Oncologia 1

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Niely Henriques – 4Med 2021.1
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Oncologia – Tutoria 1
CICLO CELULAR
· Duplicação + divisão
· A função básica do ciclo celular é duplicar o DNA nos cromossomos e segregar as cópias em duas células-filhas geneticamente idênticas.
 - Duplicação dos cromossomos – fase S – 10 a 12h
 - Segregação dos cromossomos e divisão celular – fase M – 1h.
· Os ciclos celulares possuem fases de intervalo – a fase G1 entre a fase M e a fase S, e a fase G2 entre a fase S e a mitose.
 - Retardo de garantia de crescimento celular e monitoração dos sinais externos e internos.
· A fase G1 é especialmente importante. 
Sua duração pode variar imensamente, dependendo das condições externas e de sinais extracelulares de outras células – ponto de restrição.
ETAPAS DO CICLO
Interfase + divisão celular (mitose ou meiose) + citocinese.
FASES DE INTERVALO
Intervalo de tempo para a célula monitorar o ambiente interno e externo a fim assegurar que as condições estão adequadas para continuar o ciclo.
· Se as condições extracelulares forem desfavoráveis as células retardam a progressão a G1 e podem entrar em um estado de repouso especializado conhecido como G0 (G zero), no qual podem permanecer por dias, semanas ou mesmo anos antes que a proliferação seja retomada.
· Em G0, a célula não está ativamente se preparando para dividir, está apenas desempenhando suas funções.
· Se as condições extracelulares são favoráveis e os sinais para crescer e se dividir estão presentes, as células no início de G1 ou G0 avançam até́ um ponto de comprometimento próximo ao fim de G1 conhecido como ponto de restrição.
· A fase G2 corresponde ao intervalo entre o fim da replicação do DNA (fase S) e o começo da mitose.
· Na G2 continua a síntese de proteínas iniciada em G1: RNA, proteínas não-histônicas que se associam ao cromossomo durante a condensação na mitose, de outras moléculas necessárias para que ocorra a mitose, bem como ocorre a duplicação de organelas constituintes do citoplasma, que resulta em aumento celular.
FASE S
Ocorre a autoduplicação do DNA, depois disso, a célula está pronta para dividir em duas novas células, que serão idênticas.
MITOSE
Uma célula dividindo-se por mitose dará origem a duas outras células, com o mesmo número de cromossomos da célula inicial em um processo contínuo.
· Prófase – fase inicial: os centríolos já duplicados afastam-se para os polos, formam se as fibras do áster e as fibras do fuso mitótico; O nucléolo se desintegra e o RNAr é distribuído pela célula; A membrana do núcleo se desorganiza; os cromossomos já espiralizados se prendem as fibras do fuso pelo centrômero.
· Obs: A prometáfase inicia de forma abrupta com a fragmentação do envelope nuclear. Os cromossomos podem, então, ligarem-se aos microtúbulos do fuso via seus cinetócoros e entrar em movimento ativo.
· Metáfase – fase meio: os cromossomos são alinhados na placa equatorial do fuso, entre os polos do fuso. Os microtúbulos do cinetócoro ligam-se às cromátidesirmãs em polos opostos ao fuso.
· Anáfase – fase deslocamento: as cromátides-irmãs separam-se de forma sincronizada para formar dois cromossomos-filhos, e cada um é puxado lentamente em direção ao polo do fuso. Os microtúbulos do cinetócoro ficam menores e os polos do fuso também se afastam; ambos os processos contribuem para a segregação cromossômica.
· Telófase - fase fim: os cromossomos se desespiralizam. Refaz-se a membrana nuclear (carioteca) a partir do retículo endoplasmático; Novos nucléolos são produzidos. Ocorre então a cariocinese (divisão do núcleo) e citocinese (divisão do citoplasma) com a separação das duas células filhas.
· Após a mitose as células-filhas entram na fase G1 e recuperam o conteúdo de DNA das células diploides (2c).
SISTEMA DE CONTROLE DO CICLO
Aciona os eventos do ciclo celular em uma sequência determinada.
 - É rigidamente programado para fornecer uma quantidade fixa de tempo para a realização de cada evento.
Maus funcionamentos geram sinais que ativam o sistema de controle e assim retarda a progressão do ciclo, permitindo correções.
· O sistema de controle do ciclo celular tem como base em uma série conectada de interruptores bioquímicos, cada um dos quais inicia um evento específico do ciclo celular.
· Interruptores bioquímicos:
 - Binários (ativo/inativo).
 - Desencadeiam eventos de maneira completa e irreversível.
 - Altamente adaptável: pode ser modificado para se adequar a tipos celulares específicos e para responder sinais intra e extracelulares.
· Controle em 3 principais pontos de transição:
 - Início – ponto de restrição – final de G1 – célula se compromete a entrada no ciclo e duplicação do DNA.
 - Transição G2/M – sistema de controle dispara um evento mitótico precoce que leva ao alinhamento do cromossomo no eixo mitótico da metáfase.
 - Transição entre metáfase e anáfase – o sistema de controle estimula a separação das cromátides irmãs, levando a conclusão da mitose e citocinese.
· Os componentes centrais do sistema de controle do ciclo celular são membros de uma família de cinases conhecidas como cinases dependentes de ciclinas (Cdk).
 - A atividade dessas cinases aumentam e diminuem à medida que a célula avança no ciclo.
 - Mudanças cíclicas na fosforilação de proteínas que iniciam ou regulam os principais eventos do ciclo.
 - Ex.: aumento da atividade da Cdk em G2/M aumenta a fosforilação de proteínas que controlam a condensação de cromossomos, rompimento do envoltório nuclear, agrupamento no eixo etc.
· A mudança cíclica de atividades da Cdk é controlada por enzimas e proteínas, principalmente pela Ciclina.
 - Se ligam às Cdks para transformá-las em quinases.
 - As ciclinas sofrem um ciclo de síntese e degradação a cada ciclo celular.
