desnaturação; Reações de precipitação sem desnaturação Resultado Salting-in 1 mL de água destilada 5 mL de cloreto Salting-out 20 mL de água destilada, não houve a completa dissolução e o tubo não comportou mais líquido CONCLUSÃO As reações de coloração e precipitação de proteínas permitem a caracterização dessas pela análise de suas propriedades químicas e físicas, como ligações peptídicas, solubilidade e estrutura molecular. Várias reações específicas são empregadas para detectar cada tipo de proteína, de forma qualitativa e, posteriormente, quantitativa. As reações de coloração não alteram a estrutura da proteína, ao contrário das reações de precipitação que podem alterar vários tipos de estruturas protéicas. Já as denominadas de “Salting in” e “Salting out” precipitam material sem ocorrer desnaturação. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Pereira, M. Roteiros das aulas práticas de bioquímica, biofísica ebiologia molecular oferecido pelo Instituto de Ciências Biológicas II daUFG. Goiânia. Disponível em: https://pt.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%ADna UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ENGENHARIA DE ALIMENTOS LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA AULA PRÁTICA 8,9,10,11 e 12: EFEITO DE CONCENTRAÇÃO DA ENZIMA EFEITO DO TEMPO DE INCUBAÇÃO AÇÃO ENZIMÁTICA: EFEITO DO pH AÇÃO ENZIMÁTICA: EFEITO DA TEMPERATURA EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO Karolyne de Moraes Nunes 201703639 GOIÂNIA 2019 Introdução Estruturalmente, as enzimas possuem todas as características das proteínas, tendo zonas da sua estrutura responsáveis pela catálise. A zona reativa da enzima é denominada centro ativo e é onde se liga o reagente (substrato) que vai ser transformado no produto. A catálise enzimática das reações é essencial para os sistemas vivos. Sob algumas condições a reação não catalisada tem a tendência de serem lentas quando comparadas com as catalisadas, como por exemplo, sem a catálise as reações necessárias para o metabolismo ocorreriam em um tempo muito maior que o necessário para a manutenção da vida. Por serem proteínas, cada enzima possui um pH ótimo e uma temperatura ótima de funcionamento. Quando expostas à condições extremas poderá sofrer desnaturação, ou seja, perde sua atividade. Materiais e Métodos Usou-se para fazer o experimento: · Enzima invertase (0,1 mg proteína/mL) · Tampão acetato 0,05M; pH 4,7 · Tampão citrato-fosfato 0,05M, pH 2,0 · Tampão acetato 0,05M, pH 4,0 · Tampão fosfato 0,05M, pH 6,0 · Tampão acetato 0,05M, pH 5,0 · Tampão fosfato 0,05M, pH 7,0 · Tampão fosfato 0,05M, pH 8,0 · Tampão fosfato 0,05M, pH 9,0 · Tampão bicarbonato 0,05M, pH 9,0 · Sacarose 0,01M,; 0,02M; 0,05M; 0,1M; 0,2 M · Reativo ADNS (ácido 3,5-dinitrossalicílico) · Pipetas · Tubos de ensaio · Banho maria · Espectrofotômetro Parte 1: Separou-se seis tubos de ensaio, o que foi adicionado em cada tubo encontra-se na tabela abaixo: Reativos 1 2 3 4 5 6 Tampão Acetato 0,05M pH 4,7 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Água destilada 1,0 0,9 0,8 0,6 0,2 - Sacarose 0,2M 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Invertase 0,1mg/mL - 0,1 0,2 0,4 0,8 1,0 Após adicionar cada solução nos respectivos tubos, incubou cada um por 5 minutos em temperatura ambiente. Passado os cinco minutos, adicionou-se 1,0mL de ADNS em cada tubo e fez-se o aquecimento em banho maria à 100°C por 5 minutos. Em seguida, acrescentou 6,5mL de água destilada em cada tubo e fez-se a leitura no espectrofotômetro a 540nm. Parte 2: Separou-se cinco tubos de ensaio, em cada tubo colocou-se: Reativos 1 2 3 4 5 Tampão acetato 0,05M pH4,7 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Água destilada 1,0 0,8 0,8 0,8 0,8 Sacarose 