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Carlos de Souza Freitas Junior Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) Maceió, julho de 2022 Introdução A cromatografia é uma técnica usada para separar os diferentes componentes de uma amostra baseada na diferença de interação entre os componentes da mistura com a fase estacionária (adsorvente) e a fase móvel (fluido).. A fase estacionária pode ser um sólido ou um líquido depositado num sólido inerte, empacotado numa coluna ou espalhado por uma superfície formando uma camada fina. Em resumo, trata-se de uma técnica de separação, de modo que a partir das propriedades de cada composto, é possível definir um mecanismo de separação, propiciando as condições necessárias para que cada composto de interesse chegue até o detector em momentos diferentes gerando um sinal quantificável A cromatografia de origem no termo grego “chroma+graphein” ganhou importância como método de separação por volta de 1903, com o botânico Mikhail Semenovich Tswett nascido em Asti (Itália), sendo a sua família de origem russa. Este investigador desenvolveu vários trabalhos experimentais no domínio da separação de extractos de plantas por adsorção diferencial em colunas, usando carbonato de cálcio como fase estacionária e di-sulfureto de carbono como eluente. Nestas experiências, verificou-se a formação de bandas de cores diferentes nas colunas utilizadas devido à adsorção diferencial dos pigmentos corados, que percolavam com velocidades diferentes e emergiam separadamente da coluna. Este investigador foi mais tarde considerado o pai da cromatografia devido à sua valiosa contribuição no desenvolvimento desta técnica. O que é cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)? A cromatografia pode ser classificada como planar e colunar, existindo dessa forma vários tipos de cromatografia por exemplo, cromatografia gasosa, líquida, de camada delgada, etc. A cromatografia líquida de alta eficiência – CLEA ou também conhecida com a sigla HPLC (High Performance Liquid Cromatography) faz parte do grupo de classificação da cromatografia colunar. Essa técnica cromatográfica normalmente é empregada em amostras de alimentos, água, solo, sangue, urina, etc. Esse tipo de cromatografia obteve um avanço significativo a partir dos anos 70, e desde então vem apresentando novas sofisticações tecnológicas, dentre elas a utilização de colunas preenchidas por partículas de pequenos tamanhos, desenvolvimento e aperfeiçoamento de vários detectores por exemplo fluorescência, espectrofotômetros de massa acoplados ao HPLC, e dentre outros avanços que ocorreram desde a descoberta do equipamento. Ela tem a capacidade de realizar separações e análises quantitativas de uma grande quantidade de compostos presentes em vários tipos de amostras, em escala de tempo de poucos minutos, com alta resolução, eficiência e sensibilidade. Equipamento de HPLC O equipamento para a realização desse tipo de cromatografia é denominado de cromatógrafo líquido que é constituído por vários sistemas, sendo eles: • Sistema de reservatório de fase móvel; • Sistema de bombeamento de fase móvel; • Sistema de injeção; • Sistema analítico que é constituído pela coluna cromatográfica; • Sistema de detecção (existe detecção por UV, fluorescência, espectrofotometria de massas, etc.); • Sistema de aquisição e registro de dados. Princípio de Funcionamento Um solvente líquido (fase móvel) é transportado continuamente com auxílio de bomba até a coluna cromatográfica (fase estacionária), através de um sistema de injeção automático, a amostra é inserida neste sistema, as diferentes interações entre as moléculas presentes na amostra e a fase estacionária fazem com que estas tenham tempo de retenção distintos no sistema fazendo com que seja possível separar os compostos presentes na amostra. Com emprego e injeções prévias dos padrões em estudo pode-se quantificar os compostos detectados. Na técnica, coloca-se um pequeno volume de uma amostra líquida numa coluna cromatográfica com partículas porosas (fase estacionária). Então um reagente é dispensado na coluna, fazendo com que os componentes da mistura se desloquem através da coluna. Fases da Cromatografia Líquida Na cromatografia líquida existe um sistema composto por duas fases, uma fase móvel e outra fase denominada de estacionária. Na fase estacionária podem ser utilizados compostos sólidos ou líquidos. Os sólidos normalmente são substâncias absorventes, tais como, sílica, carvão ativo, etc., que se encontram “empacotadas” em uma coluna, a qual é atravessada pela fase móvel. Nesse caso a base para a separação de misturas é chamada de absorção. Já o composto líquido da fase estacionárias é denominado de película delgada, sendo que nesse caso a base de separação de misturas é denominado de partição. Na fase móvel emprega-se uma mistura de alguns solventes, por exemplo, metanol, acetonitrila e água, sendo que essa mistura é denominada de eluente. Normalmente para a fase móvel existem alguns critérios quanto aos solventes, tais como: • O grau de pureza dos solventes, • Baixa