RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA - Determinação de benzoilecgonina em urina por Imunoensaio e Cromatografia em Camada Delgada

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CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
FARMÁCIA
BRENO ALMEIDA
DÉBORA MARRONI
EDUARDO GERMANO
GLAUCIANE LACERDA
IGOR FERNANDES
MARIANA MIRANDA
MARY LÚCIA
POLLYANNA PEREIRA 
RAIZA RAMOS
TALITA CRISTINA
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PROFESSOR PABLO MARINHO
BELO HORIZONTE, NOVEMBRO DE 2020
DETERMINAÇÃO DE BENZOILECGONINA EM URINA POR
IMUNOENSAIO E CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA
As folhas da Erythroxylum coca contém a cocaína que é um alcalóide que atua como
anestésico local e também como um potente estimulante do Sistema Nervoso Central. Por
meio dessa ação estimulante, a cocaína pode induzir: euforia, aumento do ritmo cardíaco,
febre, dilatação das pupilas, sudorese, tremores e sensação de aumento de energia no
usuário. Essa droga pode ser administrada por injeção intravenosa, inalação nasal e
inalação de vapor pelo aquecimento da base livre, sendo excretada na urina como
benzoilecgonina. A benzoilecgonina possui uma meia vida de cinco a oito horas e a
cocaína de meia hora a uma hora e meia, ou seja, a benzoilecgonina possui uma meia vida
maior do que a cocaína, e normalmente pode ser detectada de 24 a 48 horas após o seu
uso (G.A.T. Pinto, 2015)
O teste de cocaína é um teste de imunoensaio cromatográfico de triagem rápida, sem a
necessidade de equipamentos, utilizado para fazer a detecção qualitativa do metabólito
da cocaína na amostra de urina do ser humano com um cut-off de 150 ng/ml, portanto o
teste pode detectar 150 ng/ml de metabólitos da cocaína, a benzoilecgonina, na urina. No
entanto, os imunoensaios utilizados para detecção de cocaína apresentam algumas
limitações como fornecer apenas resultado analitico preliminar, ou seja, ser apenas um
teste inicial qualitativo e, consequentemente, não poder ser utilizado para determinar a
concentração da droga na urina e nem o nível de intoxicação do indivíduo. Portanto, para
haver a confirmação do resultado é preciso utilizar métodos como a cromatografia a gás
ou espectrometria de massa, pois no teste de imunoensaio pode gerar resultados falso-
positivo devido haver a possibilidade de ocorrer erros de procedimento, erros técnicos, 
 bem como a presença de outras substâncias na amostra de urina (RINALI, 2009).
A urina é a amostra biológica utilizada para a pesquisa dos metabólitos da cocaína, como
a benzoilecgonina, devido à sua constituição ser rica em água (aproximadamente 98%). A
urina facilita a identificação dos tóxicos (por acumulação de grandes concentrações de
drogas e respectivos metabolitos), fornecendo informação relativa à exposição da droga.
Dessa forma, é vista como uma matriz útil para orientar os testes de rastreio feitos no
sangue. Em relação a coleta da amostra de urina, é necessário que seja realizada em um
recipiente limpo e seco podendo ser a qualquer hora do dia (BOEHL, 2011).
INTRODUÇÃO
COCAÍNA
ADAPTADO DE PUBCHEM
OBJETIVOS
GERAL
Determinar a presença de benzoilecgonina em urina
através de Imunoensaio e Cromatografia em Camada
Delgada (CCD).
ESPECÍFICOS
Realizar análise qualitativa de cocaína na urina
utilizando o teste de imunoensaio rápido, em tira,
para a detecção do metabólito benzoilecgonina 
 da cocaína em urina humana, com um cut-off de
150 ng/ml.
Realizar Cromatografia em Camada Delgada
(CCD) para confirmação do resultado obtido no
teste de imunoensaio.
1.
2.
Com as setas impressas na tira apontando para a amostra, inserir a tira de teste
verticalmente na amostra durante 15 segundos. Não ultrapassar a linha máxima
indicada no teste ao inserí-la na amostra;
Retirar a tira teste da amostra e colocá-la em uma superfície horizontal, limpa e iniciar
a contagem no cronômetro;
Anotar o resultado após 5 minutos;
Em caso de positivo aparecerá apenas duas linhas horizontais (controle e teste) e em
caso de negativo aparecerá apenas uma linhas horizontais (controle).
