Bruna Emillyn Souza D'avanço - corantes microbiologia

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Microbiologia Clínica
Métodos de Coloração.
Nome: Bruna Emillyn Souza D’avanço Farmácia, 5 período, noite
1. Por que os corantes são utilizados na Microbiologia? 
R: Os corantes ajudam na identificação e diferenciação de componentes de células e tecidos. Esses componentes tendem a ser transparentes e os corantes dão aos observadores um meio de ver o que é invisível ao olho humano.
2. O que é coloração? 
R: Técnica utilizada na microbiologia para diferenciar ou identificar os microrganismos no microscópio. No processo de coloração podem ser usadas substâncias que intensificam a cor por aumentarem a afinidade do corante com o micro-organismo.
3. O que é fixação e quais são suas utilidades? 
R:Técnica citológica que tem por objetivo preservar o material a observar ao microscópio num estado o mais próximo possível em que foi realizada a colheita.
4. Descreva o processo de fixação. 
Fixação seca: Esse tipo de fixação é utilizado quando se realiza a coloração de GRAM, pois o metanol presente na solução corante age como fixador. É o tipo de fixação utilizada para distensão de célula sanguínea, imprint de baço, gânglios linfáticos, entre outros. 
Fixação por revestimento: usada na obtenção dos esfregaços citológicos. Os fixadores são constituídos de polietilenoglicol (Carbowax) e ·álcool, comercialmente vendidos na forma líquida ou em spray. As amostras são fixadas pelo gotejamento do fixador ou pela pulverização do aerossol das embalagens em spray, sendo secas à temperatura ambiente, pois o álcool fixa e evapora, enquanto o polietilenoglicol forma uma película que protege e preserva a amostra. Existem brios protocolos para este tipo de fixador; citaremos um dentre os vários que existem na literatura.
Fixação por líquidos fixadores: O fixador citológico universal é o etanol 95%, um agente coagulante, que penetra na célula desidratando-a e intensificando a diferenciação nuclear e citoplasmática após a coloração. Outros fixadores, como o Carnoy, metanol, álcool isopropílico 80%, etanol 50%, líquido de Bouin, dentre outros, também podem ser utilizados como fixadores celulares, variando a escolha e o tempo de fixação de acordo com natureza da amostra.
5. Por que a fixação deve ser realizada antes da coloração? 
R: A fixação evita a autólise celular e impede a proliferação de microrganismos, preservando a morfologia do tecido e fornecendo maior resistência para as etapas seguintes. Dessa forma, a fixação utiliza processos físicos ou químicos para imobilizar as substâncias constituintes das células e dos tecidos.
6. O que são corantes?
R: A coloração visa contrastar as estruturas teciduais. A ação da maioria dos corantes se baseia na interação entre os radicais ácidos ou básicos dos elementos químicos dos mesmos com os dos tecidos. Por isso são utilizados para ajudar na identificação e diferenciação de componentes de células e tecidos.
7. Quais são os tipos de coloração utilizadas em microbiologia e qual a utilidade de cada uma?
Coloração simples, coloração diferencial e coloração especial.
Coloração simples: são colorações nas quais se utiliza apenas um corante. Podem ser positivas, quando as bactérias são coradas (ex, azul de metileno, safranina, cristalvioleta) ou negativas, quando a bactéria não é corada, mas a sua célula contrasta com o corante circundante (ex tina da china, nigrosina).
Coloração diferencial: são colorações em que são empregados dois corantes contrastantes que vão gerar cores diferentes em grupos distintos de bactérias. Ex. coloração de Gram e Coloração de Ziehl-Neelsen
Coloração especial: são aquelas utilizadas para curar identificar partes específicas das células bacterianas como esporos, flagelos ou ainda revelar a presença de cápsulas.
A Fresco: As preparações deste tipo permitem o exame dos micro-organismos nas condições normais de vida e são perfeitamente utilizadas nas seguintes situações: quando a morfologia fica distorcida devido aos processos de fixação e coloração, durante a verificação da motilidade, durante os processos fisiológicos (divisão celular, produção de esporos) e durante a observação de corpúsculos (vacúolos e material graxo)
Entre Lâmina e Lamínula: Salina. Esta técnica pode ser usada para avaliar bactérias cultivadas em meio líquido e fungos. A técnica consiste em gotejar com o auxilio de uma alça de platina, esterilizada, no centro da lâmina, uma gotícula da cultura a ser investigada. Ou um fragmento da cultura em meio sólido do fungo a ser analisado. Em seguida cobrir com lamínula e examinar ao microscópio.
Hidróxido de Potássio (KOH): esta técnica é usada para pesquisa de fungos, proveniente de material biológico como muco, restos celulares, pelos e unhas. A técnica consiste em colocar uma pequena amostra do material biológico a ser pesquisado no centro da lâmina; suspender o material com uma ou duas gotas de KOH, cobrir com uma lamínula e aguardar 30 minutos ou aquecer ligeiramente a lâmina para acelerar o clareamento.
