EXPRESSÃO GÊNICA E CONTROLE PRÉ TRANSCRICIONAL

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UNINOVE - MARIA MUNIZ AMANCIO
EXPRESSÃO GÊNICA E CONTROLE PRÉ TRANSCRICIONAL 
Objetivos 
● Conhecer os mecanismos de controle da expressão dos genes; 
● Identificar os diferentes níveis de regulação da expressão gênica; 
● Compreender os mecanismos de controle transcricional; 
DNA -> RNA 
● Compreender as etapas e os mecanismos do processamento do RNAm. 
Mecanismos antes da tradução
● Compreender a importância do controle no splicing e o splicing alternativo. 
● Compreender os mecanismos de controle pós-transcricional.
Questões norteadoras 
1) O que é Regulação Gênica? 
2) Qual sua importância nas diferentes células de um organismo eucarioto multicelular? 
3) Quais as etapas nas quais pode haver regulação da expressão gênica? 
4) Como ocorre a regulação epigenética da expressão gênica? Quais as enzimas que fazem tais modificações? Quais os principais fatores que causam essas alterações?
Todas as células nucleadas possuem os mesmos genes?
Sim, possuem os mesmos genes, mas todas elas não possuem a mesma função. Isso acontece porque há a expressão gênica.
Genes iguais com produção de proteínas diferentes, possibilitando funções diferentes, isso acontece de acordo com a regulação gênica -> expressão gênica. 
A regulação gênica faz com que as células sejam diferentes 
Como a célula controla quais genes, entre os inúmeros genes presentes em seu genoma?
· "ativados" - expressos. 
· Cada tipo de célula possui um conjunto diferente de genes ativados - apesar do fato de que quase todas as células do nosso corpo possuem exatamente o mesmo DNA.
	GENES ATIVOS 
	GENES SILENCIADOS 
	Gene em area codificante que é lido e expresso 
Faz diferenciação entre os silenciados 
	Não serão lidos, podem ou não estar em areas codificantes a leitura sera dependente da função do gene na respectiva celula
Esses diferentes padrões de expressão gênica permitem que seus vários tipos celulares possuam conjuntos diferentes de proteínas, tornando cada célula exclusivamente especializada em fazer seu trabalho
Mas como uma única célula pode originar tipos celulares diferentes?
A- durante a diferenciação, apenas os genes que codificam as proteínas que serão expressas naquele tipo celular são mantidos
Apenas genes que codificam as proteínas serão ativos, vindos desde o desenvolvimento embrionário essa diferenciação (características diferentes), com genes ativos e silenciados. 
B- todos os genes são mantidos, mas somente as proteínas específicas ao tipo celular são expressas
A parte codificante que não é importante para a célula será silenciada 
A parte não codificante automaticamente é silenciada 
A parte codificante que é importante para célula será ativada 
Expressão e Regulação Gênica 
Controle celular sobre quais genes presentes no genoma serão expressos (ativados) em determinado fase do desenvolvimento
Qual a importância do controle de expressão gênica nas diferentes células de um organismo eucarioto multicelular?
ex:Celula hepatica 
É importante ter genes que codificam a formação de enzimas 
ex: Neurônio
Não é importante ter enzimas que façam a degradação
Logo, o mesmo gene para fazer a degradação por meio de enzimas é presente no neurônio e nas células hepáticas, só que na célula hepática o gene está ativo e no neurônio ele estará inibido (impossibilidade de ser lido)
EXPRESSÃO GÊNICA EM 2 NÍVEIS DE CONTROLE: 
	CONTROLE TEMPORAL 
	CONTROLE ESPACIAL 
	Acontece quando um determinado gene é expresso em uma FASE DO DESENVOLVIMENTO ou em uma fase do CICLO CELULAR 
Por um determinado tempo 
ex: desenvolvimento embrionário 
	Acontece de um determinado gene só ocorre em um tipo celular 
Continua 
ex: célula hepática x neurônio 
ex: regulação hormonal 
Maquinaria espacial: 
Genes de Manutenção: genes comuns que estão ativos em diferentes tipos de células responsáveis pela manutenção celular e não pela função dela. 
