Bioquímica - Transcrição do DNA

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Bioquímica - Transcrição do DNA
Dogma central da biologia molecular
Transcrição é o processo de coletar as informações do genoma para sua
replicação.
O RNA é uma molécula temporária; após ser usado, será descartado.
Os nucleotídeos apresentam estruturas semelhantes.
Possuem riboses de dois tipos:
- purinas ( adenina e guanina);
- pirimidinas (uracila [exclusiva do RNA] e citosina);
Ligação fosfodiéster ligando dois nucleotídeos;
Adição 3’ (sentido 5’-3’);
Molécula de RNA é uma fita SIMPLES - como consequência forma pontes de
hidrogênio em determinados locais da própria fita de RNA.
RNA pode formar estruturas específicas - à medida que é sintetizada adquire
conformações dadas por pareamento de bases, fundamentais para seu
funcionamento.
Transcrição
O fenótipo de um organismo é produzido pelos efeitos combinados de todos
os seus genes que agem dentro de limitações impostas pelo meio ambiente.
(interno - corpo + externo);
Como os genes controlam o fenótipo no organismo?
Como as consequências de nucleotídeos dos genes dirigem o crescimento e o
desenvolvimento de uma célula, tecido, órgão ou todo o ser vivo?
A quantidade e o tipo de genes expressos que vão determinar o tipo celular e
sua função.
Transcrição: produção de RNA
Regulando o quanto o RNA mensageiro vai ser transcrito - conseguimos ver o
quanto de uma proteína vamos ter só de olhar a quantidade de RNA
mensageiro.
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3 principais tipos de RNA: RNA mensageiro, RNA ribossômico e RNA
transportador (porém existem outros tipos; pequenos RNAs com capacidade
estrutural ou catalítica (funcionando como enzima).
- Todos os RNAs são produzidos por transcrição;
- mRNA específico para a produção de proteínas;
- t RNA, r RNA e m RNA: não são traduzidos - não são moldes para
produzir proteínas, mas possuem outras funções importantes.
Tipos de RNA
RNA mensageiro (mRNA):
Transfere a informação do gene para os ribossomos (produção de proteína).
Citoplasmático: mRNA ou RNAm
- depende do tamanho da proteína que vai ser feita;
- a cada 3 bases = códon = 1 aminoácido;
- modificado na extremidade 5’; presença de poli A na 3’; sequências não
traduzidas nas duas extremidades.
*códon de início e códon de parada;
*Alterações no RNA mensageiro podem produzir proteínas erradas e até
mesmo não produzir - consequências na célula.
RNA transportador (tRNA):
Transferência de aminoácidos para o complexo mRNA - ribossomo na ordem
correta.
Citosólico: tRNA
- 75 a 80 nucleotídeos;
- conector entre RNA e aminoácidos;
- contém muitas bases modificadas, bases pareadas, estrutura comum
específica.
RNA ribossômico (rRNA) :
Estrutura dos ribossomos
Citosólico: rRNA
- 120 a 5400 nucleotídeos;
- associa-se a proteínas e forma ribossomo (2 subunidades: maior e
menor);
- alguns catalisam formação de ligações peptídicas (ribozimas);
- auxiliam no alinhamento entre RNA mensageiro e ribossomo;
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*”armadura de ferro” - as proteínas se associam e formam o ribossomo;
É necessário estímulo para produzir proteína e o RNA mensageiro para esse
processo → receptores de superfície na membrana plasmática; moléculas
externas se ligam a um receptor específico → gera um efeito molecular na
célula → modificação de proteínas → proteína vai para o núcleo e se liga ao
DNA → induz produção de RNA mensageiro → desencadeando a produção
de proteína necessária.
Transcrição: Síntese de RNA e ou transcrição
- semelhante à síntese de DNA
- precursores são trifosfatos de ribonucleotídeos;
- ocorre na direção 5’ →3’
- enzimas responsáveis: RNA polimerases;
As cadeias de RNA são iniciadas sem a necessidade de primer pré-existente;
A molécula de RNA produzida é complementar e idêntica ao RNA;
Apenas um filamento de DNA é usado como molde para a síntese de uma
cadeia de RNA complementar;
Tem início em sequências específicas denominadas promotores;
PROVA! RNA polimerase é mais independente (porém precisa de um auxílio
para mostrar o local que precisa ser feita a cópia do DNA → promotores) e é
mais passível de erros (o organismo já prevê essas falhas).
A transcrição de genes ocorre em ambas as fitas de DNA.
*em alguns trechos do DNA humano pode haver maior densidade de genes
comparados a outros trechos;
*a RNA polimerase tem que ser adicionada no lugar certo e orientada para a
direção correta;
Etapas da transcrição
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- Fatores de transcrição* se ligam ao promotor e auxiliam a RNA
polimerase na síntese de RNA; *são essas proteínas que vão determinar
o perfil de expressão gênico de uma célula.
