Apostila de Parasito Clínica

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Técnicas laboratoriais
Pesquisa de helmintos
Técnicas Laboratoriais
Pesquisa de Helmintos
Pesquisa de Protozoários
Disciplina: Parasitologia Clínica
Profa Msc.Meire Cristina Alves de Castro Pauleto
Diagramação: Elsa Minami Kume 
2009 - 2014
Índice
AULA PRÁTICA 1 – Método de Hoffman, Pons e Janer ou HPJ.............................2
AULA PRÁTICA 2 – Método de Willis...................................................................2
AULA PRÁTICA 3 – Método de anal swab............................................................3
AULA PRÁTICA 4 – Método de Baerman..............................................................4
AULA PRÁTICA 5 – Método de Rugai...................................................................5
AULA PRÁTICA 6 – Método de Tamisação...........................................................5
AULA PRÁTICA 7 – Método de Kato Katz.............................................................6
AULA PRÁTICA 8 – Método de Stoll.....................................................................7
AULA PRÁTICA 9 – Método de Faust...................................................................9
AULA PRÁTICA 10 – Método de Ritchie...............................................................9
AULA PRÁTICA 11 – Método de Hematoxilina Férrica.......................................10
Coloração “Acid-Fast”................................................................................12
Coloração de Kinyoun................................................................................13
Coloração de safranina.............................................................................14
Coloração de Tricrômio.............................................................................15
Coloração de Gram Chromotrope.............................................................17
Coloração de Leishman..............................................................................19
Exame Microscópico do Exame Coprológico..........................................21
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PESQUISAS DE HELMINTOS NAS FEZES
PESQUISAS DE OVOS NAS FEZES
AULA PRÁTICA 1 – Método de Hoffman, Pons e Janer ou HPJ (ou método de sedimentação espontânea), para pesquisa de ovos pesados de helmintos.
Utilização: inquéritos epidemiológicos, principalmente em áreas esquistossomáticas.
Técnica:
Tomar 2 a 4 gramas de fezes, colocá-los em frasco Borrel e desmanchá-los em água com auxílio de um bastão de vidro ou plástico;
Coar a emulsão através de gaze dobrada em 4 ou uma tela de plástico ou metal limpa, para dentro de um cálice de sedimentação cônico;
Completar o volume do cálice juntando mais água e misturando bem o conteúdo;
Deixar sedimentar por 2 horas;
Com uma pipeta Pasteur, retirar pequena amostra de sedimento do vértice do cálice, colocá-la sobre uma lâmina e cobrir com lamínula. Não é necessário corar os ovos, mas se houver interesse em reconhecer também os cistos de protozoários, juntar um pouco de lugol.
Para identificação dos ovos, usar quadro 1 (em anexo).
AULA PRÁTICA 2 – Método de Willis (ou flutuação).
Utilização: ovos leves de helmintos, devido à baixa densidade, flutuam quando se encontram em uma solução saturada de cloreto de sódio. Este é o melhor método para demonstração de ovos de Ancylostoma sp, sendo pouco eficiente para Schistosoma mansoni, Fasciola hepatica e ovos inférteis de Ascaris lumbricoides, que possuem densidade relativamente alta. 
Técnica:
Dissolver sal de cozinha (NaCl) em água quente até que esta fique saturada (densidade deve chegar a 1.200);
Estando a amostra fecal em um recipiente de boca larga (frasco Borrel de 3cm de diâmetro), desfazê-la com a solução saturada de sal, na proporção de um (1) para 10 ou 20 volumes;
Completar depois o volume para que a superfície líquida chegue até a borda do recipiente;
Colocar uma lâmina sobre a boca do recipiente de modo que sua face inferior seja banhada pelo líquido;
Esperar uns três minutos (ou mais), suspender a lâmina bruscamente e invertê-la, cuidando para não derramar a película líquida que ficou aderida e onde estão concentrados os ovos e cistos;
Corar com lugol, para melhor visualização dos cistos, cobrir com lamínula e examinar ao microscópio com aumento médio. 
AULA PRÁTICA 3 – Método de anal swab
Utilização: consiste em aplicar sobre a pele da região perianal uma fita adesiva transparente para pesquisa de ovos de Enterobius vermicularis. Os ovos quando presentes, aderem à superfície gomada da fita. 