Exame de Campo Escuro: esta técnica é empregada para observar a motilidade de bactérias dificilmente observadas em microscopia a fresco com salina. A técnica consiste em atritar as bordas da lesão suspeita com um swab ou alça bacteriológica, colher o exudato com a própria alça ou fazer um imprint com a lâmina e cobrir com a lamínula (utilizar uma gota de salina). Realizar a pesquisa rapidamente. Ou, se o material for líquido (urina recém-emitida), centrifugar e examinar o sedimento. A microscopia em campo escuro é realizada colocando-se óleo de imersão.
Tinta da China (nanquim): esta técnica é empregada para pesquisa de fungos em líquido cefalorraquidiano e outros materiais permitindo destacar a cápsula deste fungo contra um fundo negro. A técnica consiste em pegar o líquido cefalorraquidiano sedimentado ou uma amostra do meio de cultura líquido e ressuspender em uma gota de tinta da china fazendo um filme bem delgado entre lâmina e lamínula.
Fixados e Corados: as preparações fixadas e coradas são usadas para verificar as características morfológicas, sendo bastante utilizadas na identificação das bactérias, pois tornam mais fácil a visualização das formas e permitem a verificação do comportamento tintorial do micro-organismo em relação às colorações diferenciais.
Coloração Azul de Metileno: esta técnica é utilizada principalmente na avaliação da morfologia de bactérias em esfregaços de líquido cefalorraquidiano, pois os danos causados as células são menores devido ao menor número de manipulações. Esta técnica consiste em colocar o corante sobre o esfregaço previamente fixado deixando-se corar por 3 a 5 minutos. Em seguida escorre-se o corante, lava-se em água corrente e deixa-se secar para posterior observação ao microscópio.
Coloração de Wright Giemsa: esta técnica é utilizada para corar os elementos celulares em esfregaços sanguíneos, para demonstração de micro-organismos intracelulares e também para demonstrar inclusões intracelulares em esfregaços diretos, de pele ou mucosas. Esta técnica consiste em colocar o corante sobre o esfregaço previamente fixado deixando-se corar por 3 a 5 minutos. Em seguida escorre-se o corante, lava-se em água corrente e deixa-se secar para posterior observação ao microscópio.
Coloração de Gram: As bactérias coradas por esta técnica pertencem a duas categorias distintas: Gram positivas e Gram negativas. A diferença básica entre os dois grupos é resultado da estrutura de suas paredes celulares. A técnica consiste na aplicação de um corante básico, o cristal violeta e uma solução de iodo e iodeto de potássio (lugol), em um esfregaço previamente fixado na chama. A preparação é, então, tratada com um solvente orgânico (álcool ou acetona), com o objetivo de descolorir as células. As bactérias Gram positivas retêm o corante ou o complexo cristal violeta e iodo após a descoloração e aparecem em azul escuro. As bactérias Gram negativas não são capazes de reter o complexo cristal violeta e iodo após a descoloração e são contra coradas com um segundo corante (fucsina ou safranina), chamado corante de contraste e adquirema coloração vermelha.
Coloração de Ziehl-Neelsen: esta técnica é utilizada para corar os bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR). Estes bacilos são assim denominados porque possuem um envoltório céreo que é resistente a coloração. Para o corante penetrar na célula é necessário calor ou detergente. Uma vez coradas, as bactérias álcool-ácido resistentes resistem à descoloração, enquanto outras bactérias descoram com o álcool-ácido. A técnica consiste em corar o esfregaço previamente fixado com carbolfucsina (aquecer 3 vezes), descorar com álcool-ácido a 3% e contra corar com o azul de metileno.
8. Quais são as etapas da coloração simples?
R: espalhar a cultura em uma camada fina sobre a lâmina, secar ao ar, passar a lâmina sobre a chama, cobrir a lâmina com o corante, analisar em microscópio, pingar uma gota de óleo de imersão sobre a lâmina examinar com lente objetiva de 100x.
9. O que é mordente e qual a sua função? 
R: Mordente é uma substância associada ao tingimento com a função específica de manter a durabilidade da cor, conferindo maior resistência às lavagens e exposição ao sol. Pode ser de origem vegetal, como o tanino (substância extraída da casca de algumas plantas) ou mineral como sais de crómio o alúmen (pedra-ume).
10. Quem foi o criador do método de Gram? 
R: Hans Christian Joachim Gram (1853 — 1938) foi um bacteriologista da Dinamarca. Em 1884
11. Na coloração de Gram, qual é o tratamento que o esfregaço recebe após a fixação?
Para realizar a confecção de uma lâmina de acordo com a metodologia de Gram é necessário ter os seguintes reagentes: violeta de genciana, lugol, álcool etílico, fucsina ou safranina. Logo após, é só seguir os passos abaixo para realização da técnica.