1) Imunoensaio
1.
2.
3.
4.
MÉTODOS
 (resultado positivo na tira)
5 minutos
2) Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
1. No tubo falcon contendo 20 mL de urina foi adicionando 12 gotas de hidróxido de amônio
PA, a fim de basificar a amostra até o pH=11 e facilitar o processo de extração, pois a
cocaína é uma molécula básica e em meio básico ela fica na forma neutra (mais apolar) e
assim ela pode ser extraída por um solvente orgânico que também é apolar;
2. Posteriormente foi feito a Leitura do pH da amostra com uma fita de pH para verificar se
a amostra havia alcalinizado;
 (tira de pH imersa em solução de urina + hidróxido de amônio)
3. Em seguida foi adicionado 1 grama de cloreto de sódio na amostra; O cloreto de sódio
também foi adicionado para facilitar a extração do analito da matriz para o solvente
orgânico;
4. Logo após, foi feito a adição, na capela, de 20 mL de éter etílico (medido na proveta)
sobre a amostra de urina contida no tubo falcon. Em seguida o frasco foi tampado para
que fosse realizada a homogeneização/agitação do tubo por inversão durante o período
de 30 segundos. A agitação foi feita de forma lenta para que não houvesse a formação de
emulsão e consequentemente ficasse difícil de separar as fases na etapa posterior do
processo;
5. O próximo passo foi verter a amostra para um funil de extração e descartar a fração
inferior (urina);
6. Depois disso, foi feito o recolhimento da fração superior (orgânica) num béquer, filtrando
em um funil com papel de filtro contendo 1 grama de sulfato de sódio anidro. O sulfato de
sódio anidro foi utilizado para retirar a água do éter que veio da urina no processo de
mistura realizado na etapa 5.
DISTÂNCIA PERCORRIDA DA AMOSTRA
DISTÂNCIA PERCORRIDA PELO DILUENTE
7. Evaporar o extrato em chapa aquecedora na capela;
8. Reconstituir o extrato com 0,5 mL de metanol;
9. Posteriormente, foi feito a aplicação do padrão de benzoilecgonina (2 vezes) e da
amostra (2 vezes) na cromatofolha de sílica gel, utilizando-se um tubo capilar;
10. Em seguida foi realizada a eluição da cromatofolha utilizando o como eluente
(clorofórmio : acetona : hidróxido de amônio - 90 : 10 : 0,50);
11. O próximo passo foi revelar a cromatofolha primeiramente no UV e depois com o
revelador Dragendorff;
12. Por fim, foi feito o cálculo do Rf do padrão e o Rf da amostra para a identificação da
benzoilecgonina na amostra.
NÃO FORAM
NECESSÁRIAS
(PASSO 11 - REVELADOR DRAGENDORFF)
(PASSO 12 - CALCULAR RF)
(PASSO 11 - LUZ UV)RF = 
(PASSO 9)
(PASSO 10)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
ph da amostra = 11
O resultado de pH obtido demonstra que a adição das 12 gotas de hidróxido de amônio PA
foi capaz de basificar a amostra de urina até o pH proposto (pH 11).
Imunoensaio: positivo
O teste de triagem utilizado para saber se havia ou não a cocaína na amostra de urina do
periciado foi o imunoensaio. Todo teste de triagem possui alta sensibilidade, porém baixa
especificidade. Logo, se o teste desse negativo, seria indicativo de que realmente não
havia a presença de cocaína ou de seus metabólitos na urina do periciado. No entanto,
como o teste deu positivo, foi preciso utilizar outra técnica mais específica, a
Cromatografia em Camada Delgada, para que fosse verificado se realmente o indivíduo
havia feito a utilização da cocaína ou se o teste de imunoensaio havia dado um resultado
falso-positivo.
Cromatografia em Camada Delgada (CCD) - cálculo do RF
3,2 / 8,3
DISTÂNCIA PERCORRIDA DA AMOSTRA
DISTÂNCIA PERCORRIDA PELO DILUENTE
RF = 
0,38RF = 
DISTÂNCIA PERCORRIDA DA AMOSTRA
DISTÂNCIA PERCORRIDA PELO DILUENTE
RF = 
PADRÃO 
RF = PADRÃO 3,2 / 8,3
0,38 
RF = AMOSTRA 
RF = AMOSTRA 
O RF obtido no padrão representa o RF da Benzoilecgonina, metabólito da cocaína, que é
utilizado como marcador de uso da cocaína. Isso porque a cocaína (metilbenzoilecgonina)
sofre biotransformação e perde o grupo metila e se transforma em benzoilecgonina que é
excretado na urina. Tendo isso em mente, como o RF da amostra foi igual ao RF do padrão,
significa que o composto presente na amostra também é a benzoilecgonina.