Técnica:
Para a comodidade de manuseio, uma porção de fita adesiva (medindo aproximadamente 2 X 6 cm) é emendada por suas extremidades a duas tiras de papel e colada à lâmina de vidro. No momento de usar ela é destacada da lâmina, puxando-se pelas tiras de papel; dobrada sobre uma espátula com a parte gomada para fora e aplicada contra o ânus. As nádegas, que deviam estar bem separadas são, agora, aproximadas de encontro à fita adesiva para assegurar perfeito contato desta coma pele; colar novamente a fita adesiva na lâmina de vidro e levar o conjunto ao microscópio.
�PESQUISA DE LARVAS DE HELMINTOS NAS FEZES
AULA PRÁTICA 4 – Método de Baerman.
Utilização: baseia-se no hidrotropismo + e termotropismo das larvas e na tendência destas a sedimentar, quando se encontram na água.
Técnica:
O equipamento necessário consiste em um funil de vidro com aproximadamente 10 cm de diâmetro, a cujo extremo inferior prende-se um tubo de borracha curto fechado por uma pinça de pressão, e de um suporte para manter o funil em posição adequada sobre a mesa.
	No interior do funil, colocar a peneira metálica, com cerca de 7 cm de diâmetro, e forrá-la com gaze. 
Isolamento de larvas de Strongyloides stercoralis e Ancylostoma sp
Depositar cerca de 10 gramas de amostra fecal sobre a gaze, espalhando tanto quanto possível;
Colocar no funil água aquecida a 45ºC, até que sua superfície entre em contato com as fezes;
Depois de uma hora, abrir a pinça de pressão e deixar escorrer para um vidro relógio 3 a 5 ml de líquido;
Examinar com pequeno aumento ao microscópio ou lupa estereoscópica larvas vivas. Os detalhes estruturais tornam-se mais evidentes após a coloração feita com uma gota de lugol. 
�AULA PRÁTICA 5 – Método de Rugai.
Utilização: consiste na simplificação da técnica precedente, que se torna mais prática quando as fezes vêm para o laboratório acondicionadas em recipientes rasos, fornecidos aos pacientes pelo próprio laboratório.
Técnica:
Envolver o recipiente, sem tampa, em gaze dobrada em duas e colocá-la com a abertura voltada para baixo em um cálice de sedimentação; 
Encher o cálice com água aquecida a 45ºC, até que o nível da água alcance a massa fecal contida no recipiente emborcado;
Uma hora depois, pipetar o sedimento que se acumulou no vértice do cálice de sedimentação, colocar em uma lâmina ou em vidro relógio e examinar ao microscópio ou lupa.
Usar o quadro 63.2 (em anexo) para identificação das larvas.
AULA PRÁTICA 6 – Método de Tamisação
Utilização: técnica para pesquisa de proglotes e vermes adultos de helmintos. 
Técnica:
O bolo fecal deve ser desmanchado em água e depois passado em peneira de malhas finas para reter as proglotes.
Para o diagnóstico de espécie, as proglotes grávidas serão comprimidas fortemente entre duas lâminas grossas de vidro e o conjunto submerso em ácido acético, para clarear. Depois de dissolvidas as concreções calcárias do parênquima, a conformação do útero e de suas ramificações tornam-se aparentes e permitem a distinção.
�AULA PRÁTICA 7 – Método de Kato Katz (ou quantitativo de Kato).
Utilização: tomar uma quantidade de fezes (por exemplo, 50 mg pesados ou estimados pelo volume) e conta-se a quantidade de ovos existentes na lâmina. A partir daí, se calcula o númerode ovos por grama de fezes que o paciente está eliminando e, indiretamente, pode-se fazer idéia da carga de helmintos presente no intestino.
Técnica:
A maneira mais simples de chegar a esse objetivo é tomar um volume constante e conhecido de matéria fecal e:
1) Colocar sobre a lâmina uma placa perfurada (molde de plástico ou de outro material, tendo no centro um orifício cujo volume é conhecido);
2) Com o aplicador, preencher o volume do orifício com as fezes raspadas sobre a tela de náilon, eliminando em seguida todo o excesso;
3) Retirar o molde, deixando sobre a lâmina um pequeno cilindro de matéria fecal, de volume definido. Também se pode saber o peso exato desta amostra, levando-se a lâmina à balança, antes e depois de colocar nela o material, e calcular o peso deste por diferença.