 - Os níveis cíclicos de ciclina resultam no agrupamento e ativação dos complexos ciclina-Cdk.
 - Existem 4 classes de ciclinas – cada uma de um estágio do ciclo.
· Classes de ciclina:
 - G1/S-ciclina: ativam Cdks no final de G1 e desencadeiam a progressão ao Início – comprometimento à entrada no ciclo.
 - S-ciclina: se ligam a Cdks logo após a progressão ao Início e ajudam a estimular a duplicação dos cromossomos, também contribuem ao controle de alguns eventos mitóticos iniciais.
 - M-ciclina: ativam Cdks que estimulam a entrada na mitose na transição G2/M.
 - G1-ciclina: ajuda a regular as atividades das G1/S-ciclinas, as quais controlam, no final de G1, a progressão ao Início.
· A proteína ciclina não somente ativa sua Cdk parceira, mas também a direciona para proteínas-alvo específicas
 - Cada complexo de ciclina-Cdk fosforila um conjunto diferente de proteínas-substrato.
 - O mesmo complexo pode induzir efeitos diferentes em diferentes tempos do ciclo, pois a acessibilidade de alguns substratos à Cdk muda durante o ciclo.
EXTRA
- Na ausência de ciclinas, o sítio ativo na proteína Cdk é parcialmente obstruído por uma alça proteica.
- A ciclina ligada faz a alça se mover do sítio ativo, resultando em uma ativação parcial da enzima Cdk.
- A ativação total do complexo de ciclina-Cdk ocorre quando uma outra cinase, a cinase ativadora de Cdk (CAK), fosforila um aminoácido próximo à entrada do sítio ativo da Cdk.
- Isso causa uma pequena mudança conformacional que aumenta ainda mais a atividade da Cdk, permitindo que a cinase fosforile de maneira eficiente suas proteínas-alvo e, desse modo, induza eventos específicos do ciclo celular.
· O aumento e a diminuição dos níveis de ciclinas são os determinantes primordiais da atividade das Cdks.
· A fosforilação de um par de aminoácidos na cavidade do sítio ativo da cinase inibe a atividade de um complexo de ciclina-Cdk.
 - A fosforilação desses sítios por uma cinase conhecida como Wee1 inibe a atividade das Cdks.
 - A desfosforilação desses sítios por uma fosfatase conhecida como Cdc25 aumenta a atividade das Cdks.
· A ligação de proteínas inibidoras Cdk (CKIs) inativam complexos ciclina-Cdk.
 - A ligação de CKI estimula um grande rearranjo na estrutura do sítio ativoda Cdk1, tornando-o inativo.
 - Auxiliam na regulação das atividades de G1/S-Cdks e S-Cdks.
A progressão G2/M é controlada pelo complexo ciclina-Cdk e a transição metáfase-anáfase é desencadeada pela degradação de proteínas, levando a estágios finais da divisão.
· O principal regulador da transição entre metáfase e anáfase é o complexo promotor da anáfase, ou ciclossomo (APC/C).
 - Membro da família enzimática de ubiquitinas-ligase.
 - Estimulam a degradação proteolítica de proteínas reguladoras específicas.
 - Poliubiquitinam proteínas alvo-específicas, resultando na sua degradação em proteassomos.
· O APC/C catalisa a ubiquitinação e a destruição de dois tipos principais de proteínas:
 - Securinas – (protege as ligações proteicas – coesina – que mantêm os pares de cromátides-irmãs unidos) na metáfase ativa a protease que separa as cromátides-irmãs e desencadeia a anáfase.
 - S-ciclinas e as M-ciclinas – inativando a maioria das Cdks das células - muitas proteínas fosforiladas por Cdks da fase S ao início da mitose são desfosforiladas por várias fosfatases na célula em anáfase.
· Essa desfosforilação de alvos das Cdks é necessária para a conclusão da fase M, incluindo as etapas finais da mitose e citocinese.
· APC/C permanece ativa em G1 para fornecer um período estável de Cdk inativa.
· Quando G1/S-Cdk é ativada em G1 tardio, APC/C é inativado, permitindo, desse modo, um acúmulo da ciclina no próximo ciclo celular.
· As modificações na atividade de APC/C durante o ciclo celular, inicialmente como resultado das trocas nas suas associações com uma subunidade ativadora – tanto Cdc20 na metade da mitose ou Cdh1 a partir do final da mitose através de G1 precoce. Ajudam o APC/C a reconhecer suas proteínas-alvo.
· A SCF é outra ubiquitina-ligase, responsável por ubiquitinar a CKI em G1 tardio, ajudando no controle de ativação de S-Cdks e replicação do DNA.
 - Também destrói ciclinas G1/S na fase S inicial.
 - A atividade de SCF depende das subunidades ligadas ao substrato chamadas proteínas F-box.
 - A ubiquitinação pela SCF é controlada por mudanças no estado de fosforilação de suas proteínas-alvo, uma vez que as subunidades de F-box reconhecem somente proteínas específicas fosforiladas.
· CONTROLE TRANSCRICIONAL - mudanças na transcrição dos genes de ciclinas, por exemplo, auxiliam o controle dos níveis de ciclinas.
RESUMO DO CONTROLE INICIAL
· Quando as condições para a proliferação celular são adequadas, vários sinais externos e internos estimulam a ativação de G1-Cdk, que estimula a expressão de genes que codificam G1/S-ciclinas e S-ciclinas.
· A ativação resultante de G1/S-Cdk controla a progressão através do Início da transição.
· As G1/S-Cdks desencadeiam uma onda de atividade das S-Cdks, que inicia a duplicação dos cromossomos na fase S e contribui para alguns eventos iniciais da mitose.
· A ativação de M-Cdk dispara a progressão através da transição de G2/M e eventos da mitose inicial, levando ao alinhamento de pares de cromátides-irmãs na placa equatorial do eixo mitótico.
