Técnicas de Cultura e Isolamento

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ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA
AULA 02: TÉCNICAS DE SEMEADURA E ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS
TÉCNICAS DE SEMEADURA E ISOLAMENTO DE MICRO-ORGANISMOS
Isolamento de um microrganismo: O isolamento consiste na obtenção de uma cultura pura (colônias isoladas de um único microrganismo, separando-o de outros que se encontram no mesmo material).
Finalidades do isolamento:
· Identificação de um micro-organismo: A simples observação de caracteres morfológicos não é suficiente para a identificação e classificação dos microrganismos. Para isto lançamos mão da análise de uma série de características destes como: características bioquímicas, sorológicas, de patogenicidade, e etc. O estudo destas características está na dependência do microrganismo que se pretende identificar.
· Semeadura: Consiste no plantio de um microrganismo em um meio de cultura, a partir de um material contaminado qualquer.
· Repique: Consiste na transferência de um microrganismo de um meio de cultura para outro.
Objetivos:
Após a realização da atividade prática você será capaz de:
· executar e determinar a finalidade das principais técnicas de semeadura de bactérias em diferentes meios (líquidos, semi-sólidos e sólidos), tanto em tubos quanto em placas;
· caracterizar os diferentes meios de cultura e a finalidade de cada um;
· identificar e executar as técnicas de assepsia em laboratório.
Material:
Para a atividade prática serão utilizados:
- Placa de Petri com Agar;
- Tubo com Agar inclinado;
- Tubo com Agar semi-sólido;
- Cultura bacteriana em caldo e em Agar;
- Alça bacteriológica.
Técnica de semeadura ou repique de bactérias em meio líquido:
· Fazer a desinfecção da área de trabalho e anti-sepsia das mãos ANTES e DEPOIS de qualquer trabalho. (1)
· Trabalhar SEMPRE na área de segurança: uma área de aproximadamente 10 cm ao redor da chama do bico de Bunsen. (2)
· Esterilizar adequadamente todo material (p.ex.: alças e agulhas bacteriológicas) ANTES e DEPOIS de seu uso à sempre aquecer da base para a ponta, evitando a formação de aerossóis. (3)
· Flambar a boca dos frascos e tubos ANTES e DEPOIS das inoculações, evitando a contaminação da cultura/material a ser analisado e garantindo que somente o microorganismo desejado será inoculado. (4)
1- Segurar a alça com a mão direita, flambar primeiro na chama azul, depois na amarela. Esperar esfriar (a alça é flambada na posição vertical e deverá ficar atrás da chama para proteção do operador).
2- Retirar a rolha de algodão do tubo que contem o microrganismo a ser semeado ou repicado (que deverá estar na mão esquerda) utilizando-se o dedo mínimo da mão direita. A ROLHA DEVERÁ PERMANECER SENDO SEGURA COM O DEDO MÍNIMO, ATÉ O FINAL DA OPERAÇÃO.
3- Flambar a boca do tubo, e retirar o inóculo com a alça fria.
4- Flambar novamente a boca do tubo e fechar. 
5- Pegar o tubo onde se irá realizar a semeadura, retirar a rolha e flambar.
6- Semear o material, flambar a boca do tubo e fechar. 
7- Esterilizar a alça, identificar o tubo semeado e levar para incubação em estufa.
De acordo com as características físicas dos meios de origem e destino, além da finalidade da inoculação, podem-se utilizar diferentes técnicas de inoculação. A transferência de inóculo de um meio para outro também é denominada genericamente como repique.
A seguir, veremos quais são as técnicas de inoculação:
SEMEADURA EM MEIOS SÓLIDOS
1.Complete a tabela abaixo, seguindo modelo:
	
Meio inclinado em
tubos
	
	MODELO: 
Estria sinuosa: semear com alça ou agulha bacteriológica, em zig-zag, partindo da base para a
extremidade do bizel (superfície inclinada do meio).
Objetivo: obtenção de intensa massa de micro-organismos
Estria Reta: semear com agulha bacteriológica, fazendo uma linha reta, com cuidado de não ferir o
Agar, partindo da base para a extremidade do bizel (superfície inclinada do meio).
	