· homeostase celular 
· mecanismos de manutenção celular 
· se diferencia apenas no que a célula irá produzir 
Toda a sequência gênica é codificante?
Reguladores da transcrição (ou transcricionais). Essas proteínas reconhecem sequências específicas de DNA (geralmente com 5 a 10 pares de nucleotídeos de comprimento) 
Nem toda sequência genética é codificante 
A maior parte do gene é NÃO codificante, mas isso não significa que há expressão de poucas proteínas 
INTRONS: não codificante 
EXONS: codificante 
Organização gênica de eucarioto (Regiões gênicas)
Região promotora: início da transcrição 
· Códon iniciador
· Códon de término 
A montante: próximo do início da transcrição 
A jusante: próximo do término da transcrição 
Então qual é a importância das demais regiões?
Mutações em região não codificante podem gerar patologias?
A parte não codificante multada pode gerar uma patologia. Mesmo que não define a formação de proteínas, pode gerar alterações, como não conseguir ter um RNA finalizado ou que não consiga terminar a transcrição. 
Região UTR: não codificante 
enquanto que um indivíduo normal terá 5 a 37 repetições
ex: Introns(não codificantes) que geram patologia 
Paciente do sexo masculino, 26 anos, natural de Florianópolis, iniciou há 10 anos com fraqueza progressiva em membros superiores e inferiores de predomínio proximal, caracterizando-se por dificuldade para subir e descer escadas, praticar futebol e quedas ao solo. Adicionalmente, iniciou com palpitações, dispnéia aos esforços, constipação intestinal e dificuldade de soltar objetos que segurava com as mãos, como maçanetas de porta e sabonetes. Não há registro de caso semelhante entre familiares maternos. Desconhece o pai e os familiares paternos. Após exames genético e de eletromioneurografia o paciente foi diagnosticado com Distrofia miotônica do tipo 1 (DM1), miopatia mais comum em adultos (incidência 1:8.000).
indivíduo com mutação causa uma expansão de repetições da parte terminar UTR, com 50 a 2000 repetições, possuindo patologias. 
Rna não sera totalmente processado 
RNAm imaturos gerados apresentam a mutação (expansão) no final da sequência, que dificulta o processamento deste RNA, impedindo a sua tradução. 
Função da proteína DMPK não está completamente elucidada. Tem sido associada a miogênese e homeostase celular.
Organização gênica de eucarioto e fluxo gênico
A partir da Transcrição sera formado o PRÉ RNA precisa ser processado, capeamneto e splicing, para que possa se transforma em RNA pronto 
· SPLICING: retirar INTRONS para que o RNA possa ser processado, unindo assim os EXONS 
· Direcionar o que é 5’ e o que é 3’ por meio de CAPEAMENTO 
Em quais as etapas do fluxo gênico pode haver regulação da expressão gênica?
Controle da expressão gênica:
· PRÉ TRANSCRICIONAL: mais vantagens e benefícios 
· PÓS TRANSCRICIONAL
A expressão gênica pode ser regulada em muitas etapas no caminho que vai do DNA ao RNA e até a proteína
Níveis de regulação gênica 
melhor controle da expressão gênica, sendo antes da formação de RNAm
CONTROLE PRÉ TRANSCRICIONAL 
	PRÉ TRANSCRICIONAL 
PÓS TRANSCRICIONAL 
1. Pré-transcricional: Controle do grau de compactação do DNA; 
2. Transcricional: Controle dos processos de síntese de RNAm 
3. Processamento de RNAm: Controle dos processos de maturação do RNA mensageiro 
4. Transporte de RNAm: Controle da exportação do RNAm a partir do núcleo em direção ao citoplasma 
5. Estabilidade do RNAm: Controle de degradação das moléculas de RNAm 
6. Traducional: Controle dos processos de tradução da fita de RNAm em proteínas pelos ribossomos 
7. Atividade da proteína: Controle sobre a ativação, desativação, degradação ou endereçamento para o compartimento correto
	EPIGENÉTICA 
	MUTAÇÃO 
	O que é epigenética?