· A APC/C, junto ao ativador Cdc20, dispara a degradação de securinas e ciclinas, desencadeando a separação de cromátides-irmãs e a segregação e finalização da mitose.
· Quando a mitose está completa, múltiplos mecanismos colaboram na supressão da atividade das Cdks, resultando em um período estável de G1.
FASE S
Duplicação dos cromossomos e do empacotamento das proteínas que cercam o DNA – garantir a herança de todos as características.
· A replicação do DNA deve ser precisa e cada nucleotídeo deve ser copiado apenas uma vez – minimizar mutações.
· A replicação inicia nas origens de replicação:
 - Durante a fase S, a replicação do DNA é iniciada nessas origens quando a helicase de DNA desenrola a dupla-hélice e as enzimas da replicação de DNA se ligam às duas fitas-molde simples.
- Depois, no alongamento, a maquinaria de replicação se distancia da origem em duas forquilhas de replicação
· Para garantir uma duplicação/ciclo a fase de iniciação da replicação é dividida em duas etapas:
 - 1º passo – licenciamento da origem de replicação: ocorre na mitose tardia e G1 inicial, quando um par de helicases de DNA inativas se ligam à origem de replicação, formando um grande complexo, chamado de complexo pré-replicativo ou pré-RC - a iniciação da síntese de DNA ocorre somente em origens que contém um pré-RC.
 - 2º passo – ocorre na fase S, quando helicases de DNA são ativadas, resultando no desenrolamento do DNA e no início da síntese de DNA.
 - Uma vez que a origem de replicação tenha sido iniciada nessa via, as duas helicases se movem para fora da origem na forquilha de replicação, e a origem não pode ser reutilizada até que uma nova pré-RC seja adicionada no final da mitose.
· Complexo de reconhecimento da origem (ORC):
 - Se liga às origens de replicação no decorrer do ciclo celular.
 - Na mitose tardia e em G1 precoce, as proteínas Cdc6 e Cdt1 colaboram com ORC para ligar as helicases inativas ao DNA, perto da origem.
 - O grande complexo resultante é o pré-RC.
· No início da fase S, S-Cdk desencadeia a ativação da origem pela fosforilação específica de proteínas iniciadoras, as quais promovem a formação de um grande complexo proteico que ativa a helicase de DNA e recruta a maquinaria para síntese de DNA
· Uma proteína-cinase chamada DDK também é ativada na fase S e ajuda a desencadear a ativação da origem pela fosforilação específica de subunidades da helicase de DNA.
Mecanismos previnem a ligação de novas pré-RCs:
 - S-Cdk fosforila e dessa forma inibe proteínas ORC e Cdc6.
 - A inativação do APC/C no final de G1 também ajuda a evitar a formação do pré-RC.
 - Na mitose tardia e G1 precoce, APC/C desencadeia a degradação de um inibidor Cdt1 chamado geminina, permitindo, assim, que Cdt1 se torne ativa. Quando APC/C é inativada em G1 tardia, ocorre o acúmulo de geminina e a inibição de Cdt1 que não está́ associada ao DNA. Também, a associação de Cdt1 com uma proteína na forquilha de replicação ativa, estimula a degradação de Cdt1. Nessas várias vias, a formação de pré-RC é impedida da fase S à mitose, assegurando, dessa forma, que cada origem seja ativada apenas uma vez por ciclo celular.
Recomposição do sistema de controle para a próxima replicação:
 - No final da mitose, a ativação do APC/C leva à inativação das Cdks e à degradação da geminina. ORC e Cdc6 são desfosforiladas e Cdt1 é ativada, permitindo a formação do pré-RC para preparar a célula para a próxima fase S.
Duplicação do DNA e das proteínas de empacotamento:
 - Aumento da síntese das proteínas da cromatina na fase S – fornecimento de matéria-prima para empacotar o DNA recém-sintetizado.
 - As S-Cdks estimulam um grande aumento da síntese das quatro subunidades de histonas que formam os octâmeros de histonas no núcleo de cada nucleossoma - Essas subunidades são agrupadas em nucleossomas no DNA por fatores de associação de nucleossomas, que normalmente se associam à forquilha de replicação.
 - O empacotamento da cromatina ajuda a controlar a expressão gênica - algumas partes do cromossomo, a cromatina está altamente condensada e é chamada de heterocromatina, enquanto em outras regiões existem estruturas mais abertas chamadas eucromatina.
 - Essas diferenças na estrutura da cromatina dependem de uma variedade de mecanismos, incluindo modificações de caudas de histona e a presença de proteínas não histonas.
· No final da fase S, cada cromossomo replicado consiste em um par de cromátides-irmãs idênticas, ligadas uma à outra ao longo de sua extensão.
 - Auxilia na mitose bem-sucedida.
· A coesão de cromátides-irmãs depende de um grande complexo de proteínas chamado coesina, que se liga a diversos locais ao longo do comprimento de cada cromátide-irmã assim que o DNA é replicado na fase S.
 - A coesina forma gigantescas estruturas similares a anéis, e tem-se proposto que elas circundam as duas cromátides-irmãs.· A coesão de cromátides-irmãs também resulta do encadeamento de DNA, o entrelaçamento de moléculas de DNA irmãs que ocorre quando duas forquilhas de replicação se encontram durante a síntese de DNA.
 - A enzima topo isomerase II gradativamente desembaraça as moléculas-irmãs de DNA concatenadas entre a fase S e o início da mitose, cortando uma molécula de DNA, passando a outra através da quebra, e então resselando o DNA cortado.
 - Uma vez removido o encadeamento, a coesão de cromátides-irmãs depende primariamente dos complexos de coesina.
MITOSE
· A mitose é tradicionalmente dividida em cinco etapas – prófase, prometáfase, metáfase, anáfase e telófase –, inicialmente definidas com base no comportamento do cromossomo.
· Seguindo a conclusão da fase S e a transição através de G2, a célula sofre uma grande perturbação da fase M.