	
	Picada Central: semear com agulha bacteriológica, no centro do Agar. Dependendo da finalidade, o inóculo deve penetrar até 2/3 do tubo ou até o fundo deste.
	
Meio em camada
alta
	
	Picada em Profundidade: semear com agulha bacteriológica, no centro do Agar. Dependendo da finalidade, o inóculo deve penetrar até 2/3 do tubo ou até o fundo deste.
	
Meio em placa de
Petri
	
	Pour-plate ou disseminação (método em profundidade): Transferir 1 ml da cultura para placa de Petri vazia, colocar 10 – 20 ml do meio fundido (e resfriado a cerca de 45 – 50°C) sobre a cultura e homogeneizar suavemente com movimentos circulares.
 
	
	
	Estria simples: transferir uma alçada da cultura para meio sólido em placa e estriar com a alça bacteriológica sobre o meio.
A estria pode ser realizada em movimento de zigzag (estria sinuosa) ou como uma linha reta sobre o meio (estria reta).
 
	
	
	Esgotamento em estrias ou estrias múltiplas: transferir uma alçada da cultura para meio sólido em placa e estriar com a alça bacteriológica sobre o meio. A placa é dividida em 4 quadrantes e a inoculação pode ser feita de 2 tipos: a) em 3 estrias: estriar em metade da placa, com movimentos de zig-zag. Quando atingir a metade, girar a placa 90° e estriar até a metade (1/4 da placa), girar mais 90° e estriar o meio restante. b) em 4 estrias: estriar até 2/3 da metade da placa, girar 90°, estriar 2/3 do próximo quadrante (1/4 da placa), girar 90°, estriar mais 2/3 do próximo quadrante (1/4 da placa), girar 90° e estriar o restante do meio.
 
SEMEADURA EM MEIOS SEMI-SÓLIDOS
	
	Picada em Profundidade: semear com agulha bacteriológica, no centro do Agar. Dependendo da finalidade, o inóculo deve penetrar até 2/3 do tubo ou até o fundo deste.
SEMEADURA EM MEIOS LÍQUIDOS
	
	Difusão: uma alçada da colônia (Agar em placa) ou da cultura (de outro meio ou líquido) é introduzida no meio líquido, com agitação da alça, para maior difusão dos micro-organismos (da alça para o meio e homogeneização no meio). Pode-se inclinar o tubo a 30° e esfregar o inóculo na parede do mesmo, quando o
tubo retornar à posição original o inóculo se difundirá no meio.
 
EXECUÇÃO DA PRÁTICA
a) A partir de cultura em placa:
1. A partir de um crescimento isolado obtido em placa, pegar uma colônia com auxílio de uma alça bacteriológica e transferir para o tubo com caldo, através do processo de difusão.
b) A partir de cultura em caldo:
A partir de um crescimento obtido em caldo, realizar as seguintes inoculações:
1. Com auxílio de uma alça bacteriológica, transferir o inóculo para o tubo com outro caldo, através da técnica de difusão.
2. Com auxílio de uma alça ou agulha bacteriológica, transferir o inóculo para o tubo com Agar inclinado, através da técnica de estria (sinuosa ou reta). 
3. Com auxílio de uma alça bacteriológica, transferir o inoculo do caldo para a placa com Agar, através da técnica de esgotamento em estrias (3 ou 4 estrias). 
O sucesso da semeadura está em: 
a) grande número de estrias;
b) não perfurar o meio; 
c) não voltar a alça sobre a estria 
d) pegar pequena quantidade de material para semear.
4. Com auxílio de uma agulha bacteriológica, transferir o inóculo para o tubo com Agar semisólido, através da técnica de picada central. A inoculação deverá ter a profundidade de 2/3 do meio e não deverá ser mais do que uma única picada.
5. Técnica de semeadura em placa pour-plate.
A técnica da semeadura em placa pour-plate pode ser realizada com o objetivo de se obter colônias isoladas (estudo qualitativo) ou para realizar a contagem de colônias em placa (estudo quantitativo). 
Materiais: meio líquido contendo E.coli; seis tubos de ensaio com solução salina estéril; 10 placaa de petri estéreis; 200 ml de meio de cultura Agar nutriente fundido, pipeta estéril de 0,1mL.
· Realizar diluição seriada 10-1 ate 106
· Transferir 1 mL da cultura em caldo de E. coli para o tubo 1.
· Agitar o tubo 1 e transferir 1 mL dessa suspensão para o tubo 2. Repita o procedimento até o tubo 6.
· Pipetar 100microlitros dos tubos 10-4; 10-5 e 10-6 em placas de Petriestéreis.
· Verter o meio PCA com cuidado sobre as placas contendo as diluições.
· Homogeneizar o meio e a cultura; 
· Esperar solidificar, inverter a placa e incubar a 37o C, por 18-24 h. 
· Proceder à contagem de colônias (a placa deve ter 30 a 300 colônias no máximo, para ser possível a contagem).
· Calcular o número de unidades formadoras de colônias/mL.
Resultado: 
Deixar os cálculos indicados no espaço abaixo:
 (
Nas placas de diluição 10E-1, 10E-2, 10E-3 e 10E-4 foram impossíveis de se fazer a contagem de colônia devido ao seu 
numero
 elevadíssimo. Na placa de 10E-5 foram 76 
colonias
 e na placa de 10E-6 foram 23 
colonias
 
