Estudo Dirigido

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TECNOLOGIA GENÉTICA
ESTUDO DIRIGIDO
Nomes: 
Coleta
O material será coletado através da punção venosa de uma região lateral do calcanhar da criança, após a coleta do material o mesmo é colocado em papel filtro (Papel Absorvente) e papel alumínio com identificação para então ser encaminhado para análise em laboratório. 
Cuidados com a amostra após a secagem:
· Colocar na geladeira mantendo guardados em envelopes ou plásticos, para evitar a exposição;
· Vedar completamente a embalagem;
· Não os deixar expostos ao sol, evitando ressecamento;
· Evitar deixar próximo de locais úmidos.
MANUAL DE INSTRUÇÕES DO TESTE DO PEZINHO. IJC – Instituto Jô Clemente, 2020. Disponível em: https://www.ijc.org.br/pt-br/teste-do-pezinho/profissionais-de-saude/Paginas/manuais-e-orientacoes.aspx Acesso em: 07 de setembro de 2021.
Extração de DNA
Técnica de extração por Kit Comercial por Colunas da NeoScience®️, de acordo com as instruções do fabricante.
Reagentes:
· Amostra de sangue 500µL
· Proteinase K 20U/mg 20µL
· Tampão 1,3 200µL
· Etanol absoluto 200µL
· Tampão 3,1 500µL
· Tampão 4,1 700µL
· Tampão 5,1 40µL
· Tampão 5,1 30µL
· Solução de Hidratação 50µL
CARDOSO, Daniela et al. Extração de DNA a partir de sangue humano coagulado para aplicação nas técnicas de genotipagem de antígenos leucocitários humanos e de receptores semelhantes a imunologia. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. Dez 2009
Quantificação
A quantificação do gene PAH será feita antes para se ter a verificação da qualidade e da quantidade do material, sendo feita por espectrofotometria, o DNA será colocado para a absorção de luz em solução no comprimento de onda de 260 nm. A cada 50 µg de DNA é o que se equivale a 1,0 (A) de absorbância de luz. 
PRIMON, Jenifer Kogin, NARDIN, Jeanine Marie. QUANTIFICAÇÃO E QUALIDADE DE EXTRAÇÃO DE DNA DE CAMADA LEUCOCITÁRIA (BUFFY COAT) DE SANGUE HUMANO. Evince Evento de Iniciação Científica, Curitiba, 2015.
VACCARO, Tamara da Silva. IDENTIFICAÇÃO DE MUTAÇÕES FREQUENTES NO GENE DA FENILCETONURIA HIDROXILASE POR PCR EM TEMPO REAL. Porto Alegre, junho de 2008.
QUANTIFICAÇÃO DE DNA: O QUE PODE INFLUENCIAR NA QUALIDADE DA AMOSTRA. kasvi, 2019. Disponível em: https://kasvi.com.br/quantificacao-de-dna-influenciar-qualidade-amostra/. Acesso: dia 07 de setembro de 2021.
PCR Convencional
Uma porção de 2465 nucleotídeos será amplificada por PCR convencional, utilizando os primers: 5 TCTTCTCCTCCCTAGTGCGA 3 e 5 TTGAGTGTCACAAGGAGCCC 3. As amostras de DNA foram amplificadas para o gene PAH, utilizando 2μL de DNA; 11,34μL de H2O; 7,50μL de Taq Buffer 10X (Fermentas, USA); 4,44μL de MgCl2 25mM (Fermentas, USA); 13,5μL de dNTP 2mM (Fermentas, USA); 1,00μL de cada oligonucleotídeo 1ng/μL; 0,90μL de Taq DNA Polymerase (Fermentas, USA), em um volume final de 50μL. A amplificação foi efetuada em aparelho ciclador de temperatura e consistiu de uma etapa de desnaturação inicial à 94 º C por 1 minuto, seguida de 30 ciclos de: 58º C por 1 minuto, temperatura ideal e variável para cada primer por 2 minutos , 72º C por 1 minuto e extensão final de 72º C por 10 minutos (GIUSTI B, et al. 1999).
POLLICE. Erika. CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DA FENILCETONÚRIA EM PACIENTES DA REGIÃO DE CAMPINAS. Campinas, p.37, 2008.
Sequência de Primers utilizados
Eletroforese
Primeiro é preparado o gel com 1,5% de agarose referente a concentração apropriada de DNA 2465. Sobre a solução ainda morna foi colocado um pente para fazer os poços no gel. É colocada as amostras de DNA no tampão com o glicerol por cima, tudo isso a uma voltagem de 70 V.
CORRÊA, Elisete Marcia, POSSIK, Patrícia Abrão. A ANÁLISE DE DNA POR ELETROFORESE. [s.d.]