· A mitose pode ser dividida em 2 etapas, cada uma influenciada por um componente distinto do controle:
 - Um aumento abrupto na atividade de M-Cdk na transição G2/M desencadeia eventos no início da mitose (prófase, prometáfase e metáfase) - a M-Cdk e várias outras cinases mitóticas fosforilam uma série de proteínas, levando à formação do fuso mitótico e à ligação deste aos pares de cromátides-irmãs.
 - Outra é a transição entre metáfase e anáfase, quando o APC/C provoca a degradação da securina, liberando uma protease que cliva a coesina e, com isso, inicia a separação das cromátides-irmãs - O APC/C também promove a degradação de ciclinas, levando à inativação das Cdks e à desfosforilação de alvos das Cdks, o que é necessário a todos os eventos do final da fase M.
· A M-Cdk ocasiona todos os diversos e complexos rearranjos celulares que ocorrem nos estágios iniciais da mitose:
 - Induz a formação do fuso mitótico.
 - Assegura a ligação das cromátides-irmãs aos polos.
 - Desencadeia a condensação dos cromossomos.
 - Promove a desintegração do envelope nuclear e rearranjos do citoesqueleto.
A M-Cdk não atua sozinha na fosforilação de proteínas-chave. Duas famílias adicionais de cinases, as cinases similares a Polo e as cinases Aurora, também dão importantes contribuições ao controle dos eventos mitóticos iniciais.
 - Cinase Plk similar ao polo – necessária à formação normal do fuso mitótico bipolar, pois fosforila proteínas responsáveis na separação dos polos do fuso (motor).
 - Cinase Aurora A – ajuda a controlar proteínas que promovem a formação e a estabilidade do fuso.
 - Cinase Aurora B – controla a ligação das cromátides-irmãs ao fuso.
· Ativação da M-Cdk:
 - Inicia-se com acúmulo de M-ciclina (Ciclina B).
 - Síntese aumenta durante G2 e M – devido ao aumento da transcrição do gene M-ciclina.
 - Gera acúmulo da M-Cdk (Cdk1) à medida que o ciclo se aproxima da mitose.
 - A cinase Wee1 mantém o complexo inativo e se acumulando até o fim de G2 - está preparada e pronta para agir, mas está inibida por fosfatos que bloqueiam o sítio ativo da cinase.
 - O evento crucial é a ativação da proteína-fosfatase Cdc25, que remove os fosfatos inibidores que restringem a M-Cdk.
 - A atividade inibidora da Wee1 é então suprimida, aumentando a atividade da M-Cdk .
 - A Cdc25 são estimuladas pela S-Cdk ativas em G2 e também pelas próprias M-Cdk.
 - A capacidade da M-Cdk de ativar seu próprio ativador (Cdc25) e inibir seu próprio inibidor (Wee1) sugere que a ativação da M-Cdk na mitose envolve ciclos de retroalimentação positiva.
· A ativação parcial da Cdc25 (talvez pela S-Cdk) leva à ativação parcial de uma subpopulação de complexos de M-Cdk, que, então, fosforilam mais moléculas de Cdc25 e Wee1.
· Para separar as cromátides-irmãs:
 - Condensação – cromátides são compactadas.
 - Resolução das cromátides – são separadas em unidades distintas – para isso deve haver a remoção parcial de moléculas de coesina (mantém as cromátides fortemente unidas na região centromérica) nos braços dos cromossomos.
· A condensação e a resolução das cromátides-irmãs dependem, ao menos em parte, de um complexo proteico de cinco subunidades chamado de condensina.
 - A condensina forma um “anel” que usa energia de ATP para promover a compactação e resolução das cromátides.
 - Modifica o enrolamento das moléculas de DNA – condensação.
 - A M-Cdk fosforila a Condensina estimulando o enrolamento.
· A segregação dos cromossomos depende do fuso mitótico: 
 - É um arranjo bipolar de microtúbulos que separa as cromátides na Anáfase.
 - A M-Cdk promove formação do fuso no início da mitose
Características dos microtúbulos:
 - Extremidades menos (-) estão orientadas aos dois polos do fuso, e as extremidades mais (+) se irradiam para fora dos polos.
 - As extremidades mais (+) de alguns microtúbulos – chamados microtúbulos interpolares – sobrepõem-se com as extremidades mais (+) de microtúbulos de outro polo, resultando em uma rede antiparalela na região média do fuso.
 - As extremidades mais (+) de outros microtúbulos – os microtúbulos do cinetócoro – são ligadas aos pares de cromátides-irmãs em grandes estruturas proteicas chamadas de cinetócoros, que estão localizados no centrômero de cada cromátide-irmã.
 - Muitos fusos também contém microtúbulos astrais que se irradiam a partir dos polos e contatam o córtex da célula, ajudando no posicionamento do fuso na célula.
 - Cada polo do fuso é orientado em uma organela proteica denominada centrossomo.
 - Cada centrossomo consiste em uma matriz de material amorfo (chamada de matriz pericentriolar) que cerca um par de centríolos.
 - A matriz contém uma série de proteínas, incluindo proteínas motoras dependentes de microtúbulos, proteínas com estrutura em super-hélice que ligam os motores ao centrossomo, proteínas estruturais e componentes do sistema de controle do ciclo celular.
· A função do fuso mitótico depende de muitas proteínas motoras.
 - Proteínas relacionadas à cinesina, que normalmente se movem em direção à extremidade mais (+) dos microtúbulos.
 - As dineínas, que se movem em direção à extremidade menos (-).
 - Operam nas extremidades dos microtúbulos ou perto delas.
· As proteínas cinesina-5 contém dois domínios motores que interagem com as extremidades mais (+) de microtúbulos antiparalelos na zona média do fuso. Como os dois domínios motores se movem em direção às extremidades mais (+) dos microtúbulos, eles fazem os dois microtúbulos antiparalelos, ao passarem um sobre o outro, deslizarem em direção aos fusos mitóticos, forçando o afastamento dos polos.