Metodologia da Pour-
plate
 diz que só se pode usar placas onde as colônias são acima de 30 à 300. 
Foram 76 
colonias
 em 500 microlitros, portanto 152 
colonias
 em 1 
mL
.
152 
colonias
 multiplicado pelo fator de diluição da placa (10E+5)
152*10^5 = 15.200.000 
= 1
,52x10^7
)
6. Leitura dos experimentos de semeadura.
MEIO LÍQUIDO
Para realizar a leitura dos resultados desta técnica devem-se observar os seguintes itens: 
a) Quantidade de crescimento: pode ser escassa, moderada ou abundante. 
b) Distribuição de crescimento no meio de cultura: pode ter crescimento uniformemente distribuído (nitidamente turvo); crescimento confinado à superfície do meio como uma espuma ou filme (película); ou crescimento acumulado como sedimento que pode ser granuloso ou viscoso. 
c) Odor: pode ser pútrido, aromático, ou desprezível. Registrar os resultados no quadro abaixo:
	Cultura bacteriana em meio líquido para meio líquido
	BACTÉRIA
	ITEM
	
	a) MODERADA
	
	b) CRESCIMENTO UNIFORMEMENTE DISTRIBUIDO
COM UM POUCO MAIS DE SEDIMENTAÇÃO
	
	c) PÚTRIDO. DESAGRADAVEL
	Cultura bacteriana em placa para meio líquido
	BACTÉRIA
	ITEM
	
	a) MODERADA
	
	b) CRESCIMENTO UNIFORMEMENTE DISTRIBUIDO
	
	c) PÚTRIDO, DESAGRADÁVEL
MEIO ÁGAR INCLINADO
Para avaliar a leitura dos resultados desta técnica deve-se observar os seguintes itens: 
a) Quantidade: pode ser descrita como escassa, moderada ou abundante.
b) Margem ou bordos do crescimento: pode ser descrita como uniforme ou nítida, ou mostrando várias irregularidades.
c) Consistência da massa de crescimento: pode ser butírica ou de consistência semelhante à de manteiga, facilmente removível com a alça de platina: viscosa ou mucóide; seca ou quebradiça.
d) Cromogênese ou pigmentação: pode ser opaca, translúcida ou com pigmento.
	BACTÉRIA
	ITEM
	
	a) MODERADA
	
	b) BORDAS IRREGULARES
	
	c) VISCOSO 
	
	PIGMENTO AMARELADO
MEIO SEMI SÓLIDO
O modo de se observar um resultado quando utiliza-se esta técnica é o seguinte: 
Resultado positivo: há crescimento por todo o meio de cultura, semelhante a um "pinheiro invertido". 
Resultado negativo: há crescimento somente no local da inoculação. Registrar o resultado no quadro abaixo:
	Bactéria
	Resultado
	