4) Cobrir com a lamínula de celofane embebida em glicerina e comprimi-la para que o material se espalhe bem;
5) Contar a totalidade de ovos de cada espécie que encontrar na lâmina, separadamente.
6) Multiplicar o número obtido para cada espécie por um fator constante que depende do orifício do molde. O kit Kato-Katz comercializado no Brasil, cujo molde fornece um volume de fezes correspondente a 41,7 miligramas, deve-se multiplicar o resultado da contagem por 24 para se ter o número de ovos.
OBS: ovos de Ascaris lumbricoides e Trichuris trichiura – conservam-se por semanas ou meses;
ovos de Ancylostoma sp – difíceis de ver após uma hora do preparo da lâmina;
Schistosoma mansoni – melhores ao fim de 24 horas;
Strongyloides stercoralis– não são visíveis por esta técnica.
* fezes muito duras (pacientes constipados) adicionar-lhes mistura glicerinada algum tempo antes de preparar a lâmina, e comprimir fortemente o material depois de colocada a lamínula.
AULA PRÁTICA 8 – Método de Stoll.
Utilização: técnica normalmente usada para contagem de ovos.
Técnica:
Para medir uma quantidade fixa de matéria fecal e diluí-la numa razão conhecida, utiliza-se um frasco do tipo Erlenmeyer que traz duas marcas no gargalo (frasco de Stoll): uma indicando volume de 56 mL e outra o de 60 mL. Pode-se usar uma proveta graduada de 100 mL com rolha em lugar do fresco de Stoll, e tomar como referências as marcas de 70 e 75 mL. 
preencher o frasco com soda 0,10N até a marca inferior (56 mL);
colocar as fezes até que o conteúdo do frasco alcance a marca superior (60 mL);
introduzir no frasco de Stoll uma dezena de pérolas de vidro, arrolhar bem e agitar vagarosamente;
deixar agir a soda durante uma hora ou mais, para clarificar a preparação e tornar a agitar fortemente. Obtém-se deste modo uma suspensão homogênea, onde a diluição da amostra fecal é de 1 para 15;
Após a agitação, pipetar 0,15 mL da suspensão, colocá-la sobre uma lâmina, cobri-la com lamínula (22 X 40mm) e levar ao microscópio para contagem;
Percorrer toda a área da lâmina, contando o número de ovos de determinada espécie aí existente. 
Contagem da lâmina:
com aumento pequeno ou médio, focalizar um dos ângulos da lamínula (anterior esquerdo, por exemplo);
deslocar a preparação sempre no mesmo sentido, procedendo à contagem até alcançar o canto oposto (anterior direito);
deslocar a preparação para frente, de tal modo que o novo campo microscópico seja tangente à anterior (ou que as partículas que apreciam no extremo inferior do campo passem a ser vistas no extremo superior);
deslocar a lâmina em direção á margem esquerda e assim sucessivamente. 
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PESQUISA DE PROTOZOÁRIOS NAS FEZES
PESQUISAS DE CISTOS
AULA PRÁTICA 9 – Método de Faust (ou centrífugo-flutuação no sulfato de zinco).
Utilização: técnica utilizada para pesquisa de cistos.
Técnica: 
Preparar uma solução de sulfato de zinco 33%, cuja densidade é igual a 1,180.
Desmanchar a amostra fecal em água, na proporção de 1 para 10 partes, aproximadamente, utilizando-se água filtrada para evitar a contaminação com protozoários de vida livre;
Filtrar e através da gaze dobrada em quatro, para um tubo de centrífuga e centrifugar a 2,500 rotações por minuto, durante um minuto;
Decantar o sobrenadante, ressuspender o sedimento em água e centrifugar novamente. Repetir esta operação até que o líquido sobrenadante fique relativamente claro. Em geral, bastam três lavagens;
Decantar a água da última lavagem e ressuspender o sedimento na solução de sulfato de zinco. Centrifugar. Nesta operação, dada a densidade do meio, os cistos de protozoários e algumas espécies de ovos de helmintos passam a flutuar e concentram-se numa película fina, situada na superfície do líquido sobrenadante;
Com uma alça de platina, cujo aro estará disposto perpendicularmente ao cabo, tocar levemente a superfície do líquido para que a película, aderindo a alça, possa ser removida e transportada para uma lâmina. Repetir este procedimento quatro ou cinco vezes;
Adicionar à preparação uma gota de lugol a fim de tornar os cistos e suas estruturas internas mais visíveis, cobrir com lamínula e examinar ao microscópio (aumento médio ou grande a seco).