viscosidade; • Dissolução da amostra sem perda dos compostos; • Polaridade adequada para a realização da separação dos componentes da amostra. Aquisição de dados e resultados Para a cromatografia normalmente se utiliza sistemas de computação ou automação. Esses sistemas têm o intuito de aumentar a capacidade de utilização dos aparelhos, por meio de injeção de amostra, inserção de dados das amostras e métodos, aquisição e tratamento de dados. A aquisição e tratamento de dados irá definir a precisão de um pico gerado no cromatograma, além de permitir a determinação de tempos e intensidades (áreas e alturas dos picos), lembrando que normalmente os gráficos gerados apresentam uma relação de tempo e sinal do detector para os analitos como pode ser verificado abaixo: Possuindo um cromatógrafo líquido dotado de uma metodologia correta é possível, com apenas uma etapa de diluição e filtragem em membrana, analisar todas as amostras do processo e realizar a quantificação de diversos compostos de interesse Principais Aplicações: Essa técnica é utilizada para uma grande diversidade de amostras incluindo: alimentos, fármacos e produtos naturais. A HPLC é utilizada em análises de compostos não voláteis ou instáveis termicamente onde a cromatografia a gás não pode ser utilizada. Nas análises clínicas é utilizada na detecção de metabólitos, proteínas, peptídeos, aminoácidos etc. Como exemplo temos a dosagem de 25-Hidróxi- vitamina D, Hemoglobina glicada, hormônios esteroides, entre outras. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Espectrofotometria de Massa Com o desenvolvimento das tecnologias a cromatografia pode ser relacionada com diferentes sistemas de detecção, sendo um deles a espectrofotometria de massas. Essa junção garante alta sensibilidade e eficiência na separação das fases, além de obter informações referentes aos compostos analisados, por exemplo, a massa molar, estrutura química, seletividade, dentre outros. De acordo com a IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry), a espectrofotometria de massas pode ser definida como a análise da matéria através da formação de íons em fase gasosa e consequentemente caracterizados de acordo com sua massa, carga, estrutura e propriedades físico- químicas. Em suma, a cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrofotometria de massas pode ser utilizada em aplicações forenses, ambientais, substâncias químicas, farmacêuticas, alimentícias e dentre outras áreas. https://iupac.org/ Cromatografia Líquida de Ultra Alta Eficiência (UHPLC) Essa Tecnologia é baseada no princípio de que partículas menores levam a uma maior Eficiência, separações mais rápidas com Resoluçãoe Sensibilidade Superiores. No entanto, para tolerar a pressão extrema de partículas menores que 2 μm, o Sistema precisa ser capaz de lidar com Alta pressão de trabalho. A Eficiência que essas Colunas produzem não deve ser perdida em nenhum outro lugar no volume morto do instrumento. Os Equipamentos de UHPLC foram projetados para lidar com isso. Como os Equipamentos de UHPLC têm um custo elevado, sempre há o desejo de usar o Equipamento de HPLC existente e alcançar um Desempenho equivalente ao do UHPLC. No final da década de 2000, a Phenomenex lançou Colunas de 2,6 μm com a Tecnologia Kinetex Core-Shell, que fornecem esse Desempenho de UHPLC em um HPLC tradicional. A HPLC e a Engenharia Química na Indústria Sucroalcooleira O monitoramento da concentração do açúcar da cana e das perdas na fabricação de açúcar e etanol sempre foi de fundamental importância para o monitoramento de perdas, atuações no processo de produção e, principalmente, para obtenção dos resultados das eficiências industriais. Apesar de ainda muito pouco explorado pelo setor, o uso da cromatografia, hoje presente em cerca de 30% das usinas brasileiras, é uma tecnologia que vem permitindo as unidades analisar os açúcares reais provenientes da cana-de-açúcar, possibilitando quantificar sacarose, glicose e frutose – além de outros compostos – e obter um resultado real de AT (Açucares Totais) utilizados para cálculos de rendimentos e eficiência industrial. Diferentemente das técnicas clássicas, a tecnologia permite analisar Pol (Sacarose aparente), ART (Açucares Redutores Totais) e AR (Açúcares Redutores) sem a interferência de outras espécies/compostos redutores e quirais, como é o caso da polarimetria. Dessa forma, segundo Douglas Romano Beletti, especialista de Produto da Cetec, além de mensurar os valores de AT (sacarose, glicose e frutose), é possível mensurar os AR’s (glicose e frutose) em uma mesma análise em toda cadeia de produção industrial, medindo desde os açúcares que adentram a indústria, através da análise da cana, assim como perdas industriais em bagaços, tortas, águas e também monitorando e alçando melhores rendimentos de fermentação com a medição dos açucares nos mostos e vinhos residuais. A sacarose da cana-de-açúcar na maior parte das unidades é quantificada como Pol através da polarimetria (desvio da luz polarizada). Neste caso, as amostras necessitam de clarificação e filtração para posterior leitura