Epigenética: conjunto de mecanismos que promovem a regulação da expressão gênica a nível transcricional através de modificações químicas (metilação, fosforilar, etc) no DNA e na cromatina, como metilação, acetilação e fosforilação, que resultam na consequente mudança fenotípica do indivíduo sem, no entanto, ocorrer nenhuma alteração na sequência do DNA.
· patologias por falhasna acetilação, metilação, fosforilação, etc
· Metilação do DNA 
· Metilação de histonas
· Acetilação de histonas
· Modificadores da cromatina
	O que é Mutação?
· Alteração estrutural
· patologia falha na estrutura 
Epigenética: Mudanças no nível de empacotamento do DNA modificam o acesso do complexo transcricional ao gene
8 histonas que o DNA se enovela até ficar mais condensado -> nucleossomo -> cromossomo(divisão celular)
Se o DNA está empacotado e a necessidade de leitura do gene, o DNA do trecho específico que se quer ler precisa se desenovelar/abrir para que possa ser lido. 
Não faz sentido uma célula transcrever tudo, ou não transcrever nada, pois apenas a parte codificante ativa deve ser lida. 
ALTERAÇÃO DA CROMATINA 
· EUCROMATINA 
· HETEROCROMATINA 
Quanto mais compactado maior a dificuldade de leitura 
Os nucleossomos bloqueiam fisicamente o posicionamento dos fatores de transcrição e da RNA polimerase sobre a região do promotor. 
A estrutura da cromatina pode ser alterada por complexos de remodelamento ou enzimas que modificam covalentemente as histonas
Cromatina precisa focar MENOS CONDENSADOS, para que haja leitura. 
É necessário proteínas(TATA BOX) que vão direcionar onde a transcrição será iniciada. Logo o trecho codificante ativo do gene para ser lido, há necessidade de haver uma REMODELAÇÃO DA CROMATINA APENAS DO TRECHO. 
	Fatores de Acetilação: processos que aumentam a acessibilidade do DNA, favorecendo seu acesso e a Transcrição. 
· Histona-acetiltransferases (HAT) 
· Histona-desacetilase (HDAC)
Lisinas presentes na região N-terminal das histonas podem sofrer modificação química pela adição ou remoção de grupos acetila, metila ou fosfato. 
Modifica a estabilidade de ligação ao DNA ou atraem proteínas que auxiliam na compactação ou descompactação do DNA.
	Histona Acetiltransferase
	Histona Desacetilase HDAC 
	facilita a transcrição, realizando o REMODELAMENTO DA CROMATINA apenas no trecho que será lido. 
Realiza a ACETILAÇÃO (adição de grupos acetil aos resíduos de lisina), fazendo com que aumente a acessibilidade do DNA, fazendo o REMODELAMENTO do trecho da cromatina, atrai os fatores de transcrição, levando a Transcrição. 
	Para que volte ao normal de modo COMPACTADO a Histona desacetilase precisa agir, retirando o grupo acetil para voltar e estabilizar a compactação. 
remove os grupos acetil revertendo o efeito positivo da acetilação 
Metilação: adicionar grupo Metil 
Grupamento Metil (CH3) será ligado a grupamento CITOSINA-GUANINA (ilhas CPG se localizam próximo à região promotora), e se liga a CITOSINA 
Onde não ocorre a Metilação ocorre a Transcrição. 