AULA PRÁTICA 10 – Método de Ritchie (ou concentração com formol-éter).
Utilização: técnica utilizada para pesquisa de trofozoitas e cistos.
Técnica:
Desmanchar previamente a amostra fecal em água filtrada na proporção de 1 para 10 partes (ou tomar 5 mL de mistura de fezes com o conservador MIF);
Filtrar em gaze, para um tubo de centrífuga de 15 mL, e centrifugar a 2,500 rpm;
Decantar o sobrenadante, tomar o sedimento e adicionar 10 mL da solução de formol a 10% (ou solução fisiológica, se o material já estava fixado), deixando em repouso por 5 minutos para a fixação;
Juntar 3 mL de éter sulfúrico (comercial), tampar o tubo e misturar, agitando fortemente;
Centrifugar a 1,500 rpm, durante 1 ou 2 minutos;
OBS: ao fim da operação, o tubo estará com 4 camadas: a primeira com éter, a segunda com detritos sólidos, a terceira aquosa e a quarta constituída de sedimento biológico (cistos e ovos de parasito). Descartar as camadas superiores, tomar os sedimento e examiná-lo ao microscópio com aumento médio ou grande.
AULA PRÁTICA 11 – Método de Hematoxilina Férrica.
Técnica: para a conservação das características morfológicas dos trofozoítos de e cistos de protozoários, a fixação do material deve ser feita dentro de curto prazo após a evacuação (colher material no laboratório ou entregar ao paciente frasco contendo o fixador, e pedir-lhe que misture o líquido às fezes).
Fixador de Schaudinn - permite conservar o material durante semanas ou meses:
Bicloreto de mercúrio em solução saturada ----------------- 200 mL
Álcool absoluto ------------------------------------------------- 100 mL
Ácido acético glacial ------------------------------------------- 15 mL
Adicionar o ácido à solução-estoque pouco antes de usar. Por ser uma solução tóxica, pode-se substituir pelo fixador de Junod (solução aceto-formulado):
Acetato de sódio ----------------------------------------------- 1,5 g
Formol (comercial) -------------------------------------------- 4,0 mL
Ácido acético --------------------------------------------------- 2,0 mL
Água destilada -------------------------------------------------- 92,5 mL
Solução de hematoxilina – prepará-la dissolvendo a quente os cristais em álcool e juntando água aquecida:
Hematoxilina -------------------------------------------------- 1 g
Álcool 95% ---------------------------------------------------- 20 mL
Água destilada ------------------------------------------------- 180 mL
Deixar esfriar e filtrar. Não usá-la antes de decorrido três dias.
OBS: Pode-se preparar uma solução-mãe de hematoxilina a 10% em álcool a 95%, para diluí-la em água no momento de usar.
Solução mordente – prepara uma solução a 5% de sulfato férrico amoniacal, selecionando os cristais cor de violeta:
FeNH4(SO2)2 * 12H2O ------------------------------------- 5 g
Água destilada------------------------------------------------- 100 mL
Fixação e coloração pela hematoxilina – untar a lâmina com um pouco de soro sanguíneo ou clara de ovo, para que o material adira na superfície.
Quando a amostra fecal não está fixada, faz-se um esfregaço (sobre a lamínula) e, sem deixar que seque, coloca-se a lamínula horizontalmente no fixador, durante dez minutos ou mais, com a preparação voltada para cima. 
o excesso de bicloreto e os depósitos de mercúrio reduzido são removidos por passagem em álcool e em álcool iodado. Os tempos sugeridos não exigem muito rigor, podendo ser prolongados.
Submergir a preparação no álcool a 50% durante 2 minutos. Colocar a lamínula com a preparação para baixo, daqui para diante.
Álcool 70% iodado por 2 minutos.
Álcool 70% por 2 minutos.
Álcool 50% por 2 minutos.
Lavar em água corrente, durante 2 minutos;
Submeter à mordençagem no alúmen de ferro a 2, por 5 a 10 minutos (ou 2 minutos se aquecido a 40ºC).
Lavar em água corrente por 2 minutos.
Corar em solução aquosa de hematoxilina a 0,5%, durante 5 minutos.
Lavar em água corrente por 3 minutos.
Diferenciar em alúmen de ferro a 2%, durante o tempo suficiente para que a produção adquirida coloração cinza-azulada clara.