· As células possuem um único centrossomo que nucleia a maioria dos microtúbulos citoplasmáticos.
· O centrossomo se duplica quando a célula entra no ciclo celular – essa duplicação inicia na fase S, estimulado pela G1/S(E)-Cdk2 que também desencadeia o início do ciclo.
· Os dois centríolos do centrossomo se separam, e cada um nucleia a formação de um único centríolo novo, resultando em dois pares de centríolos dentro de uma matriz pericentriolar expandida.
· Esse par de centrossomos permanece unido em um lado do núcleo até́ a célula entrar em mitose.
· A duplicação do centrossomo e a duplicação dos cromossomos – Ambas usam um mecanismo semiconservativo de duplicação, no qual as duas metades se separam e servem de molde à construção de uma nova metade.
A M-Cdk e outras cinases mitóticas são necessárias à separação e maturação dos centrossomos.
 - A M-Cdk e a Aurora-A fosforilam motores de cinesina-5 e nos estimulam a conduzir a separação dos centrossomos.
 - A Aurora-A e a Plk também fosforilam componentes do centrossomo, promovendo, com isso, sua maturação.
· A ligação do fuso às cromátides requer a fragmentação do envelope nuclear que se inicia após o estímulo pela M-Cdk – fosforila subunidades dos complexos de poros nucleares iniciando a dissociação do envelope.
· A M-Cdk também fosforila os componentes da lâmina nuclear, o revestimento estrutural sob o envelope. A fosforilação desses componentes da lâmina e de váriasproteínas internas do envelope nuclear leva à despolimerização da lâmina nuclear e à fragmentação das membranas do envelope em pequenas vesículas.
· Instabilidade do centrossomo na intérfase – polimerização e dissociação microtúbulos curtos, dinâmicos e densos ideais para as cromátides irmãs.
· Se um único cromossomo é arrastado para fora do alinhamento, uma massa de novos microtúbulos do fuso rapidamente aparece ao redor do cromossomo recém-posicionado, ao passo que os microtúbulos do fuso na posição anterior do cromossomo se despolimerizam.
· Após a formação de um arranjo bipolar de microtúbulos, a segunda etapa importante na formação do fuso é a sua ligação aos pares de cromátides-irmãs.
 - Os microtúbulos do eixo se ligam a cada cromátide no seu cinetócoro, uma estrutura proteica gigante, de múltiplas camadas que é formada na região centromérica da cromátide.
· Como ligar as cromátides a polos opostos? Biorientação 
 - Cinetócoros dispostos de lados opostos.
 - As ligações incorretas são altamente instáveis e de curta duração, ao passo que as ligações corretas são estabilizadas em seu devido lugar.
 - Ligações corretas são definidas pela tensão em que os cinetócoros são puxados.
 - Quando os cromossomos estão ligados de forma incorreta – quando ambas as cromátides-irmãs estão ligadas ao mesmo polo do fuso, por exemplo – a tensão é baixa, e o cinetócoro envia um sinal inibitório que relaxa o controle.
· Quando a biorientação ocorre, a alta tensão no cinetócoro bloqueia o sinal inibidor, fortalecendo a ligação do microtúbulo.
· Em células animais, a tensão não somente aumenta a afinidade do sítio de ligação, mas também leva à ligação de microtúbulos adicionais ao cinetócoro.
· Isso resulta na formação de uma espessa fibra de cinetócoro, composta por múltiplos microtúbulos.
· O controle da força de ligação do cinetócoro é controlado pela Cinase Aurora B, através da avaliação da tensão.
 - O aumento da tensão inibe esta, aumentando a ligação do cinetócoro ao microtúbulo.
 - A diminuição da tensão estimula esta que fosforila componente do sítio de ligação (Ndc80) diminuindo a afinidade com o microtúbulo.
· Em seguida a sua ligação aos dois polos do fuso, os cromossomos são arrastados para trás e para frente, assumindo, por fim, uma posição equidistante entre os dois polos, uma posição chamada de placa metafásica.
· Movimento oscilatório – forças mantêm a placa metafásica – cabo de guerra – puxando para polos opostos tensão durante pró-metáfase e metáfase.
 - Despolimerização da extremidade mais (+).
 - Fluxo de microtúbulos – puxados em direção a extremidade menos (-).
 - Força de ejeção polar – transporte para longe do fuso – interação em mais (+).
 - Coesinas mantém cromátides unidas resistindo às forças de tensão.
· Transição Metáfase-Anáfase:
 - Desencadeado pelo APC/C - inicia a separação das cromátides-irmãs, ao ubiquitinar várias proteínas reguladoras mitóticas e, com isso, promovendo sua degradação.
 - A anáfase começa com a perda súbita da coesão de cromátides-irmãs, que permite às irmãs se separarem e se moverem a polos opostos do fuso.
 - O APC/C inicia o processo ao marcar a proteína inibidora securina para a degradação e a securina se liga e inibe a atividade da Separase
 - A destruição da Securina libera a Separase que então cliva as subunidades da Coesina, separando as cromátides irmãs.
· O APC/C também direciona as S-ciclinas e as M-ciclinas à destruição, levando à perda da maioria das atividades das Cdks na anáfase. A inativação das Cdks permite que fosfatases desfosforilem muitos dos substratos-alvo de Cdks na célula, como requerido à conclusão da mitose e da citocinese.
· O APC/C é ativado pela M-Cdk e pela Cdc20 que aumenta à medida que a célula se aproxima da mitose, devido a um aumento da transcrição de seu gene.
· Ponto de verificação da formação do fuso:
 - Assegura que a célula não entre na anáfase até que todos os cromossomos estejam corretamente biorientados no fuso mitótico.
 - Depende de um mecanismo sensor que monitora a força de ligação do microtúbulo ao cinetócoro, possivelmente através da detecção de tensão.