Revelação da cromatofolha no UV
Consegue-se fazera revelação na luz ultravioleta, pois a benzoilecgonina possui marcador
de fluorescência. Foram observadas as bandas do padrão e da amostra com uma
coloração arroxeada. Ou seja, mesmo padrão de fluorescência e RF.
Revelação da cromatofolha com o reagente de Dragendorff
O reagente de Dragendorff é específico para compostos nitrogenados, como a
benzoilecgonina. O reagente de Dragendorff é uma solução de iodeto de potássio e
subnitrato de bismuto que regem com o nitrogênio presente na estrutura da
benzoilecgonina, levando a formação de uma coloração vermelho tijolo.
Após o reagente de Dragendorff ter sido utilizado, foi observado na cromatofolha a
formação de bandas com uma coloração vermelho tijolo, tanto na banda que representa o
padrão quanto na que representa a amostra.
Portanto, por meio do resultado dos RF e das colorações obtidas nas bandas do padrão e
da amostra, foi possível fazer a caracterização da benzoilecgonina na amostra de urina,
confirmando o que o teste de imunoensaio já havia indicado, que o periciado havia de fato
feito o uso de cocaína.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
(IMUNOENSAIO)
(CCD)
CONCLUSÃO
As análises toxicológicas, como a realizada neste trabalho,
possuem uma grande importância, visto que por meio dessas
análises pode ser feito a detecção do uso ou da exposição à
substâncias psicoativas, tóxicas ou à outras substâncias
intoxicantes pelo indivíduo. Em vista disso, os exames
toxicológicos podem ser solicitados ou exigidos em diversas
situações, como por exemplo: em pessoas que tentaram
suicídio; em concursos públicos; em indivíduos em período
comprobatório ou em liberdade condicional que exija
abstinência; em casos de renovação da CNH de categorias
C, D ou E, bem como pelos motoristas profissionais de
veículos pesados (CLT); para monitorar a adesão de pessoas
que estão em um programa de tratamento para abuso de
substâncias, a fim de melhorar o tratamento dessas pessoas.
Todas essas situações demonstram a relevância das análises
toxicológicas no dia-a-dia da sociedade.
REFERÊNCIAS
PINTO. G, Freitas. G, Machado. Y, Marinho, Pablo. Avaliação da técnica de
imunocromatografia para análise de drogas de abuso no contexto da química
forense. rbc.org.br. 2015. Disponível em:
<http://rbc.org.br/ojs/index.php/rbc/article/view/105>. Acesso em: 28 out 2020.
BOEHL, Paula Otero. A utilização de imunoensaios na detecção de substâncias
psicoativas. lume.ufrgs.br. 2011. Disponível em:
<https://www.lume.ufrgs.br/handle/10183/70119>. Acesso em: 30 out 2020.
RINALDI André, Rosa Érica, Matta Chasin, Barretos Marcos. Aplicação de
imunoensaios para análise de fármacos e drogas de abuso em sangue total, com
finalidade forense. researchgate.net. 2009. Disponível em:
<https://www.researchgate.net/profile/Andre_Fukushima/publication/260310417_apli
cacao_de_imunoensaios_para_analise_de_farmacos_e_drogas_de_abuso_em_sangu
e_total_com_finalidade_forense/links/54f745790cf28d6dec9e60c7/aplicacao-de-
imunoensaios-para-analise-de-farmacos-e-drogas-de-abuso-em-sangue-total-com-
finalidade-forense.pdf>. Acesso em: 31 out 2020.
VARGAS Aguilar, Mario Antônio, Silva Vargas, María Eugenia. Relação entre
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a concordância nos achados / Relationship between analytical rerquest of drugs
abuse determination by immunoassay and the agreement in the discoveries.
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bin/wxislind.exe/iah/online/?
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273004&indexSearch=ID>. Acesso em: 29 out 2020.
QUENTAL, Ana. Análise toxicológica da cocaína e dos seus metabolitos em
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