Lavar em água corrente por 10 a 15 minutos.
Passar sucessivamente pela série de álcoois a 50%, a 70%, a 90% e absoluto, sendo 2 minutos em cada um.
Clarificar no creosoto (mistura destilada do alcatrão, contendo hidrocarbonetos, fenol e outros compostos aromáticos) ou em xilol.
Montar com uma gota de bálsamo do Canadá ou resina sintética sobre uma lâmina.
Depois de seca a preparação, observar com objetiva de imersão!
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Colorações utilizadas para parasitos emergentes
Coloração “Acid-Fast”
* Objetivo: identificação de coccídeos Cryptosporidium sp., Isospora belli, Cyclospora cavetanensis; esporos de Microsporídios também podem se corar.
* Princípio: fundamenta-se na característica álcool-ácido resistente dos parasitas.
* Amostra: fezes, escarro, lavado brônquico, biópsia pulmonar, suco duodenal, bile e demais líquidos cavitários ou secreções, preservadas em formalina 10% (1:3), ou “in natura”.
Reagentes: 
Fucsina Carbólica de Kinyoun
Fucsina básica ---------------------- 4 g
Etanol 95% -------------------------- 20 mL
Fenol --------------------------------- 8 mL
Água deionizada (qsp) ------------ 100 mL
Dissolver a fucsina em álcool etílico com freqüente agitação (solução A). Dissolver o fenol em água deionizada (Solução B). Misturar as duas soluções, deixar “over-night” e filtrar. 
Estabilidade de 01 ano, a temperatura ambiente, em frasco âmbar!
Álcool-ácido 10%
Ácido sulfúrico ---------------------- 10 mL
Etanol absoluto ---------------------- 90 mL
Misturar em balão volumétrico de 100 mL. 
Estável a temperatura ambiente por 01 ano.
Verde malaquita 3%
Verde malaquita -------------------- 3 g
Água deionizada -------------------- 100 mL
Dissolver o verde malaquita em água deionizada, utilizando balão volumétrico de 100 mL.
Estabilidade de 01 ano, a temperatura ambiente, em frasco âmbar!
Formalina
Formaldeído ---------------------- 10 mL
Água deionizada ----------------- 90 mL
Homogeneizar em balão volumétrico de 100 mL.
Realização da coloração:
	Preparar esfregaço fino em lâmina com o MB.
	Secar a temperatura ambiente.
	Fixar o esfregaço com metanol por 30 segundos.
	Corar com fucsina carbólica de Kinyoun por 1 minuto.
	Lavar rápido com água deionizada.
	Contracorar com verde malaquita 3% por 2 minutos.
	Secar e levar ao microscópio utilizando objetiva de imersão (100X). 
�Coloração de Kinyoun
* Objetivo: identificação de Cryptosporidium sp., Isospora belli, Cyclospora cavetanensis.
* Princípio: fundamenta-se na característica álcool-ácido resistente dos parasitas.
* Amostra: fezes, escarro, líquidos cavitários ou material de secreção.
Reagentes: 
Fucsina Carbólica de Kinyoun
Fucsina básica ---------------------- 4 g
Etanol 95% -------------------------- 20 mL
Fenol --------------------------------- 8 mL
Água deionizada (qsp) ------------ 100 mL
Dissolver a fucsina em álcool etílico com freqüente agitação (solução A). Dissolver o fenol em água deionizada (Solução B). Misturar as duas soluções, deixar “over-night” e filtrar. 
Estabilidade de 01 ano, a temperatura ambiente, em frasco âmbar!
Álcool-ácido 10%
Ácido sulfúrico ---------------------- 10 mL
Etanol absoluto ---------------------- 90 mL
Misturar em balão volumétrico de 100 mL. 
Estável a temperatura ambiente por 01 ano.
Verde malaquita 3%
Verde malaquita -------------------- 3 g
Água deionizada -------------------- 100 mL
Dissolver o verde malaquita em água deionizada, utilizando balão volumétrico de 100 mL.
Estabilidade de 01 ano, a temperatura ambiente, em frasco âmbar!
Realização da coloração:
Preparar esfregaço fino em lâmina e deixar secar a temperatura ambiente ou na chama do bico de Bunsen.
	Corar com fucsina por 15 minutos, no mínimo.
	Lavar com água deionizada.