0,2M 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Invertase 0,1mg/mL - 0,2 0,2 0,2 0,2 Em temperatura ambiente incubou-se os tubos, o tubo 3 por 5 minutos, o tubo 4 por 10 minutos e o tubo 5 por 15 minutos. Adicionou-se 1,0mL de ADNS e aqueceu-se por 5 minutos em banho maria por 5 minutos, adicionou-se 6,5mL de água destilada em cada tubo e em seguida leu-se a absorbância no espectrofotômetro(540nm). Parte 3: Em diferentes 8 tubos de ensaio colocou-se: Reativos 1 2 3 4 5 6 7 8 Tampão citrato fosfato 0,05 pH 2,0 1,0 1,0 - - - - - - Tampão acetato0,05M pH 4,0 - - 1,0 - - - - - Tampão acetato 0,05M pH 5,0 - - - 1,0 - - - - Tampão fosfato 0,05M pH 6,0 - - - - 1,0 - - - Tampão fosfato ,0,05M pH 7,0 - - - - - 1,0 - - Tampão fosfato0,05M pH 8,0 - - - - - - 1,0 - Tampão bicarbonato 0,05M pH 9,0 - - - - - - - 1,0 Água destilada 1,0 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 Sacarose 0,02M 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Invertase 0,1mg/mL - 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Durante cinco minutos foram deixados o tubos incubados à temperatura ambiente, em seguida adicinou-se 1,0mL de ADNS em cada tubo e aqueceu-se em banho maria à 100°C por cinco minutos. Adicionou-se 6,5mL de água destilada em cada tubo. Levou ao vórtex para que ocorresse uma melhor homogeneização das misturas. E fez-se a leitura da absorbância(540nm). Parte 4: Em cinco tubos de ensaio colocou-se: Reativos 1 2 3 4 5 Tampão acetato 0,05M pH 4,7 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Água destilada 1,0 0,8 0,8 0,8 0,8 Sacarose 0,2M 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Invertase 0,1mg/mL - 0,2 0,2 0,2 0,2 Separou os tubos para que cada um fosse incubado à temperaturas diferentes durante cinco minutos: Tubo 2 à 25°C, tubo 3 à 37°C, tubo 4 à 55°C e tubo 5 à 100°C. Em seguida adicionou-se 1,0mL de ADNS em cada tubo e aqueceu-se novamente à 100°C por cinco minutos. Adicionou-se 6,5mL de água destilada em cada tubo, e homogeneizou-se no vórtex e fez-se a leitura da absorbância. Parte 5: Em seis tubos de ensaio colocou-se : Reativos 1 2 3 4 5 6 Tampão acetato 0,05M pH 4,7 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Água destilada 1,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 Sacarose 0,01M - 1,0 - - - - Sacarose 0,02M - - 1,0 - - - Sacarose 0,05M - - - 1,0 - - Sacarose 0,1M - - - - 1,0 - Sacarose 0,2M -- - - - 1,0 Invertase 0,1mg/mL 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Deixou por cinco minutos à temperatura ambiente, e em seguida adicionou-se 1,0mL de ADNS e aqueceu-se em banho maria por 5 minutos à 100°C. E por fim, adicionou-se 6,5mL de água destilada, homogeneizou-se e fez-se a leitura de absorbância. Resultados e Discussões Parte 1: Resultados 1 2 3 4 5 6 Absorbânci a (540nm) 0 1,236 1,199 0,736 1,087 1,358 Gráfico1: ABS x. Concentração de Enzimas Parte 2: Resultados 1 2 3 4 5 Absorbância (540nm) 0 0,602 1,715 1,783 1,793 Gráfico2: ABS x Tempo de incubação Parte 3: Resultados 1 2 3 4 5 6 7 8 Absorbância (540nm) 0 0,009 0,007 0,012 1,000 0,057 0,058 0,028 Gráfico3: ABS X pH Parte 4: Resultados 1 2 3 4 5 Absorbância (540nm) 0 1,42 1,58 1,71 0,778 Gráfico4: ABS x Temperatura Parte 5: Resultados 1 2 3 4 5 6 Absorbânci a (540nm) 40 442 695 1406 1560 1640 Gráfico5: ABS x Concentração do substrato Conclusão A velocidade de uma reação enzimática é proporcional à concentração de enzima, desde que não haja interferentes na reação e a concentração de substrato seja mantida. Mas como pôde ser observado, a velocidade das reações catalisadas por enzimas aumenta geralmente com a temperatura, dentro da temperatura em que a enzima não se desnatura, atingindo sua temperatura ótima. A partir dessa temperatura, a atividade