 - Todo cinetócoro que não está́ propriamente ligado ao fuso envia um sinal negativo que se difunde e impede a ativação de Cdc20-APC/C através da célula e assim impede a transição metáfase-anáfase.
 - Quando o último par de cromátides-irmãs está apropriadamente biorientado, o bloqueio é removido permitindo que ocorra a separação das cromátides-irmã.
· Movimentos da segregação cromossômica:
 - Anáfase A: movimento inicial dos cromossomos em direção aos polos, que é acompanhado pelo encurtamento dos microtúbulos do cinetócoro – “Puxa”.
 - Anáfase B: separação dos próprios polos do fuso, que começa após as cromátides-irmãs terem se separado e os cromossomos terem se distanciado “Empurra”.
· Na telófase, o estágio final da mitose, os dois conjuntos de cromossomos são empacotados em um par de núcleos-filhos
 - Despolimerização do fuso mitótico.
 - Formação do envelope nuclear - fragmentos da membrana nuclear se associam à superfície de cromossomos individuais.
 - Esses fragmentos de membrana se fundem para envolver parcialmente grupos de cromossomos, e depois coalescem para formar novamente o envelope nuclear completo.
 - Os complexos de poros nucleares são incorporados ao envelope, a lâmina nuclear se forma novamente, e o envelope mais uma vez se torna continuo com o retículo endoplasmático.
 - Uma vez reformado o envelope nuclear, os complexos de poros bombeiam as proteínas nucleares para o interior, o núcleo se expande, e os cromossomos mitóticos são reorganizados em seu estado interfásico, possibilitando a retomada da transcrição gênica.
CITOCINESE
· Divisão do citoplasma.
· Inicia-se na anáfase e termina após a finalização da mitose na telófase.
· Primeira mudança – sulco de clivagem anel contrátil (filamentos de actina, miosina II e proteínas estruturais)
 - O anel gradativamente se contrai.
· Há fusão de vesículas intracelulares à membrana, inserindo novo material à membrana, compensando o aumento da área de superfície.
· Quando a contração do anel é concluída, a inserção e a fusão da membrana selam a lacuna entre as células-filhas.
· Em células interfásicas, os filamentos de actina e miosina formam uma rede cortical subjacente à membrana.
· Quando as células entram na mitose, esses arranjos de actina e miosina se desestruturam; a maior parte da actina se reorganiza, e os filamentos de miosina são liberados.
· Quando as cromátides-irmãs se separam na anáfase, a actina e a miosina II começam a se acumular no anel contrátil.
· Após a anáfase, os arranjos sobrepostos de filamentos de actina e miosina II se contraem para gerar a força que divide o citoplasma em dois.
· Os filamentos de actina no anel são altamente dinâmicos, e seu arranjo muda continuamente durante a citocinese.
 
 - O anel contrátil é inteiramente desfeito quando a clivagem termina, uma vez que a membrana plasmática do sulco de clivagem se estreita para formar o corpo mediano.
 - O corpo mediano subsiste como uma corrente entre as duas células-filhas e contém os restos do fuso central, uma grande estrutura proteica derivada dos microtúbulos interpolares antiparalelos da zona média do fuso, firmemente empacotados em conjunto dentro de um material denso de matriz.
 - Após as células-filhas se separarem completamente, alguns dos componentes do corpo mediano residual geralmente permanecem do lado interno da membrana plasmática de cada célula, onde podem servir de ponto de referência no córtex e ajudar a orientar o fuso na divisão celular subsequente.
· A RhoA, uma pequena GTPase da superfamília Ras controla a formação e o funcionamento do anel contrátil no sítio de clivagem.
 - A RhoA é ativada no córtex celular no futuro sítio de divisão, onde promove a formação de filamentos de actina, a associação da miosina II e a contraçãodo anel.
 - Ela estimula a formação de filamentos de actina pela ativação de forminas, e promove a associação e as contrações da miosina II pela ativação de múltiplas proteínas-cinase.
· Essas cinases fosforilam a cadeia leve da miosina reguladora, uma subunidade da miosina II, estimulando dessa forma a formação do filamento bipolar da miosina II e atividade motora.
· Durante a anáfase, o fuso gera sinais que iniciam a formação do sulco em uma posição a meio caminho entre os polos do fuso, assegurando que a divisão ocorra entre os dois conjuntos de cromossomos separados.
 - Esse mecanismo também contribui para a escolha do momento correto da citocinese no final da mitose.
 - A citocinese também ocorre na hora correta, porque a desfosforilação de substratos das Cdks, que depende da degradação de ciclinas na metáfase e na anáfase, inicia a citocinese.
· Se, no início da anáfase, o fuso for puxado com força para uma nova posição com uma fina agulha de vidro, o sulco de clivagem incipiente desaparece, e um novo se desenvolve de acordo com o novo sítio do fuso.
CONTROLE DA DIVISÃO E DO CRESCIMENTO CELULAR
· O controle do crescimento, divisão e sobrevivência é regulado por programas intracelulares e por moléculas extracelulares que controlam esses programas.
· Moléculas de sinalização extracelular: regulam o crescimento.
 - Mitógenos – estimulam a divisão celular desencadeando uma onda de atividade de G1/S-Cdk que atenua controles intracelulares negativos.
 - Fatores de crescimento – estimulam o crescimento celular (aumento de massa)ao promover a síntese de proteínas e inibir a degradação.
 - Fatores de sobrevivência – Promovem a sobrevivência celular ao suprimir a apoptose.
 - Existem moléculas de sinalização extracelular que suprimem a proliferação celular e que ativam extracelularmente a apoptose.
· Mitógens:
 - Para que uma célula animal se prolifere, ela deve receber sinais extracelulares estimuladores, sob a forma de mitógenos, de outras células, geralmente suas vizinhas.
 - Estes superam os sinais intracelulares de freagem.
 - Ex.: PDGF – fator de crescimento derivado de plaquetas.