Gotejar solução álcool-ácido sobre o esfregaço, até que a solução se torne incolor. 
Lavar com água deionizada.
Contracorar com verde malaquita 3% por 15 a 60 segundos.
	Lavar com água deionizada e secar a temperatura ambiente.
Examinar ao microscópio com objetiva de imersão (100X). 
�Coloração de safranina
* Objetivo: identificação de Cryptosporidium sp., Isospora belli, Cyclospora caetanensis.
* Princípio: fundamenta-se na característica álcool-ácido resistente dos parasitas.
* Amostra: fezes, escarro, líquidos cavitários ou material de secreção.
Reagentes:
Álcool-ácido 3%
Ácido clorídrico ---------------------- 3 mL
Etanol --------------------------------- 97 mL
Misturar em balão volumétrico de 100 mL. 
Corante de Safranina
Safranina ---------------------------- 1 g
Água deionizada (qsp) ------------- 100 mL
Dissolver a safranina em água deionizada, utilizando o balão volumétrico de 100 mL.
Estabilidade de 01 ano, a temperatura ambiente, em frasco âmbar!
Verde malaquita 3%
Verde malaquita -------------------- 3 g
Água deionizada -------------------- 100 mL
Dissolver o verde malaquita em água deionizada, utilizando balão volumétrico de 100 mL.
Estabilidade de 01 ano, a temperatura ambiente, em frasco âmbar!
Realização da coloração:
	Preparar esfregaço fino em lâmina com o MB e deixar secar.
	Fixar o esfregaço em álcool-ácido por 5 minutos.
	Lavar gentilmente com água deionizada.
Corar com safranina 1%, ferver por 1 minuto.
	Lavar com água deionizada.
	Contracorar com verde malaquita 3% por 2 minutos.
	Lavar gentilmente com água deionizada.
Examinar ao microscópio com objetiva de imersão (100X). 
�Coloração de Tricrômio (modificado por Weber)
* Objetivo: detecção de esporos de microsporídios, cistos de Giardia intestinalis, Entamoeba coli, E. histolytica, Chilomastix mesnili, Endolimax nana, protozoários intestinais excluindo os considerados emergentes; podem ser detectados ovos de helmintos.
* Princípio: baseia-se na detecção de microorganismos através de contraste de cor destes com a contra-coloração da lâmina.
* Amostra: fezes, secreções, líquidos cavitários ou derrames e biópsias.
Reagentes:
Formol 10%
Formoaldeído --------------- 100 mL
Água deionizada ----------- 1000 mL qsp
Corante tricrômio Weber
Chromotrope 2R ----------- 6 g
Verde malaquita ----------- 0,15 g
Ácido Fosfotúngstico ----- 0,7 g
Ácido acético glacial ------ 3 mL
Água deionizada ----------- 100 mL qsp
Misturar o ácido acético glacial com os componentes secos. Homogeneizar bem. Deixar em repouso por 30 minutos à temperatura ambiente. Adicionar 100 mL de água deionizada. Homogeneizar.
Estabilidade de 01 ano, a temperatura ambiente, em frasco âmbar.
Álcool-ácidotricrômio
Ácido acético --------------- 4,5 mL
Álcool etílico 90% --------- 995,5 mL
Etanol 90%
Etanol ----------------------- 900 mL
Água deionizada ---------- 100 mL
Etanol 95%
Álcool etílico -------------- 950 mL
Água deionizada ---------- 50 mL
�Coloração:
	Colocar em frasco coletor uma parte de MB para 3 partes de formol 10%.
	Fazer esfregaço fino, com 10µl de amostra conservada, em lâmina.
	Deixar secar a temperatura ambiente.
	Fixar com metanol 3 a 5 minutos.
	Colocar a lâmina no corante tricrômio por 90 minutos.
	Lavar em álcool-ácido por 1 a 3 segundos.
	Lavar em etanol 95% mergulhando por 5 segundos.
	Colocar em etanol por 1 minuto (2 trocas).
	Colocar em xilol por 10 minutos e esperar secar.
	Observar ao microscópio com objetiva de imersão (100X).
�Coloração de Gram Chromotrope (modificado por Wheatly)
* Objetivo: detecção de esporos de microsporídios através do contraste de cor destes com o fundo da lâmina.
* Princípio: baseia-se na detecção de microorganismos através de contraste de cor destes com a contra-coloração da lâmina.
