4 - Cromatografia HPLC - Laboratório de Química 4

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Carlos de Souza Freitas Junior 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Maceió, julho de 2022 
Introdução 
A cromatografia é uma técnica usada para separar os diferentes componentes 
de uma amostra baseada na diferença de interação entre os componentes da 
mistura com a fase estacionária (adsorvente) e a fase móvel (fluido).. A fase 
estacionária pode ser um sólido ou um líquido depositado num sólido inerte, 
empacotado numa coluna ou espalhado por uma superfície formando uma 
camada fina. Em resumo, trata-se de uma técnica de separação, de modo que a 
partir das propriedades de cada composto, é possível definir um mecanismo de 
separação, propiciando as condições necessárias para que cada composto de 
interesse chegue até o detector em momentos diferentes gerando um sinal 
quantificável 
A cromatografia de origem no termo grego “chroma+graphein” ganhou 
importância como método de separação por volta de 1903, com o botânico 
Mikhail Semenovich Tswett nascido em Asti (Itália), sendo a sua família de 
origem russa. Este investigador desenvolveu vários trabalhos experimentais no 
domínio da separação de extractos de plantas por adsorção diferencial em 
colunas, usando carbonato de cálcio como fase estacionária e di-sulfureto de 
carbono como eluente. Nestas experiências, verificou-se a formação de bandas 
de cores diferentes nas colunas utilizadas devido à adsorção diferencial dos 
pigmentos corados, que percolavam com velocidades diferentes e emergiam 
separadamente da coluna. Este investigador foi mais tarde considerado o pai da 
cromatografia devido à sua valiosa contribuição no desenvolvimento desta 
técnica. 
 
O que é cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)? 
A cromatografia pode ser classificada como planar e colunar, existindo dessa 
forma vários tipos de cromatografia por exemplo, cromatografia gasosa, líquida, 
de camada delgada, etc. 
A cromatografia líquida de alta eficiência – CLEA ou também conhecida com a 
sigla HPLC (High Performance Liquid Cromatography) faz parte do grupo de 
classificação da cromatografia colunar. Essa técnica cromatográfica 
normalmente é empregada em amostras de alimentos, água, solo, sangue, urina, 
etc. 
Esse tipo de cromatografia obteve um avanço significativo a partir dos anos 70, 
e desde então vem apresentando novas sofisticações tecnológicas, dentre elas 
a utilização de colunas preenchidas por partículas de pequenos tamanhos, 
desenvolvimento e aperfeiçoamento de vários detectores por exemplo 
fluorescência, espectrofotômetros de massa acoplados ao HPLC, e dentre 
outros avanços que ocorreram desde a descoberta do equipamento. 
Ela tem a capacidade de realizar separações e análises quantitativas de uma 
grande quantidade de compostos presentes em vários tipos de amostras, em 
escala de tempo de poucos minutos, com alta resolução, eficiência e 
sensibilidade. 
Equipamento de HPLC 
O equipamento para a realização desse tipo de cromatografia é denominado 
de cromatógrafo líquido que é constituído por vários sistemas, sendo eles: 
• Sistema de reservatório de fase móvel; 
• Sistema de bombeamento de fase móvel; 
• Sistema de injeção; 
• Sistema analítico que é constituído pela coluna cromatográfica; 
• Sistema de detecção (existe detecção por UV, fluorescência, 
espectrofotometria de massas, etc.); 
• Sistema de aquisição e registro de dados. 
 
Princípio de Funcionamento 
Um solvente líquido (fase móvel) é transportado continuamente com auxílio de 
bomba até a coluna cromatográfica (fase estacionária), através de um sistema 
de injeção automático, a amostra é inserida neste sistema, as diferentes 
interações entre as moléculas presentes na amostra e a fase estacionária fazem 
com que estas tenham tempo de retenção distintos no sistema fazendo com que 
seja possível separar os compostos presentes na amostra. Com emprego e 
injeções prévias dos padrões em estudo pode-se quantificar os compostos 
detectados. 