– OBS: fibroblastos – plasma e soro – mitógenos das plaquetas - a PDGF liberada dos coágulos sanguíneos ajuda a estimular a divisão celular durante a cicatrização de feridas.
· Muitos mitógenos podem estimular crescimento celular, sobrevivência, diferenciação ou migração, dependendo das circunstâncias e do tipo celular.
· Proteínas de sinalização extracelular inibidoras se opõem aos reguladores positivos e, desse modo, inibem o crescimento de órgãos.
 - O TGFb inibe a proliferação de vários tipos celulares, principalmente bloqueando a progressão do ciclo celular em G1.
· Na ausência de um sinal mitogênico para a proliferação, a inibição das Cdks em G1 é mantida e a célula entra em G0.
· Os mitógenos controlam a taxa de divisão celular agindo na fase G1 do ciclo celular.
 - Os mitógenos liberam os inibidores da atividade da Cdk, permitindo a entrada em um novo ciclo.
 
 - Os mitógenos interagem com receptores de superfície celular a fim de acionar múltiplas vias de sinalização intracelular.
 - Uma via principal age através de GTPase Ras monomérica, a qual leva à ativação de uma cascata da proteína-cinase mitógeno-ativada (MAP-cinase).
 - Leva a um aumento da produção de proteínas reguladoras de transcrição, incluindo a Myc.
 - Acredita-se que a Myc promova a entrada no ciclo celular por meio de vários mecanismos, um dos quais é o aumento da expressão de genes que codificam G1-ciclinas (ciclinas D), aumentando, com isso, a atividade da G1-Cdk (ciclina D-Cdk4).
 - A Myc também tem um importante papel na estimulação da transcrição de genes que aumentam o crescimento celular.
· A função-chave dos complexos de G1-Cdk em células animais é ativar um grupo de fatores reguladores gênicos denominados proteínas E2F, que se ligam a sequências específicas de DNA nos promotores de uma grande variedade de genes que codificam proteínas necessárias à entrada na fase S, incluindo G1/S-ciclinas, S-ciclinas e proteínas envolvidas na síntese de DNA e na duplicação dos cromossomos.
 - Na ausência de estimulação mitogênica, a expressão gênica dependente de E2F é inibida por uma interação entre E2F e membros da família de proteínas do retinoblastoma (Rb).
 - Quando as células são estimuladas a se dividir pelos mitógenos, a G1-Cdk ativa se acumula e fosforila membros da família Rb, reduzindo sua ligação a E2F.
 - As proteínas E2F liberadas ativam a expressão de seus próprios genes-alvo.
Esse sistema de controle transcricional inclui ciclos de retroalimentação que garantem que a entrada no ciclo celular seja completa e irreversível.
 - As proteínas E2F liberadas, por exemplo, aumentam a transcrição de seus próprios genes.
 - A transcrição dependente de E2F dos genes da G1/S-ciclina (ciclina E) e da S-ciclina (ciclina A) leva ao aumento das atividades da G1/S-Cdk e da S-Cdk, que aumentam a fosforilação da proteína Rb e promovem a liberação de mais E2F.
OBS: Retinoblastoma – perda do gene Rb – excessiva proliferação de células da retina.
As camadas adicionais de controle promovem um aumento esmagador na atividade de S-Cdk no início da fase S.
 - O ativador de APC/C, Cdh1 suprime níveis de ciclina após a mitose. Em células animais, entretanto, as ciclinas G1 e G1/S são resistentes a Cdh1–APC/C e podem funcionar sem oposição pela APC/C para promover a fosforilação da proteína Rb e expressão do gene E2F-dependente.
 - A S-ciclina, ao contrário, não é resistente, e seu nível é inicialmente retido pela atividade de Cdh1–APC/C.
 - Contudo, a G1/S-Cdk também fosforila e inativa Cdh1-APC/C, permitindo, com isso, o acúmulo de S-ciclina, promovendo ainda mais a ativação da S-Cdk.
 - A G1/S-Cdk também inativa as proteínas CKI que reprimem a atividade da S-Cdk. O efeito global de todas essas interações é a ativação rápida e completa dos complexos de S-Cdk necessários ao início da fase S.
DANO AO DNA
· Influencia a progressão do ciclo.
· Causas: reações químicas espontâneas, erros de replicação e exposição à radiação.
· O sistema de controle do ciclo celular pode facilmente detectar danos no DNA e parar o ciclo em qualquer uma de duas transições.
· Os danos no DNA dão início a uma via de sinalização pela ativação de um par de proteínas-cinase relacionadas chamadas de ATM e ATR, que se associam ao local do dano e fosforilam várias proteínas-alvo, incluindo duas outras proteínas-cinase chamadas de Chk1 e Chk2.
 - Essas várias cinases fosforilam outras proteínas-alvo que levam à interrupção do ciclo celular.
 - O principal alvo é o gene da proteína reguladora p53, que estimula a transcrição do gene que codifica p21, uma proteína CKI.
 - A p21 liga-se aos complexos G1/S-Cdk e S-Cdk e inibe suas atividades, ajudando a impedir a entrada no ciclo célula.
· Os danos no DNA ativam a p53 por um mecanismo indireto.
 - Em células que não foram danificadas, a p53 é altamente instável e está presente em concentrações muito baixas. Isso se deve a sua interação com outra proteína, a Mdm2, que age como uma ubiquitina-ligase que promove a p53 à degradação nos proteassomos.
 - A fosforilação da p53 após um dano no DNA reduz sua ligação à Mdm2.
 - Isso diminui a degradação da p53, o que resulta em um aumento marcante da concentração de p53 na célula.
 - A diminuição da ligação à Mdm2 aumenta a capacidade da p53 de estimular a transcrição gênica.
· As proteínas-cinase Chk1 e Chk2 também bloqueiam a progressão do ciclo celular pela fosforilação de membros da família de fosfatases proteicas Cdc25, inibindo sua função.