enzimática diminui à medida que a temperatura é elevada. Por fim, pode-se dizer que os quatro experimentos foram bem sucedidos por apresentarem resultados esperados quando comparados com a literatura. Referências 1- Pereira, M. Roteiros das aulas práticas de bioquímica, biofísica e biologia molecular oferecido pelo Instituto de Ciências Biológicas II da UFG, Goiânia 2- Bianconi M. L.. Efeito de pH na Atividade Enzimática. Disponível em < http://www2.bioqmed.ufrj.br/enzimas/pH.html >. http://docentes.esalq.usp.br/luagallo/Enzimas2.htm UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ENGENHARIA DE ALIMENTOS LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA AULA PRÁTICA 13: EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE LIPÍDEOS Karolyne de Moraes Nunes 201703639 GOIÂNIA 2019 Introdução Lipídios apresentam um grande número de ligações C-H e possui poucos heteroátomos. Esta característica faz com que estas moléculas sejam pobres em dipolos localizados, sendo assim, lipídios são pouco solúveis em água ou etanol (solvente polares) e altamente solúveis em solventes orgânicos apolares. A classificação do lipídios é baseada na forma estrutural de seu esqueleto, possui duas divisões principais que são os lipídios simples (não possuem ácidos graxos) e lipídios complexos (possuem ácido graxos e diferem entre si pela posição do ácido). Materiais e Métodos Usou-se para fazer o experimento: · Ovo · Óleo de cozinha · Papel de filtro · Bastão de vidro · Funil · Pipeta de Pasteur · Placa de Petri · Banho-maria · Acetona · Ácido acético concentrado 5,0mol/L · Água destilada · Tubo de ensaio · Vórtex · Hidróxido de potássio Primeiramente fez-se a separação entre a gema e clara, descartando a clara. Colocou-se a gema em um béquer e adicionou-se 8,0mL de acetona e com o auxílio do bastão de vidro fez-se a homogeneização até que ocorresse a aglutinação do material. Acondicionou-se o papel de vidro ao funil e transferiu-se a amostra homogeneizada para o papel de filtro, em seguida adicionou-se mais 4,0mL de acetona , passando-o pelo papel de filtro. O material que foi filtrado foi colocado em uma placa de Petri e logo em seguida em banho maria à 100°C até que ocorresse a evaporação da acetona. Em um tubo de ensaio colocou-se 3,0mL de hidróxido de potássio alcoólico +1mL de óleo de cozinha + o conteúdo da placa de Petri contendo os lipídios extraídos anteriormente. Aqueceu-se o tubo por 15minutos à 90°C e anotou-se o que foi observado. Em outro tubo de ensaio, adicionou-se 2,0 mL de água destilada + 3,0mL do conteúdo do tubo anterior e homogeneizou-se no vórtex. Analisou o resultado. E por fim, adicionou-se 2,0mL de ácido acético concentrado no ultimo tubo preparado , gota a gota. Analisou o resultado. Resultados e Discussões Na primeira etapa, ao homogeneizar-se a gema com acetona, formou-se uma pasta que ao ser filtrada com acetona viu-se um liquido translúcido. Ao adicionar uma base forte ao ácido graxo extraído e sob aquecimento, o ácido graxo pode ser convertido em sabão. Por isso que ao adicionar hidróxido de potássio alcoólico foi possível a visualização de espumas. Após adicionar óleo de cozinha e colocá-lo em aquecimento houve a separação de fases, em que a fase aquosa ficava na superfície e o óleo na parte inferior. Acidificou-se o meio para para se acentuasse a saponificação, assim, evidenciou-se os resultados obtidos anteriormente. Conclusão Pode-se dizer que o experimento foi bem sucedido, mesmo que a extração do lipídios tenha sido pouca, mas foi possível a visualização da reação de saponificação, e as interações entre os compostos polares e apolares. Referências 1- Pereira, M. Roteiros das aulas práticas de bioquímica, biofísica e biologia molecular oferecido pelo Instituto