Logo, os trechos metilados serão silenciados 
Metilação da região promotora e silenciamento gênico 
Fatores que ativam o gene
Se o gene não foi metilado e se encontra na região promotora esse gene estara ATIVADO
Fatores que silenciam o gene: 
Se o gene for metilado nas ilhas CPG e não se encontra na região promotora deste gene será SILENCIADO (logo existe mas não sera transcrito) 
CONTROLE PÓS TRANSCRICIONAL 
	PRÉ TRANSCRICIONAL 
PÓS TRANSCRICIONAL 
8. Pré-transcricional: Controle do grau de compactação do DNA; 
9. Transcricional: Controle dos processos de síntese de RNAm 
10. Processamento de RNAm: Controle dos processos de maturação do RNA mensageiro 
11. Transporte de RNAm: Controle da exportação do RNAm a partir do núcleo em direção ao citoplasma 
12. Estabilidade do RNAm: Controle de degradação das moléculas de RNAm 
Pré Transcricional: formação do PRÉ RNA -> processamento pós Transcricional: RNA maduro/pronto
13. Traducional: Controle dos processos de tradução da fita de RNAm em proteínas pelos ribossomos 
14. Atividade da proteína: Controle sobre a ativação, desativação, degradação ou endereçamento para o compartimento correto
Após a transcrição, o RNAm está pronto para ser traduzido?
Não,pois possui o PRÉ RNAm, logo o mesmo precisa ser finalizado
Quais etapas de processamento do pré-RNAm para se tornar RNAm maduro?
1. CAPEAMENTO
2. SPLICING 
3. POLIADENILAÇÃO
Capeamneto e Cadeia poli A progengem o gene de perder alguma parte do gene durante o Splicing., 
PROCESSAMENTO DO PRÉ RNAm - CONTROLE PÓS TRANSCRICIONAL
Após a sua transcrição, o RNA eucariótico precisa ser processado de várias maneiras, antes de ser exportado do núcleo para onde possa ser traduzido. Os eventos de processamento incluem:
	1. CAPEAMENTO 
A adição do CAP na extremidade 5' do RNA (capping ou capeamento);
	Adicionar um grupamento de GMP(Guanosina monofosfato) adicionado a grupo Metil(não estara ativado), função de proteger e direcionar onde a Tradução irá iniciar 
CAP = GMP + Metil 
CAP 5’
	2. SPLICING
O processamento propriamente dito (splicing ou retirada de íntrons);
	Para que os exons passem para o citoplasma, a necessidade da união de exons(parte codificante, TRAZEM INFORMAÇÃO) e retirada de introns(não codificante) 
	3. POLIADENILAÇÃO 
A poliadenilação da extremidade 3' do RNA (cauda poli-A).
	Poliadenilação: cauda com uma grande adição de ADENINAS, chamadas de Cauda poli A 3’
· Proteção contra enzimas citoplasmáticas, para que o RNA não seja degradado 
RNA MADURO/PRONTO: 
5’ CAP EXON EXON EXON CAUDA POLI-A. 3’
	CAPEAMENTO: A adição do CAP na extremidade 5' do RNA (capping ou capeamento);
· O primeiro evento do processamento do RNA é a adição do cap. 
· O fator de alongamento SPT5 também ajuda a recrutar a enzima de capping 5' para a cauda CTD (carboxi-terminal domain) da polimerase
· O RNA recebe o cap assim que emerge do canal de saída de RNA da polimerase. Isso ocorre logo que o ciclo de transcrição tenha progredido até a transição entre as fases de início e alongamento.
· Colocação de uma base guanina modificada à extremidade 5’ do RNA. Especificamente, ela é uma guanina metilada, e é ligada ao transcrito de RNA em uma ligação incomum 5’-5'.
	SPLICING: O processamento propriamente dito (splicing ou retirada de íntrons);
As reações de retirada de íntrons são promovidas por uma grande “máquina” molecular, chamada spliceossomo, complexo com cerca de 150 proteínas e 5 snRNAs (tamanho equivalente ao um ribossomo) 
· Os cinco RNAs (U1, U2, U4, U5 e U6) são chamados, conjuntamente, de pequenos RNAs nucleares (snRNAs, small nuclear RNAs). 