Na técnica, coloca-se um pequeno volume de uma amostra líquida numa coluna 
cromatográfica com partículas porosas (fase estacionária). Então um reagente é 
dispensado na coluna, fazendo com que os componentes da mistura se 
desloquem através da coluna. 
 
 
Fases da Cromatografia Líquida 
Na cromatografia líquida existe um sistema composto por duas fases, uma fase 
móvel e outra fase denominada de estacionária. 
Na fase estacionária podem ser utilizados compostos sólidos ou líquidos. 
Os sólidos normalmente são substâncias absorventes, tais como, sílica, carvão 
ativo, etc., que se encontram “empacotadas” em uma coluna, a qual é 
atravessada pela fase móvel. Nesse caso a base para a separação de misturas 
é chamada de absorção. 
Já o composto líquido da fase estacionárias é denominado de película delgada, 
sendo que nesse caso a base de separação de misturas é denominado 
de partição. 
Na fase móvel emprega-se uma mistura de alguns solventes, por exemplo, 
metanol, acetonitrila e água, sendo que essa mistura é denominada de eluente. 
Normalmente para a fase móvel existem alguns critérios quanto aos solventes, 
tais como: 
• O grau de pureza dos solventes, 
• Baixa viscosidade; 
• Dissolução da amostra sem perda dos compostos; 
• Polaridade adequada para a realização da separação dos componentes 
da amostra. 
Aquisição de dados e resultados 
Para a cromatografia normalmente se utiliza sistemas de computação ou 
automação. Esses sistemas têm o intuito de aumentar a capacidade de utilização 
dos aparelhos, por meio de injeção de amostra, inserção de dados das amostras 
e métodos, aquisição e tratamento de dados. 
A aquisição e tratamento de dados irá definir a precisão de um pico gerado no 
cromatograma, além de permitir a determinação de tempos e 
intensidades (áreas e alturas dos picos), lembrando que normalmente os 
gráficos gerados apresentam uma relação de tempo e sinal do detector para os 
analitos como pode ser verificado abaixo: 
 
Possuindo um cromatógrafo líquido dotado de uma metodologia correta é 
possível, com apenas uma etapa de diluição e filtragem em membrana, analisar 
todas as amostras do processo e realizar a quantificação de diversos compostos 
de interesse 
Principais Aplicações: 
Essa técnica é utilizada para uma grande diversidade de amostras incluindo: 
alimentos, fármacos e produtos naturais. 
A HPLC é utilizada em análises de compostos não voláteis ou instáveis 
termicamente onde a cromatografia a gás não pode ser utilizada. 
Nas análises clínicas é utilizada na detecção de metabólitos, proteínas, 
peptídeos, aminoácidos etc. Como exemplo temos a dosagem de 25-Hidróxi-
vitamina D, Hemoglobina glicada, hormônios esteroides, entre outras. 
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a 
Espectrofotometria de Massa 
Com o desenvolvimento das tecnologias a cromatografia pode ser relacionada 
com diferentes sistemas de detecção, sendo um deles a espectrofotometria de 
massas. Essa junção garante alta sensibilidade e eficiência na separação das 
fases, além de obter informações referentes aos compostos analisados, por 
exemplo, a massa molar, estrutura química, seletividade, dentre outros. 
De acordo com a IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry), a 
espectrofotometria de massas pode ser definida como a análise da matéria 
através da formação de íons em fase gasosa e consequentemente 
caracterizados de acordo com sua massa, carga, estrutura e propriedades físico-
químicas. 
Em suma, a cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a 
espectrofotometria de massas pode ser utilizada em aplicações forenses, 
ambientais, substâncias químicas, farmacêuticas, alimentícias e dentre outras 
áreas. 
https://iupac.org/
 
Cromatografia Líquida de Ultra Alta Eficiência (UHPLC) 
Essa Tecnologia é baseada no princípio de que partículas menores levam a uma 
maior Eficiência, separações mais rápidas com Resoluçãoe Sensibilidade 
Superiores. No entanto, para tolerar a pressão extrema de partículas menores 
que 2 μm, o Sistema precisa ser capaz de lidar com Alta pressão de trabalho. A 
Eficiência que essas Colunas produzem não deve ser perdida em nenhum outro 
lugar no volume morto do instrumento. 