de Ciências Biológicas II da UFG, Goiânia 2019/2. UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ENGENHARIA DE ALIMENTOS LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA AULA PRÁTICA 14: ANÁLISE ELETROFORÉTICA DE PROTEÍNAS Karolyne de Moraes Nunes 201703639 GOIÂNIA 2019 Introdução Eletroforese é uma técnica analítica utilizada na análise de macromoléculas como proteínas e ácidos nucléicos. O efeito eletroforético tem como base a teoria de dissociação eletrolítica, que aceita o fato de as partículas carregadas moverem-se sob a influência de forças eletrostáticas para um eletrodo de carga oposta quando é aplicada uma diferença potencial em uma solução contendo eletrólitos. Utiliza-se os géis de poliacrilamida para proteínas e agarose para os ácidos nucleicos, em virtude de estes polímeros funcionarem como uma peneira molecular, ou seja, separar as espécies em função de sua massa e tamanho molecular, respectivamente, inibe a propagação do calor em virtude do atrito causado pela migração e pela aplicação do campo elétrico. A poliacrilamida é um polímero obtido que absorve muita quantidade de água sendo por isso um hidrogel. A utilização do ácido acético durante o experimento é tem como princípio separar as proteínas dos demais compostos presentes. Materiais e Métodos · Amostra de proteínas · Acrilamida · Bis-acrilamida · Tampão de amostra · Tampão de corrida · Azul de Coomassie · Ácido acético glacial · Álcool metílico · Persulfato de amônia · Pipeta automática · Tubos “eppendorf” · Marcador de Massa Molecular de proteínas · Cuba de eletroforese: placa de vidro · Fonte de eletroforese 1. Distribuir 20 μL da amostra de proteínas em um tubo “eppendorf”e adicionar 20 μL de tampão de amostra, homogeneizar no vortex e centrifugar por 2 minutos a 2.000 rpm na micro centrífuga. 2. Preparar o gel de acrilamida e posicioná-lo na cuba de eletroforese (esquema em anexo). Preencher a cuba de eletroforese com o Tampão de Corrida. Conectar a cuba de eletroforese a fonte de alta voltagem.(ver imagem 1) 3. Aplicar 20 μL da amostra de proteínas (item 1) em cada poço do gel. Ligar a fonte de eletroforese. 4. Parar a corrida eletroforética quando o azul de bromofenol chegar ao final do gel. 5. Incubar o gel na solução corante por 18 h sob agitação. 6. Incubar o gel na solução descorante até visualizar as bandas de proteínas. (ver imagem Imagem 1: Imagem 2: Resultados e Discussões Usa-se a solução tamponada para que o meio não se torne ácido de modo que não mude as cargas das proteínas modificando o resultado final. O ácido acético glacial e o álcool metílico são usados para que ocorra o descoramento do gel pois consegue separar a proteína dos demais compostos. Conclusão Pode-se dizer que a eletroforese é um método preciso quando feito corretamente, sendo considerado o principal método de separação de proteínas. Referências 1- Pereira, M. Roteiros das aulas práticas de bioquímica, biofísica e biologiamolecular UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ENGENHARIA DE ALIMENTOS LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA AULA PRÁTICA 15: EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS DO MORANGO Karolyne de Moraes Nunes 201703639 GOIÂNIA 2019 Introdução As paredes celulares das células vegetais são compostas essencialmente por polissacarídeos. As pequenas estruturas celulares são compostas por substâncias com diferentes propriedades químicas, pelo que os procedimentos experimentais devem ser definidos de como a separar um determinado constituinte celular das restantes partes, sem causar muitos danos. Cerca de 99% do DNA encontra-se no núcleo da célula. Os nucleotídeos estão presentes em vários processos metabólicos e são tidos como subunidades dos ácidos