* Amostra: fezes, secreções, líquidos cavitários ou derrames e biópsias.
Reagentes:
Formol 10%
Formoaldeído --------------- 100 mL
Água deionizada ----------- 1000 mL qsp
 Ou
Formol 37% ---------------- 270 mL
Água deionizada ---------- 1000 mL qsp
Solução de violeta 1%
Solução 1
Cristal violeta ---------------- 25 mL qsp
Etanol ------------------------- 250 mL qsp
Solução 2
	Oxalato de amônio --------- 10 g
	Água deionizada ----------- 1000 mL qsp
Misturar em balão volumétrico de 1000 mL, juntar solução 1 e 2 e homogeneizar.
Lugol de Gram
Solução 1
Hidróxido de sódio ----------- 4 g
Água deionizada -------------- 25 mL
Solução 2
	Iodo metálico ----------------- 2 g
	Iodeto de potássio ------------ 1 g
Misturar as duas soluções, adicionar 97 mL de água deionizada e homogeneizar.
Álcool Acetona
Acetona ------------------ 75 mL
Éter etílico --------------- 25 mL
Corante tricrômio Weber
Chromotrope 2R ----------- 6 g
Verde malaquita ----------- 0,15 g
Ácido Fosfotúngstico ----- 0,7 g
Ácido acético glacial ------ 3 mL
Água deionizada ----------- 100 mL qsp
Misturar o ácido acético glacial com os componentes secos. Homogeneizar bem. Deixar em repouso por 30 minutos à temperatura ambiente. Adicionar 100 mL de água deionizada. Homogeneizar.
Estabilidade de 01 ano, a temperatura ambiente, em frasco âmbar.
Álcool-ácido tricrômio
Ácido acético --------------- 4,5 mL
Etanol 90% ----------------- 1000 mL qsp
Etanol 90%
Álcool etílico -------------- 900 mL
Água deionizada ---------- 100 mL
Etanol 95%
Álcool etílico -------------- 950 mL
Água deionizada ---------- 50 mL
Coloração:
	Colocar em frasco coletor uma parte da amostra para 3 partes de formol 10%.
	Fazer esfregaço fino, com 10µl de amostra conservada, em lâmina.
	Deixar secar a temperatura ambiente.
Fixar com metanol ou sob a chama do bico de Bunsen (3 vezes, 1 segundo sob a chama, ou 5 minutos a 60ºC em estufa).
Cobrir a lâmina com solução cristal violeta 1%, adicinar 3 gotas de carbonato de sódio 5% e deixar por 2 minutos.
	Lavar o excesso com água deionizada.
	Cobrir a lâmina com lugol de gram por 2 minutos.
Lavar com água deionizada.
	Descorar com mistura acetona-éter.
Colocar no corante tricrômio por 10 minutos.
	Colocar em álcool-ácido por 1 a 3 segundos.
Lavar em etanol 95% mergulhando.
Colocar em etanol PA por 1 minuto e 2 trocas.
	Deixar secar e observar ao microscópio com objetiva de imersão (100X).
�Coloração de Leishman
* Objetivo: visualização e identificação de Blastocystis hominis.
* Princípio: baseia-se na detecção de microrganismos através da coloração destes parasitas.
* Amostra: fezes, secreções, líquidos cavitários ou de derrames e biópsias. 
Reagentes:
Laboazul
Solução aquosa concentrada de 1-2-3 Propanetricarboxylic acid, 2 Hydroxy Cooper Sodium Salt (1.2.1) Tetrahydrate
Estável por 02 anos em temperatura ambiente.
Leishman
Leishman ---------------------- 2,5 g
Álcool metílico --------------- 1000 mL
Adicionar o Leishman no frasco do álcool metílico. Agitar. Deixar descansar por aproximadamente 24 horas. Filtrar e armazenar em frasco âmbar por 02 anos.
Água deionizada 
Óleo de imersão
Coloração:
	Verificar a presença de vermes, ao abrir o frasco.
	Homogeneizar o material acrescentando 3 gotas de laboazul.
Fazer um esfregaço fino deixando secar a temperatura ambiente ou na chama do bico de Bunsen.
	Cobrir a lâmina com Leishman por 3 a 5 minutos.
Gotejar sobre a lâmina água deionizada de maneira a se obter uma diluição do corante para mais ou menos a metade, homegeneizar a mistura e deixar mais 15 minutos. 