- RNA polimerase se une ao promotor;
- Interação RNA polimerase - DNA no local do início da transcrição leva à
abertura da bolha de transcrição por ação da RNA polimerase;
- término da transcrição ocorre quando é alcançada a sequência de
terminação na extremidade 3’ ou com auxílio de proteínas;
- o RNA recém formado é chamado de hnRNA ou pré RNA;
*Região promotora - onde RNA polimerase se liga;
*unidade de transcrição - onde o gene vai ser transcrito;
RNA polimerase - somente uma RNA polimerase nos procariotos.
Eucariotos - três RNA’s polimerases distintas:
- RNA polimerase I - genes do RNA 5,8S, 18S e 28S (ribossômicos);
- RNA polimerase II - mensageiro;
- RNA polimerase II - transportador / ribossômico;
RNA polimerases têm múltiplas atividades:
- reconhecem e ligam sequências específicas de DNA;
- desnaturam o DNA, expondo a sequência de nucleotídeos a ser
copiada;
- mantém estável o híbrido de DNA: RNA na região de síntese;
- renaturam o DNA na região imediatamente posterior à da síntese;
- sozinhas ou com auxílio de proteínas específicas, terminam a síntese do
RNA;
- a transcrição é menos precisa que a replicação (1 rNTP : 10⁴ rNTPs,
enquanto 1 dNTP : 10 ⁷ dNTP na replicação);
RNA polimerase - mais autônoma, porém menos específica; os erros são mais
“aceitáveis” pois o RNA é temporário e em grande quantidade → diferente da
DNA polimerase, que requer fidelidade ao processo, uma vez que o DNA é um
material genético definitivo.
Erro: 1 nucleotídeo errado : 10.000 nucleotídeos (a maioria dos RNAs
mensageiros são com 500 nucleotídeos = chance de mutação dele é bem
baixa);
Ciclo de transcrição de polimerase bacteriana
1º - fator de transcrição - promotor (recrutando RNA polimerase) → promotor
se liga a RNA polimerase → RNA feito → desacopla e a RNA polimerase fica
livre para fazer o processo em outro local.
Transcrição em eucariotos
- ligação dos fatores gerais de transcrição, RNA polimerase, mediador,
complexos de remodelação da cromatina e enzimas modificadoras de
histonas;
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Fatores de transcrição - podem ser de aspecto inibitório ou promotor -
“disputam” o sítio de ligação para ver se a RNA polimerase vai agir ou
não.
Mutação na sequência inicial no DNA (no promotor) ? Os fatores de
transcrição não reconhecem e os genes não são induzidos.
Fatores que iriam inibir a RNA polimerase com mutação vão fazer com
que a RNA polimerase fique mais ativada ou produza mais proteínas em
uma situação que ela deveria estar ativada ou com produção de
proteína reduzida.
Fatores indutores - vão promover a RNA polimerase;
Fatores repressores - vão inibir a RNA polimerase;
Genes são controlados? Proteínas indutoras / repressoras irão disputar
o sítio de ligação = probabilidade de iniciar a transcrição;
O que compõe uma região promotora? associação de proteínas
fracamente ativadas + DNA espaçador + proteínas fortemente
inibitórias + associação fortemente ativadora + associação neutra de
proteínas reguladoras → probabilidade de iniciar a transcrição.
Sequências - cada trecho de sequência do DNA vai ser reconhecido por
um fator específico de transcrição.
Transcrição em eucariotos
- três RNA polimerases*
- as RNA-polimerases sempre necessitam de proteínas auxiliares (fatores
de transcrição);
- os promotores são inicialmente reconhecidos por fatores de
transcrição que, ligados ao DNA, interagem com a RNA-polimerases;
Sequências de término da transcrição são heterogêneasPapirando na vet e med
- terminação intrínseca (faz parte do RNA);
- formação do grampo de terminação do RNA → dentro da RNA
polimerase, que vai perceber e se deslocar do gene (da unidade de
transcrição), se desacopla → terminação intrínseca.
- terminação dependente de ptn Rho → no fim do RNA há uma sequência
de nucleotídeos → proteína Rho reconhece essa sequência e “chuta” a
RNA polimerase do gene → esse reconhecimento ocorre por afinidade
molecular;
Fatores de transcrição não tem acesso à região promotora quando o DNA tá
enovelado → as porções regulatórias dos genes estão mais escondidas
(heterocromatinas);
Eucromatinas = ↑ acesso a região promotora
Os fatores de transcrição modificam a estrutura local da cromatina.
Pré-RNA - aquele produzido pela RNA polimerase (imaturo) → ainda vai sofrer
alterações para se tornar apto ao reconhecimento do ribossomo (para que
ocorra a síntese de proteína) → 3 modificações (splicing, capeamento,
clivagem e poliadenilação).
Capeamento do mRNA
Cap (“proteção” na cabeça do RNA”) - adicionado na extremidade 5’; o CAP é
uma guanina metilada (nucleotídeo); torna a extremidade 5’ mais estável e
menos sensível à quebra; prepara o RNAm para a síntese de proteínas;
RNA sai da RNA polimerase → a enzima do cap vai adicionar o cap na
extremidade 5’ do RNAm.