nucléicos, participam do transporte e na conservação de energia (ATP), são encontrados como componentes de alguns co-fatores enzimáticos e alguns apresentam a função de mensageiros químicos celulares. Quando pica-se a morango, suas células grandes de rompes e o seu DNA se amplia, desse modo usou-se a morango para realização do experimento. Materiais e Métodos Usou-se para fazer o experimento: · Morango · Gaze · Bastão de vidro · Faca · Funil · Béquer · Cloreto de sódio · Detergente · Álcool etílico · Água destilada · Banho-maria · Cuba de gelo Primeiramente picou-se o morango e colocou-se, em um béquer, detergente + água destilada + cloreto de sódio, mexeu-se até que o cloreto de sódio fosse dissolvido. Adicionou-se a morango picada à solução contida no béquer e o aqueceu por 15minutos à temperatura de 60°C. Após esses 15 minutos, colou o béquer em um banho de gelo por mais 5 minutos. Usando o almofariz, triturou o morango que estava presente no béquer com a solução. Colocou o morango tritura na gaze adaptada ai funil, e a filtrou com a solução do béquer. O álcool etílico foi colocado (ainda gelado) à solução filtrada, até que ocorresse a formação de duas fases. Resultados e Discussões O detergente dissolve as membranas lipídicas além de desintegrar os núcleos e os cromossomos das células do morango, liberando o DNA.Com a ruptura das membranas, o conteúdo celular, incluindo DNA e proteínas, soltam-se e dispersam- se na solução. Um dos componentes do detergente, o lauril sulfato de sódio, desnatura as proteínas, separando-as do DNA cromossômico. A adição de sal, no início da experiência, proporcionou ao DNA um ambiente favorável. O sal contribui com íons positivos Na+ que neutralizam a carga negativa do DNA. Nessa forma, o DNA precipita na solução aquosa. O álcool gelado, além de proporcionar uma mistura heterogenia (duas fases), em ambiente salino, faz com que as moléculas de DNA se aglutinem, formando uma massa filamentosa e esbranquiçada. Conclusão Pode-se dizer que o experimento foi realizado com sucesso, pois foi possível a visualização de 1 fio viscoso de DNA. Referências 1- Pereira, M. Roteiros das aulas práticas de bioquímica, biofísica e biologia molecular oferecido pelo Instituto de Ciências Biológicas II da UFG, Goiânia. ABS x Concentração Série 1 1.0000000000000005E-2 2.0000000000000011E-2 0.05 0.1 0.2 1236 1199 736 1087 1358 Concentração ABS ABS x pH Série 1 2 3 4 5 6 7 8 9 9.0000000000000028E-3 7.0000000000000062E-3 7.0000000000000062E-3 1.2E-2 1 5.7000000000000023E-2 5.8000000000000003E-2 2.8000000000000001E-2 pH ABS ABS x Temperatura Série 1 25 37 55 100 1.42 1.58 1.71 0.78 Temperatura (ºC) ABS ABS x Concentração Série 1 1.0000000000000005E-2 2.0000000000000011E-2 0.05 0.1 0.2 442 695 1406 1560 1640 Concentração ABS Absorbância x comprimento de onda Série 1 415 445 460 490 520 535 550 580 610 640 4.1000000000000002E-2 4.6000000000000013E-2 5.4000000000000034E-2 9.300000000000018E-2 0.18100000000000019 0.26400000000000001 0.36500000000000032 0.65500000000000103 0.38500000000000045 2.4000000000000014E-2 Absorbância x concentração Série 1 0 2.0000000000000022E-3 4.0000000000000044E-3 6.0000000000000045E-3 8.0000000000000106E-3 1.0000000000000005E-2 0 0.113 0.18500000000000014 0.24300000000000013 0.39600000000000041 0.52700000000000002 Concentração Absorbância NaOH x pH Valores Y -- 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1.32 1.3900000000000001 1.53 1.6900000000000011 1.84 2.0499999999999998 2.2799999999999998 2.54 2.9 4.5599999999999996 8.8800000000000008 9.49 9.81 10.07 10.39 10.57 10.870000000000006 11.29 11.81 12.350000000000009 12.450000000000006 12.629999999999999 12.719999999999999 12.8 12.870000000000006
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