· Estes complexos RNA-proteína são chamados de pequenas proteínas ribonucleares (snRNPs, small nuclear ribonuclear proteins).
As snRNPs desempenham três funções no processamento:
1. Reconhecem o sítio de processamento 5' e o sítio de ramificação;
2. Aproximam esses sítios;
3. Catalisam (ou auxiliam a catálise) a clivagem do RNA e as reações de religação.
A falta de precisão no processamento – se uma base for perdida ou adicionada na fronteira entre dois éxons – deixaria as fases de leitura dos éxons fora de ordem: os códons a jusante seriam selecionados incorretamente e aminoácidos errados seriam incorporados nas proteína - 
Mutação: Alteração no quadro de leitura; tipo corte-junção.
MUTAÇÃO: nucleotídeos posicionados errados -> Codons ficam diferentes -> transporte do aminoácido errado -> proteína errada 
Podendo formar uma proteína não funcional ou uma 
	TALASSEMIA BETA 
	· Anemia grave 
· resultante de mutações que acontece no splicing 
· alteração no nucleotídeo -> destrói o sitio exon 
· Exemplo: Gene β-globina Talassemia β
	POLIADENILAÇÃO: A poliadenilação da extremidade 3' do RNA (cauda poli-A).
O evento final do processamento do RNA, a poliadenilação da extremidade 3' do mRNA, está intimamente relacionado ao término da transcrição. 
A cauda CTD da polimerase está envolvida no recrutamento das enzimas necessárias para a poliadenilação 
Quando a polimerase chega ao fim de um gene, ela encontra sequências específicas que, após serem transcritas em RNA, desencadeiam a transferência das enzimas de poliadenilação para esse RNA, levando à: 
1. Clivagem do RNAm; 
2. Adição de vários resíduos de adenina à sua extremidade 3'; 
3. Degradação do RNA remanescente associado à RNA-polimerase por uma ribonuclease5'-3'; 
4. Término da transcrição.
A cauda poli-A é exclusiva dos transcritos produzidos pela Pol II.
	SPLICING ALTERNATIVO 
	● Alguns pré-mRNAs podem ser processados de mais de uma maneira. Assim, mRNAs contendo diferentes grupos de éxons podem ser gerados a partir de um mesmo pré-mRNA. Esse processo é denominado splicing alternativo e, por meio dessa estratégia, um gene pode dar origem a mais de um produto polipeptídico. Esses produtos alternativos são chamados de isoformas. 
● Estima-se que 90% ou mais dos genes do genoma humano possam sofrer splicing alternativo, gerando mais de uma isoforma.
Seres humanos possuem menos genes que o ex: milho, mas possuímos genes mais complexos 
Splicing ocorre: 
1. saída dos introns 
2. junção dos éxons -> gera tradução de uma proteína processamento feito NÃO OCORRE QUANDO HÁ SPLICING ALTERNATIVO
2. SPLICING ALTERNATIVO: Junção dos éxons -> mudança da posição dos exons -> gera tradução de proteínas DIFERENTES
Isso gera uma proteína funcional diferente 
	REGULAÇÃO GÊNICA 
PROCESSAMENTO DE RNAm 
Gerar proteínas diferentes (em tipos celulares diferentes) onde o mesmo gene com diferenças de um nucleotídeo, induz uma nova proteína para ex: intestino.