	 RESULTADO NEGATIVO
MEIO DE CULTURA SÓLIDO EM PLACA
RESULTADO:
Quando há desenvolvimento de colônias isoladas na superfície do meio, considera-se o isolamento correto. Neste método verificam-se as características de colônias quanto aos seguintes aspectos: 
a) tamanho: o tamanho das colônias varia desde dimensões muito pequenas (puntiformes), com apenas uma fração de milímetros de diâmetro, até colônias muito grandes, com 5 a 10 mm de diâmetro. 
b) borda: a periferia das colônias bacterianas pode formar muitos desenhos diferentes, dependendo da espécie. Pode ser inteira, ondulada, lobulada, denticulada ou franjada. 
c) elevação: as colônias podem ser achatadas, espraiadas, convexas (baixa e alta), umbilicada, centro saliente. 
d) cromogênese ou pigmentação: opaca, translúcida ou com pigmento. 
e) forma: as colônias podem ser circulares, irregulares ou rizóides. 
f) consistência da massa de crescimento: pode ser butírica ou de consistência semelhante à da manteiga, facilmente removível com a alça de inoculação: viscosa ou mucóide; seca ou quebradiça. 
Anotar seus resultados no quadro abaixo:
	BACTÉRIA
	ITEM
	
	a) MEDIANAS = APROXIMADAMENTE 3mm
	
	b) BORDAS INTEIRAS
	
	c) COLONIAS ACHATADAS
	
	d) COLORAÇÃO ROSA AVERMELHADAS
	
	e) FORMA CIRCULAR, REGULARES
	
	f) VISCOSA 
7. Qual a função dos meios de cultura?
São nutrientes que ajudam no crescimento e desenvolvimento de microrganismos fora do seu habitat natural 
8. Como são os meios de cultura quanto:
a) Estado físico: Podem ser classificados em: Sólidos (ágar), semissólidos, líquido (caldo)
b) Procedência dos constituintes: Naturais ou Complexos
c) Composição química: Entre os principais se encontram fontes de carbono e energia (acucares), fontes de nitrogênio, fósforo e sais minerais. Por muitas vezes vitaminas, aminoácidos entre outros de acordo com o microrganismo a ser cultivado
d) Finalidade bacteriológica/micológica:
Meios de pré-enriquecimento – permite dessensibilização; Meios de Enriquecimento – proporciona nutrientes adequados para o crescimento; Diferenciais – quando contem substancias que permitem estabelecer diferenças entre microrganismos muito parecidos; Seletivos – contem substancias que inibem o desenvolvimento de determinados grupos de microrganismos; Meios de triagem – avaliam determinadas atividades metabólicas permitindo caracterização e identificação; Identificaçao – presta-se para realizações de provas bioquímicas e verificação de funções fisiológicas para organismos submetidos a identificação; Dosagem – empregados na determinação de vitaminas, antibióticos e aminoácidos; Contagem – determinação quantitativa da população microbiana; Estocagem / Manutencao – Conservação de microrganismos no laboratório 
9. Quais são as exigências básicas para o crescimento microbiano?
São 4 condicoes físicas principais que influenciam o crescimento de um microrganismo. Temperatura, pH, atmosfera gasosa e pressão osmótica, combinado a isso vem os nutrientes apropriados e condições físicas adequadas.
10. Utilizando um cotonete estéril, um aluno recolheu bactérias da garganta de outro aluno. Qual das técnicas de semeadura apresentadas seria adequada para obtenção de uma cultura pura?
Metodologia de Pour-plate, apesar de ser mais trabalhosa, dificulta a visualização de microrganismos que produzem micélio, porém é muito mais exata. Comumente utilizada na analise de alimentos também.
11. Pesquise e explique as técnicas que podem ser utilizadas para armazenamento/preservação de bactérias? 
Existem inúmeras técnicas para a preservação de bactérias, dentre elas:
Glicerol – funcionando como um bom crioprotetor, deve ser adicionado em concentrações finais entre 15% a 20% em um período de 6 a 12 meses
Papel filtro – Em situações específicas. Consiste na colonização de fragmentos de papel filtro para o armazenamento das bactérias.
Silica Gel – Ele inibe o metabolismo, evita o crescimento fúngico e é fácil recuperar as culturas.
Repicagem periódica ; secagem; água destilada esterilizada; preservação em órgãos vegetais infetados .