Lavar em água deionizada e deixar secar à temperatura ambiente.
Fazer a leitura em microscópio óptico em objetiva de imersão (100X), após adição de óleo de imersão.
Exame microscópico do exame coprológico de fezes
Após o exame macroscópico das fezes como aspecto, consistência, reação e pH, Cor, odor, muco e vicosidade; homogeneizar bem as fezes observando se há presença de vermes adultos ou parte deles, diluir as fezes em água, coar e preparar três lâminas:
1 gota de solução fisiológica + 1 gota de suspensão das fezes com lamínula ( melhor para resíduos vegetais)
1 gota de lugo1 + 1 gota de suspensão de fezes ( melhor para resíduo animal e intestinal)
1 gota de suspensão de fezes + 1 gota de Sudam III (para identificação de gordura neutras)
Classificamos como material semilógico as estruturas abaixo porque para realizar o Exame Coprológico e feito uma dieta alimentar e estamos avaliando a digestão e/ou absorção do indivíduo que efetuou a dieta adequadamente. O que não classificamos é denominado de material não semiológico ou estroma. 
RESÍDUOS DE ORIGEM ANIMAL
Fibra muscular
mal digerida
em digestão
digestão avançada (lugol) (sudam III)
Gorduras (lugol) (sudam III)
3)Tecido conjuntivo
RESÍDUOS DE ORIGEM VEGETAL
 
 4)Celulose Digestível
A)Amido
amido amorfo
amido incluído
amido cru
 B) Vegetais
fibra vegetal
pelo vegetal
esporo vegetal
vaso vegetal
 C) Cristais (40x)
Oxalato de cálcio
Fosfato amoníaco magnesiano (fosfato triplo)
Ácidos graxos
Caroteno
Charcot-Leyden
Colesterol
Outros (medicamentos, sulfas, etc...)
5)Celulose Indigestível
 RESÍDUOS DE ORIGEM INTESTINAL
6) Muco
 
7) Células intestinais de descamações
8) hemácias, leucócitos
9) Microbiota bacteriana
Iodófila cocos bacilos leveduras
não iodófila cocos bacilos leveduras
Referência Bibliográfica:
Rey, L. 1991. Parasitologia. Ed. Guanabara Koogan, 2ª edição. 731p. 
	 
	Pesquisa de Sangue Oculto
	 
	Reação de Guáiaco ( existe o Kit Hemoccult II que é baseado na prova de guáiaco) 
	alcool etílico a 95%
	goma guáico em pó:
	Pulverizar e agitar até a saturação, preparar no momento de uso
	 
	Metodologia:
	Fazer um esfreçago com fezes em um papel de filtro, gotejando 2 a 3 gotas de acido acético 
	 glacial e 2 a 3 gotas de uma solução recem preparada de álcool etílico saturado com goma de guáico em pó.
	Juntar igual quantidade de peróxido de hidrogênio 10 vol
	Misturar bem com um bastão de vidro e observar o desenvolvimento de coloração azum em 5 min
	Cor esverdeada é negativa
	 
	 
	Reação de Meyer- Johannessen
	fenolftaleina 2g
	hidróxido de potássio anidro 20g
	água destilada qsp 100mL
	aquecer até fervura (rosa) acrescentando 10 a 30g de zinco em pó para obtenção dedescoloração completa.
	Filtrar e guardar em frasco ambar, com um pouco de zinco em pó , no fundo do frasco.
	 
	Metodologia
	fazer uma suspensão de fezes de 5%, passar 5 mL para um tudo de ensaio e juntar 1 mL de reativo de 
	Meyer-Johnannessen. Acrescentar 3 a 4 gotas de peróxido de hidrogênio 10 vol
	positiva quando desenvolve coloração rósea imediatamente.
	 
	
	Pesquisa de Gordura nas fezes
	corante: Sudam III
	alcool 70º
	acetona
	Sudam III até saturação ( ou Sudão III)
	 
	Triturar o corante em GRALL, previamente aquecido e depois acrescentar a solução aos poucos
	Deixar na estufa a 37º por 24 horas
	Filtrar em papel de filtro antes de usar
	( na prática usar 1g do corante para 100 mL da mistura de alcool-acetona)
	 
	Sudão III - é o benzeno-azobenzeno-azobetanaftol
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Profª Meire Cristina Alves de Castro Pauleto
Diagramação: Elsa Minami Kume
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