TRANSPORTE DE RNAm: núcleo -> citosol 
Núcleo
Para que esse transporte ocorre, a fita de RNA processado é mediado por RECEPTOR DE EXPORTAÇÃO NUCLEAR(funcional no momento que a fita sair do núcleo e ser transportada para o citosol, após transporte o mesmo se desprende e retorno para o núcleo e transportar uma nova fita posteriormente), vira um RNAm maduro
Citosol
1. Proteínas do Capeamento da extremidade 5’ -> serão SUBSTITUÍDAS por FATORES DE INICIAÇÃO para a síntese no Citosol
2. TRADUÇÃO
	1. Replicação
2. Pré transcricional: CROMATINA e PRODUÇÃO DE HISTONAS
3. transcrição 
4. Pós transcricional: CAPEAMENTO, SPLICING, CAUDA POLI A
5. tradução
ESTABILIDADE DE RNAm 
RNA de interferência: siRNA; miRNA; piRNA
microRNAs e RNAs de interferência: trechos curtos de RNA que conseguem controlar a fase de TRADUÇÃO, interferindo no RNA alvo(RNA maduro que foi formado = RNAm)
Ocorre no Citosol: CONTROLE PÓS TRANSCRICIONAL
1. miRNA saem do núcleo através da produção de grampos de sua própria fita 
2. RNAm vindo do núcleo
3. siRNA; miRNA; piRNA + PROTEÍNAS SINALIZADORAS(Argonauta ou Piwi) presentes no Citosol -> se prendem a trechos do RNA alvo(RNAm) 
4. PAREAMENTO IMPERFEITO (LIGAÇÃO PARCIAL, leitura do RNAm sera impedido, onde foram parcialmente complementares) 
ou 
PAREAMENTO PERFEITO (fica PRESO a PROTEÍNA, degrada/cliva o RNAm o quebrando em fragmentos) 
entre siRNA; miRNA; piRNA + PROTEÍNAS SINALIZADORAS -> se prendem ao RNA alvo, para regular SILENCIAR o RNAm por inteiro, para que não seja gerado PROTEÍNA DEMAIS. 
5. Gera:
PAREAMENTO PERFEITO -> CLIVAGEM RNA-alvo -> quebrado não tem leitura, logo não terá proteína formada 
REPRESSÃO TRADUCIONAL E DESTRUIÇÃO DO RNA-ALVO
FORMAÇÃO DE HETEROCROMATINA SOBRE O DNA A PARTIR DO QUAL O RNA-ALVO ESTÁ SENDO TRANSCRITO
PROTEÍNAS RITS: auxiliam no silenciamento 
RNA de interferência: miRNA
RNA de interferência: siRNA
● siRNAs (RNAs interferentes): Originados de pareamento perfeito do RNA dupla hélice, geralmente de origem exógena (viral), ou elementos transponíveis. 
● A formação de heterocromatina dirigida por RNAi é um importante mecanismo de defesa celular que limita a disseminação de elementos transponíveis em genomas, pois mantém suas sequências de DNA em uma forma silenciosa transcricionalmente. 
● Os piRNAs são produzidos especificamente na linhagem germinativa, na qual eles bloqueiam o movimento de elementos transponíveis.
	FORMS 
A descoberta do processo de adição de resíduos de ubiquitina às proteínas representou um grande avanço no processo de reconhecimento de modificações pós-traducionais. Com relação a este processo, é correto afirmar: *
Mecanismos epigenéticos podem interferir no processo de carcinogênese, sendo que a acetilação do DNA pode modular a expressão de genes que atuam no controle do ciclo celular e contribuem para o desenvolvimento e progressão de neoplasias. Estudos clínicos demonstram que inibidores de histonas deacetilases (HDACs), combinados com outros agentes terapêuticos, são clinicamente ativos e bem tolerados no tratamento de uma ampla variedade de tumores. Analisando a imagem abaixo (Ac refere-se ao grupo acetil), qual a atuação dos inibidores de HDACs? *
O fragmento DNA entre o estimulador/enhancer e o promotor forma uma alça para permitir que as proteínas ativadoras eucarióticas possam influenciar diretamente os eventos que ocorrem no promotor. O DNA age como um grupo de ancoragem, permitindo que uma proteína ligada a um estimulador - mesmo que esteja a milhares de pares de nucleotídeos do promotor - possa interagir com proteínas na vizinhança do promotor. Identifique abaixo as demais proteínas necessárias para o processo de transcrição ser iniciado. *