Os Equipamentos de UHPLC foram projetados para lidar com isso. Como os 
Equipamentos de UHPLC têm um custo elevado, sempre há o desejo de usar o 
Equipamento de HPLC existente e alcançar um Desempenho equivalente ao do 
UHPLC. No final da década de 2000, a Phenomenex lançou Colunas de 2,6 μm 
com a Tecnologia Kinetex Core-Shell, que fornecem esse Desempenho de 
UHPLC em um HPLC tradicional. 
A HPLC e a Engenharia Química na Indústria Sucroalcooleira 
O monitoramento da concentração do açúcar da cana e das perdas na fabricação 
de açúcar e etanol sempre foi de fundamental importância para o monitoramento 
de perdas, atuações no processo de produção e, principalmente, para obtenção 
dos resultados das eficiências industriais. Apesar de ainda muito pouco 
explorado pelo setor, o uso da cromatografia, hoje presente em cerca de 30% 
das usinas brasileiras, é uma tecnologia que vem permitindo as unidades 
analisar os açúcares reais provenientes da cana-de-açúcar, possibilitando 
quantificar sacarose, glicose e frutose – além de outros compostos – e obter um 
resultado real de AT (Açucares Totais) utilizados para cálculos de rendimentos 
e eficiência industrial. 
Diferentemente das técnicas clássicas, a tecnologia permite analisar Pol 
(Sacarose aparente), ART (Açucares Redutores Totais) e AR (Açúcares 
Redutores) sem a interferência de outras espécies/compostos redutores e 
quirais, como é o caso da polarimetria. Dessa forma, segundo Douglas Romano 
Beletti, especialista de Produto da Cetec, além de mensurar os valores de AT 
(sacarose, glicose e frutose), é possível mensurar os AR’s (glicose e frutose) em 
uma mesma análise em toda cadeia de produção industrial, medindo desde os 
açúcares que adentram a indústria, através da análise da cana, assim como 
perdas industriais em bagaços, tortas, águas e também monitorando e alçando 
melhores rendimentos de fermentação com a medição dos açucares nos mostos 
e vinhos residuais. 
A sacarose da cana-de-açúcar na maior parte das unidades é quantificada como 
Pol através da polarimetria (desvio da luz polarizada). Neste caso, as amostras 
necessitam de clarificação e filtração para posterior leitura no sacarímetro. “O 
gargalo desta técnica se encontra no fato de que, por definição, estamos 
quantificando a sacarose aparente e, em um meio complexo, podem haver 
outros compostos com centros quirais capazes de desviar a luz polarizada e 
gerar desvios como, por exemplo, a dextrana”, explica Beletti. 
Já a glicose e frutose são quantificadas como açúcares redutores, existindo 
várias técnicas clássicas capazes de realizar a análise, se destacando nas 
usinas o método de Lane-eynon (Titulação) e o método Somogy-Nelson 
(Colorimétrico). As duas são técnicas envolvem reações de oxirredução 
demandando um preparo reacional e quantificação por titulação ou 
espectrofotometria respectivamente. Neste caso, os gargalos existem por se 
tratarem de técnicas com faixas restritas de linearidade, e por empregarem o uso 
de reagentes em várias etapas de preparo, que podem reproduzir desvios e 
demandam grande tempo. Por fim, de acordo com Beletti, por ser uma técnica 
reacional que envolve agentes redutores, a presença de metais, sais e outros 
açúcares redutores não fermentescíveis são fonte de desvios e quantificações 
não reais. 