 - Essas fosfatases são particularmente importantes à ativação da M-Cdk no início da mitose .
 - Chk1 e Chk2 fosforilam Cdc25 em sítios inibitórios que são diferentes dos sítios de fosforilação que estimulam a atividade de Cdc25.
 - A inibição da atividade da Cdc25 por danos no DNA ajuda a bloqueara entrada na mitose .
· Um baixo nível de danos no DNA ocorre durante a vida normal de toda célula, e esses danos se acumulam na progênie da célula, se a resposta a danos ao DNA não estiver funcionando. Em longo prazo, o acúmulo de lesões genéticas em células que não possuem a resposta a danos leva a um aumento da frequência de mutações que promovem o câncer.
 - Essa perda de função da p53 permite à célula cancerosa acumular mutações mais facilmente.
· Senescência replicativa – perda dos telômero e capas protetora dos genes que codificam proteínas.
 - Fibroblastos – 50 duplicações.
 - Perda dos telômeros – Dano ao DNA – ativação da p53 – interrupção do ciclo.
 - Telomerase – renovação dos telômeros – poucas células humanas possuem.
 - Células cancerosas desenvolvem a telomerase não sofrendo o processo de senescência replicativa.
· A mutação de um único aminoácido na pequena GTPase Ras, por exemplo, torna a proteína permanentemente hiperativa, levando à constante estimulação das vias de sinalização dependentes de Ras, mesmo na ausência de estimulação mitogênica.
· Mutações que causam a superexpressão da proteína Myc estimulam o crescimento e a proliferação celular em excesso, promovendo o desenvolvimento do câncer.
· Quando uma forma hiper ativada de Ras ou Myc é experimentalmente superproduzida o resultado não é a proliferação excessiva, mas o oposto: as células sofrem a interrupção do ciclo celular permanente ou apoptose. A célula normal responde impedindo divisões adicionais.
 - Tal estimulação muitas vezes leva à produção de uma proteína inibidora do ciclo celular chamada de Arf, que se liga e inibe a Mdm2.
 - A Mdm2 normalmente promove a degradação da p53.
 - A ativação da Arf faz os níveis de p53 se elevarem, induzindo a interrupção do ciclo celular ou apoptose.
MECANISMOS DE REPARO DE DNA
Capacidade da maquinaria celular de corrigir os erros causados por mutações.
 - Muitos danos sofridos pelo DNA podem ser reparados porque a informação genética é preservada em ambas as fitas da dupla-hélice, de tal forma que a informação perdida em uma fita pode ser recuperada a partir da fita complementar.
· Agentes causadores: Radiação, radicais livres, produtos químicos (ambiente), quimioterapia.
TIPOS DE REPARO: 
· Reparo por Reversão Química Direta
 - Tipo de dano: alquilação (adição de um grupo metil à base nitrogenada - guanina).
 - A lesão é removida pela enzima O6metilguaninametiltransferase (MGMT), que reconhece a alteração no DNA e remove o grupamento metil causador da mutação.
 - Cada grupamento metil removido consome uma enzima MGMT, a qual não pode ser recuperada para nova utilização. 
Reparo por Excisão de Bases (BER) 
 - Tipo de dano: Modificação das bases (A, T, C, G) ou inadequação das bases por falha de revisão.
· A base defeituosa é reconhecida pela DNA-glicosilase e, então, a remoção dessa base é feita pela clivagem da ligação “base nitrogenada – desoxirribose”, seguida pelo preenchimento da região com a base correta por ação da DNA-polimerase. Finalmente, a integridade da fita corrigida é restaurada pela DNAligase.
· Reparo por Excisão de Nucleotídeos (NER) 
 - Tipo de dano: Modificação das bases (A, T, C, G) ou inadequação das bases por falha de revisão.
 - Ocorre quando a remoção da base defeituosa é feita pela incisão endonucleolítica nos dois lados da lesão, com liberação dos nucleotídeos, seguida pelo preenchimento da região por ação da DNA polimerase.
 - O processo de NER consiste em cinco etapas:
1. Reconhecimento da lesão por um complexo multe enzimático; 
2. Incisão da fita anormal em ambos os lados da lesão a alguma distância desta; 
3. Excisão do segmento contendo a lesão; 
4. Síntese de um novo segmento de DNA utilizando a fita não danificada como molde, por ação da DNA-polimerase; 5.
· Ligação/restauração da molécula de DNA por ação da enzima DNA-ligase.
· Reparo de Bases Mal Pareadas 
 - Tipo de dano: Inadequação das bases por falha de revisão.
 - Algumas bases incorretamente pareadas conseguem escapar da revisão realizada pela DNA-polimerase durante o processo de replicação. Um sistema de reparo formado pelas enzimas hMSH2 e hMLH1 remove os segmentos de fita simples contendo nucleotídeos incorretos, permitindo que a DNA polimerase insira a base correta na lacuna formada.
 -O reconhecimento de sequências GATC metiladas indicam a fita parental, enquanto ausência de metilação nestas sequências caracteriza a fita recém-sintetizada.
· Reparo por união de extremidades não-homólogas
 - Agentes causadores: exógenos (radiação ionizante e quimioterápicos) e endógenos (radicais livres). Neste mecanismo, as extremidades de uma molécula de DNA, apesar de terem perdido alguns nucleotídeos por degradação espontânea, são justapostas para recombinar.
 - O mesmo complexo enzimático realiza o processo de ligação entre as duas extremidades. Desta forma, a sequência original de DNA acaba sendo alterada.
· Reparo por união de extremidades homólogas
 - O segundo mecanismo reparador de quebras na dupla fita é a união de extremidades homólogas.
 - O processo é bem mais comum e mais preciso.
Por este mecanismo, o cromossomo homólogo àquele lesado faz uma cópia da sequência de nucleotídeos perdida com quebra da dupla-fita e transfere esta sequência para o sítio de quebra no cromossomo lesado; este cromossomo lesado, então, tem sua sequência original restaurada.