1) Confeccione o esfregaço com o material biológico.
2) Cubra o esfregaço com violeta de metila e deixe o corante agir sobre a lâmina, durante por 60 segundos.
3) Escorra o corante e em seguida lave em um filete de água corrente. Logo após cubra a lâmina com lugol e deixe agir por 60 segundos.
4) Escorra o lugol e lave em um filete de água corrente.
5) Adicione à lâmina álcool etílico (99,5º GL), até que saia todo o corante
6) Lave a lâmina em um filete de água corrente.
7) Coloque sob a lâmina fucsina básica 0,1 a 0,2% ou (safranina) até cobrir toda a lâmina, deixe agir por 30 segundos.
8) Lave a lâmina sob um filete de água corrente.
9) Deixe a lâmina secar ou seque delicadamente com o auxílio do papel filtro.
10) Coloque uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço.
11) Leia em objetiva de imersão (100 X).
12. Quais são os tipos de colorações especiais? 
Resposta na 7
12. Qual a estrutura bacteriana que mais participa das características morfo-tintorial das bactérias? 
R: Parede celular
13. Para que serve uma preparação em gota pendente? 
R: O Exame a fresco é um método de observação que preserva a forma natural dos microrganismos e reduzem as distorções que somente ocorrem quando as preparações são secas e fixadas. Em vista da semi-transparência das células, estas preparações não são satisfatoriamente visualizadas a microscópio ótico de campo luminoso. Assim, se examinados pequenos organismos, como bactérias, vivas e suspensas em fluidos, veremos que a observação é precária, e quase impossível discernir claramente sobre qualquer de suas estruturas internas. É como se estivéssemos vendo um fragmento de vidro claro imerso em água cristalina.
14. Citar alguns cuidados, a serem tomados para execução satisfatória do exame a fresco? 
R:  As preparações  a fresco exigem um manuseio completo do microscópio de campo luminoso. Assim é necessário que se façam ajustes na intensidade da luz que ilumina os objetos a serem observados, bem como uma regulagem adequada do condensador. Se possível, é conveniente o emprego de filtros, de modo a melhorar a qualidade da imagem, em fase da iluminação deste sistema ótico. Pode-se lançar mão de outros instrumentos. Uma das alternativas é a microscopia de contraste de fase. A outra forma é o emprego da microscopia de campo escuro.
15. Quais as limitações do exame a fresco? 
Resposta na 15
16. A coloração simples se presta a identificação de uma cultura mista de microrganismos? Que observações poderiam ser obtidas?
R: Na coloração simples só é possível observar a forma das bactérias, se na amostra tiver uma cultura mista no microscópio poderia se identificar um estafilococo e um bacilo por exemplo.
17. Qual a principal utilização do método de coloração de Ziehl-Neelsen? 
R: Exame de BAAR, bacilo álcool- acido resistente ou M. tuberculosis, bactéria que causa a tuberculose. Pode-se identificar a bateria que causa a lepra também.
18. Quais os reagentes utilizados no método de coloração de Ziehl-Neelsen? 
Reagentes:
· Corante primário: fucsina fenicada (carbolfucsina);
· Descolorante: álcool-ácido 3% (v/v);
· Contra-corante: azul de metileno ou verde malaquita.
Passo a passo:
1. Cobrir a lâmina com fucsina fenicada;
2. Aquecer a lâmina até à emissão de vapores (não deixar ferver ou secar);
3. Deixe o corante aquecido na lâmina por 5 minutos;
4. Lavar com água corrente;
5. Cobrir a lâmina com álcool-ácido até descorar totalmente o esfregaço (2-5 min);
6. Lavar com água corrente;
7. Cobrir a lâmina com azul de metileno durante 1 a 2 minutos;
8. Lavar com água corrente e limpar a parte inferior da lâmina;
9. Esperar secar;
10. Observar no microscópio em objetiva de imersão (100x).
19. Classifique os reagentes utilizados no método de coloração de Ziehl-Neelsen? 
RESPOSTA NA 18
20. Que características da célula das micobactérias explicam sua reação tintorial no método de coloração de Ziehl-Neelsen? 
R: O alto teor lipídico das micobactérias confere à esta a álcool-ácido resistência, que impede a coloração das bactérias pela técnica de Gram, normalmente utilizada. as micobactérias apresentam uma parede celular rica em lipídeos, tornando sua parede a Técnica de coloração Ziehl-Nielsen é capaz de corar essas bactérias.
22. Qual cor apresentada pelos BAAR na reação tintorial do método de coloração de ZiehlNeelsen?