no sacarímetro. “O gargalo desta técnica se encontra no fato de que, por definição, estamos quantificando a sacarose aparente e, em um meio complexo, podem haver outros compostos com centros quirais capazes de desviar a luz polarizada e gerar desvios como, por exemplo, a dextrana”, explica Beletti. Já a glicose e frutose são quantificadas como açúcares redutores, existindo várias técnicas clássicas capazes de realizar a análise, se destacando nas usinas o método de Lane-eynon (Titulação) e o método Somogy-Nelson (Colorimétrico). As duas são técnicas envolvem reações de oxirredução demandando um preparo reacional e quantificação por titulação ou espectrofotometria respectivamente. Neste caso, os gargalos existem por se tratarem de técnicas com faixas restritas de linearidade, e por empregarem o uso de reagentes em várias etapas de preparo, que podem reproduzir desvios e demandam grande tempo. Por fim, de acordo com Beletti, por ser uma técnica reacional que envolve agentes redutores, a presença de metais, sais e outros açúcares redutores não fermentescíveis são fonte de desvios e quantificações não reais. Para quem ainda não utiliza o sistema de cromatografia, as determinações dos açúcares são realizadas pelos métodos de Eynon-Lane e Somogyi-Nelson, que são baseados na redução do ion de cobre(II). O problema destes métodos é que toda substância capaz de reduzir o íons de cobre(II) será quantificada como açúcar. Essas substâncias são comumente denominadas de substâncias redutoras infermentescíveis, que se presentes em altas concentrações (como o caso do melaço e mosto preparado com melaço e vinho) podem superestimar a concentração de açúcares e, consequentemente, subestimar as eficiências industriais. Com o uso dos cromatógrafos é possível facilitar o gerenciamento das análises, pois com apenas um equipamento é possível analisar amostras de baixa e alta concentração de açúcares. A geração de resíduo também é menor e menos toxico. Diminui o fator humano na obtenção do resultado e melhora a rastreabilidade, pois análises são automatizadas e todos os resultados ficam registrados no equipamento. Com o equipamento é possível determinar ainda o glicerol, um subproduto da fermentação, e o manitol, uma substância produzida por bactérias heterofermentativas como o Leuconostoc Mesenteroides, responsável pela produção de dextrana. Algumas usinas utilizam o equipamento para controle do processo de fermentação, resultando em ganho de tempo em cada ciclo fermentativo. Ainda, devido a rapidez na obtenção de resultados, é possível aumentar a frequência do monitoramento das perdas de açúcar. O principal benefício é que o equipamento mede o que queremos medir, isto é, com o método cromatográfico são determinados a sacarose, frutose e glicose sem a interferências das substâncias infermentescíveis que superestimam os resultados obtidos pelos métodos tradicionais. A medição dos açúcares reais da cana permite uma avaliação mais realista do processo de fabricação de açúcar e etanol, destaca. A cromatografia é uma das técnicas analíticas mais utilizadas no mundo, além de permitir a separação e quantificação real dos compostos de interesse, traz maior precisão, reprodução e operacionalidade na rotina analítica diária. Nos laboratórios de usinas sucroenergéticas, o primeiro grande benefício é a quantificação real de açúcares que tem um impacto direto na eficiência industrial e controle de processo. Também elimina o uso de diversos reagentes químicos, assim como a utilização de técnicas clássicas com diversas fontes de erros e que demandam bastante tempo do analista e geram resultados com atrasos que não permitem o controle do processo em tempo real. Na cromatografia, com simples preparo de amostras, diluição e filtragem, podemos obter resultados precisos e reais em cerca de dez minutos. Em um futuro próximo espera-se que a grande maioria das usinas possuam este tipo de equipamento instalados em seus laboratórios, não apenas para a determinação de açúcares, mas também para as mais diversas aplicações, como determinação de nutrientes do mosto e determinação de ácidos orgânicos, importantes para o monitoramento do processo. Referências [1] - L. S. Ettre, “M.S. Tswett and the invention of chromatography”, LCGC North America, 21 (2003) 458-467. [2] – Raymond P. W. Scott, “Principles and Practice of Chromatography”, Chrom-Ed Book Series (2003), http://www.library4science.com/ [3] - Garret, J.S., “Introduction to Chromatographic Separations”, On-line Course (CEM333) in Michigan State University (2000) [4] – F. A. P. Garcia and E. M. V. Pires, “Chromatography”, Recovery Processes for Biological Materials, edited by J.F. Kennedy and J. M. S. Cabral (1993) 415-451. [5] – Farooq, S. and Ruthven, D. M., “Heat effects in adsorption column dynamics: 2. experimental validation of the one-dimensional model”, Industrial & Engineering Chemistry, 29 (1990) 1084. [6] – Butt, J. B., “Reaction Kinetics and Reactor Design”, Prentice-Hall: Englewood Cliffs (1980), 274. http://www.library4science.com/
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