Cap - proteger a extremidade; fatores de tradução irão se ligar ao cap
(encaminham o RNA ao ribossomo);
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Splicing
Aproximadamente 60% dos genes humanos sofrem splicing de maneiras
diferentes produzindo mRNAs distintos;
Mecanismo de modificação da expressão de seus genes;
O RNA pré mensageiro (composto por éxons e íntrons) → no splicing os
íntrons são deletados e os éxons agregados → são os éxons que irão formar a
sequência que o ribossomo vai acoplar e produzir as proteínas.
O splicing permite fazer rearranjos de acordo com as características que são
necessárias → dispensa a necessidade de ter um gene para cada tipo celular
→ tem-se um “gene padrão” (DNA), ao retirar os éxons e formar arranjos
diferentes consigo produzir diferentes células e diferentes tecidos.
Splicing - retirada dos íntrons
Splicing diferencial - reorganização dos éxons
Sequências conservadas nas junções éxon-íntron (regra GT-AG) e no sítio de
ramificação
→ sequências que determinam começo e fim do íntron, para que eles
sejam retirados;
Spliceossomo - conjunto de proteínas (cada uma com seu papel) que vão
realizar o splicing.
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Clivagem e poliadenilação
Adição de proteção na extremidade 3’ do pré RNA mensageiro → ocorre após
o splicing.
Cauda poli A ou cauda de poliadenina;
Porque adenina? proteínas específicas vão se ligar a adenina criando uma
espécie de proteção da extremidade 3’ → conferindo estabilidade à
extremidade.
Quanto maior a cauda de poli-A, mais estável e mais tempo de vida esse RNA
mensageiro terá.
Após essas três modificações (Capeamento, Splicing, clivagem e
poliadenilação) o RNA mensageiro está maduro e será direcionado do núcleo
para o citoplasma.
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Diferenças na transcrição entre procariotos e eucariotos PROVA!!!
Procariotos - sem membrana nuclear ; não tem organelas ; sem
compartimentalização; só tem ribossomo; RNA polimerase faz RNAm e os
ribossomos já se ligam (tudo no mesmo espaço / rapidez do processo); RNAm
não tem splicing (não tem íntron); não tem splicing diferencial ; não tem cauda
poli A; o RNAm bacteriano (não tem cap 5’, mas possui uma sequência
modificada) e em determinadas porções pode codificar proteínas totalmente
diferentes (policistrônico = 1 RNAm= várias proteínas = mesmo RNA, mas vários
trechos codificantes).
Eucariotos - regidos pela complexidade; com membrana nuclear;
especialização e compartimentalização = organelas = funções específicas e
mais complexas; os processos ocorrem em espaços diferentes; splicing, cap5’ e
cauda poli A; monocistrônico = 1 RNAm = 1 tipo de proteína.
mRNA procarioto
- não tem cauda poli A
- não tem cap 5’ - no lugar tem uma sequência de Shine-Dalgarno
(EXCLUSIVO das bactérias);
- medicamentos podem se ligar na sequência de Shine-Dalgarno e
impedir a multiplicação celular bacteriana (não se liga às células
humanas)
- essa sequência é quem bloqueia a ligação do mRNA ao ribossomo →
sem proteína = bactéria morre.
Núcleolo e síntese de rRNAs
- Nucléolo = fábrica de ribossomos;
- Local de síntese e processamento (45 S) e posterior montagem dos
rRNAs sob a forma de ribossomos;
- rRNA não são capeados ou poliadenilados;
- três rRNAs são formados a partir de um RNA precursor (45 S)
sintetizados pela RNA polimerase I.
- RNA 45 S é clivado em 3 fragmentos: 18S ; 28 S e 5,8 S.
- 18 S + ~30 ptn = ribossomo 40 S (subunidade menor);
- 28 S; 5,8 S e 55(*) + 50 ptn = ribossomo 60 S (subunidade maior);
- Edição do rRNA 45S : o 45 S é produzido pela polimerase I no
nucléolo sofre clivagem e modificação → formando 3 tipos de
rRNA (18S ; 5,8S e 28S).
- Síntese do RNA 5 S
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- único rRNA não sintetizado no nucléolo → produzido no
telômero;
- rRNA 5 S não sofre clivagem a partir de um RNA precursor;
- rRNA 5 S migra para o nucléolo para unir-se aos rRNAs 28S e 5,8S
para formar a subunidade maior do ribossomo.
- transcrito pela RNA polimerase III;
- a composição dos ribossomos eucarióticos e procarióticos é
diferente; essa diferença é o que garante uma conformação em
que o fármaco se ligue somente ao ribossomo bacteriano.
- Transcrição de rRNA (a figura abaixo que estava no slide da aula)
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- Processamento de precursores de tRNA
- os precursores de RNA transportador são pré-formados e
processados para se tornar um tRNA maduro; esse processo de
amadurecimento ocorre por ação de várias enzimas presentes no
núcleo da célula.
- RNA polimerase III quem sintetiza;