Para quem ainda não utiliza o sistema de cromatografia, as determinações dos 
açúcares são realizadas pelos métodos de Eynon-Lane e Somogyi-Nelson, que 
são baseados na redução do ion de cobre(II). O problema destes métodos é que 
toda substância capaz de reduzir o íons de cobre(II) será quantificada como 
açúcar. Essas substâncias são comumente denominadas de substâncias 
redutoras infermentescíveis, que se presentes em altas concentrações (como o 
caso do melaço e mosto preparado com melaço e vinho) podem superestimar a 
concentração de açúcares e, consequentemente, subestimar as eficiências 
industriais. 
Com o uso dos cromatógrafos é possível facilitar o gerenciamento das análises, 
pois com apenas um equipamento é possível analisar amostras de baixa e alta 
concentração de açúcares. A geração de resíduo também é menor e menos 
toxico. Diminui o fator humano na obtenção do resultado e melhora a 
rastreabilidade, pois análises são automatizadas e todos os resultados ficam 
registrados no equipamento. 
Com o equipamento é possível determinar ainda o glicerol, um subproduto da 
fermentação, e o manitol, uma substância produzida por bactérias 
heterofermentativas como o Leuconostoc Mesenteroides, responsável pela 
produção de dextrana. Algumas usinas utilizam o equipamento para controle do 
processo de fermentação, resultando em ganho de tempo em cada ciclo 
fermentativo. Ainda, devido a rapidez na obtenção de resultados, é possível 
aumentar a frequência do monitoramento das perdas de açúcar. 
O principal benefício é que o equipamento mede o que queremos medir, isto é, 
com o método cromatográfico são determinados a sacarose, frutose e glicose 
sem a interferências das substâncias infermentescíveis que superestimam os 
resultados obtidos pelos métodos tradicionais. A medição dos açúcares reais da 
cana permite uma avaliação mais realista do processo de fabricação de açúcar 
e etanol, destaca. 
A cromatografia é uma das técnicas analíticas mais utilizadas no mundo, além 
de permitir a separação e quantificação real dos compostos de interesse, traz 
maior precisão, reprodução e operacionalidade na rotina analítica diária. Nos 
laboratórios de usinas sucroenergéticas, o primeiro grande benefício é a 
quantificação real de açúcares que tem um impacto direto na eficiência industrial 
e controle de processo. 
Também elimina o uso de diversos reagentes químicos, assim como a utilização 
de técnicas clássicas com diversas fontes de erros e que demandam bastante 
tempo do analista e geram resultados com atrasos que não permitem o controle 
do processo em tempo real. Na cromatografia, com simples preparo de 
amostras, diluição e filtragem, podemos obter resultados precisos e reais em 
cerca de dez minutos. 
Em um futuro próximo espera-se que a grande maioria das usinas possuam este 
tipo de equipamento instalados em seus laboratórios, não apenas para a 
determinação de açúcares, mas também para as mais diversas aplicações, como 
determinação de nutrientes do mosto e determinação de ácidos orgânicos, 
importantes para o monitoramento do processo. 
Referências 
[1] - L. S. Ettre, “M.S. Tswett and the invention of chromatography”, LCGC North 
America, 21 (2003) 458-467. 
[2] – Raymond P. W. Scott, “Principles and Practice of Chromatography”, Chrom-Ed 
Book Series (2003), http://www.library4science.com/ 
[3] - Garret, J.S., “Introduction to Chromatographic Separations”, On-line Course 
(CEM333) in Michigan State University (2000) 
[4] – F. A. P. Garcia and E. M. V. Pires, “Chromatography”, Recovery Processes for 
Biological Materials, edited by J.F. Kennedy and J. M. S. Cabral (1993) 415-451. 
[5] – Farooq, S. and Ruthven, D. M., “Heat effects in adsorption column dynamics: 2. 
experimental validation of the one-dimensional model”, Industrial & Engineering 
Chemistry, 29 (1990) 1084. 
[6] – Butt, J. B., “Reaction Kinetics and Reactor Design”, Prentice-Hall: Englewood 
Cliffs (1980), 274. 
http://www.library4science.com/