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27/09/2022 22:29 Técnicas complementares na reprodução assistida
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Técnicas complementares na reprodução assistida
Profª. Vanessa Nayane Pino Perez
Descrição
Técnicas complementares da reprodução humana assistida. Técnicas e indicações de criopreservação da fertilidade. Tipos de diagnósticos pré-
implantacionais e suas indicações.
Propósito
É importante compreender que, na reprodução assistida, existem técnicas complementares às técnicas convencionais. Com elas, é possível
preservar os gametas, embriões, tecidos ovarianos e óvulos, detectar alguns problemas específicos que possam ser a causa da infertilidade e
alcançar maior probabilidade de uma gravidez bem-sucedida.
Objetivos
Módulo 1
Diagnóstico genético pré-implantacional
Reconhecer os tipos de diagnóstico pré-implantacionais.
Módulo 2
Criopreservação
Descrever as técnicas de preservação da fertilidade.
A fertilização in vitro (FIV) representa uma revolução no tratamento de casais com problemas de infertilidade. Durante a realização da FIV, é
possível utilizar técnicas complementares que têm como objetivo superar problemas específicos que possam ser a causa da infertilidade.
Essas técnicas surgiram como modo de aumentar as possibilidades de uma gravidez bem-sucedida e são procedimentos realizados de
acordo com as necessidades particulares de cada paciente. Consistem em exames ou tratamentos que visam analisar, identificar e tratar
problemas específicos que possam causar a infertilidade ou a transmissão de doenças, especialmente aquelas de origem genética. Assim,
Introdução
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1 - Diagnóstico genético pré-implantacional
Ao �nal deste módulo, você será capaz de reconhecer os tipos de diagnósticos pré-implantacionais.
Introdução ao diagnóstico genético pré-implantacional
O diagnóstico genético pré-implantacional (preimplantation genetic testing, PGT) é um teste que foi inicialmente idealizado para detecção de
mutações gênicas a fim de evitar a transmissão de doenças hereditárias aos filhos.
O primeiro relato de sucesso com esta técnica ocorreu em 1990, com a detecção de uma doença de herança recessiva ligada ao cromossomo X, a
adrenoleucodistrofia. Para isso, foi realizada biópsia embrionária em estágio de clivagem, a técnica de PCR (do inglês, polymerase chain reaction),
verificada a sexagem embrionária e foram excluídos os embriões do sexo masculino, possivelmente portadores do X alterado e candidatos a ter a
doença.
Em 1992, o mesmo grupo reportou o uso do PGT de forma ainda mais específica – para evitar fibrose cística. Portanto, o PGT poderia evitar
inúmeros casos de doenças geneticamente transmissíveis e incuráveis. Além disso, eles viram que alterações estruturais, como as translocações
robertsonianas e as translocações recíprocas, poderiam ser indicações para análise dos embriões.
ao longo deste conteúdo vamos conhecer as principais técnicas complementares empregadas em reprodução assistida, são elas: o teste
genético pré-implantacional (PGT) e a criopreservação de gametas e embriões.
Orientação sobre unidade de medida
Em nosso material, unidades de medida e números são escritos juntos (ex.: 25km) por questões de tecnologia e didáticas. No entanto, o
Inmetro estabelece que deve existir um espaço entre o número e a unidade (ex.: 25 km). Logo, os relatórios técnicos e demais materiais
escritos por você devem seguir o padrão internacional de separação dos números e das unidades.
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Cariótipo apresentando translocação robertsoniana.
Translocações robertsonianas
Forma comum de rearranjo cromossômico que pode ocorrer nos cinco pares de cromossomos acrocêntricos, ou seja, quando o centrômero está mais
próximo das extremidades do que do centro, são eles os cromossomos 13, 14, 15, 21 e 22.
Translocações recíprocas
Quando existe uma troca de partes de informações entre cromossomos diferentes.
A genotipagem do antígeno leucocitário humano (do inglês, Human Leukocyte Antigen) é outra aplicação do PGT que, além de auxiliar na detecção
de embriões afetados, pode contribuir para o tratamento de irmãos que necessitam transplante de medula óssea compatível. A aplicação inicial do
PGT evoluiu para uma visão mais ampla do embrião, o rastreamento das aneuploidias, principal causa do insucesso reprodutivo. Logo, a
identificação dos embriões euploides compreende atualmente a imensa aplicação da biópsia embrionária como forma de melhorar a eficácia da
fertilização in vitro.
Diferentes tipos de testes genéticos pré-implantacionais
No PGT, o conteúdo cromossômico total de uma ou poucas células é analisado com alta sensibilidade e especificidade. No entanto, as células são
obtidas a partir de um método invasivo e é necessário um alto investimento para o laboratório com equipamentos especializados para a biópsia,
como o laser.
Além disso, esse procedimento deve ser conduzido por embriologistas altamente treinados para evitar viés
dependente do operador nos resultados e para garantir o mínimo impacto na viabilidade do embrião.
As denominações para os testes genéticos pré-implantacionais foram sofrendo alterações ao longo dos anos. De acordo com a classificação mais
recente da Sociedade Internacional de Diagnóstico Genético Pré-implantacional (Preimplantation Genetic Diagnosis International Society - PGDIS), as
siglas utilizadas nos diferentes testes genéticos pré-implantacionais são:
PGT-A (Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidies)
O PGT-A (teste pré-implantacional de aneuploidias) é o mais comumente solicitado nos tratamentos de FIV e tem como objetivo fazer um screening
genético para identificar alterações quantitativas nos 23 pares de cromossomos, apontando monossomias que podem ser parciais ou totais,
trissomias, nulissomias etc. Dentre as trissomias mais comuns e compatíveis com a vida estão:
Síndrome de Down
Trissomia do cromossomo 21.
Síndrome de Edwards
Trissomia do cromossomo 18.
Síndrome de Patau
Trissomia do cromossomo 13.
Alterações quantitativas ligadas aos cromossomos sexuais também podem ser compatíveis com a vida, podendo aparecer na forma de trissomia
(XXY - Síndrome de Klinefelter) ou monossomia (X0 - Síndrome de Turner).
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Monossomia do cromossomo X.
Trissomia do cromossomo sexual.
As demais monossomias e trissomias diversas que são frequentemente encontradas nos laudos de PGT-A durante a rotina laboratorial são
consideradas incompatíveis com a vida, seja por não permitirem o processo de implantação, seja por desencadearem uma implantação seguida de
aborto precoce.
Atenção!
Apesar das causas da aneuploidia ainda não serem bem compreendidas, sabemos que o mecanismo cromossômico mais comum é a não
disjunção meiótica pela falha da separação correta de um par de cromossomos durante uma das duas divisões meióticas – geralmente durante a
meiose I.
Os critérios de indicação para a realização do PGT-A, mais comumente empregados, são a idade materna avançada (>38anos), falhas repetidas de
implantação, abortos recorrentes e fator masculino grave. Além disso, o uso do PGT auxilia no aumento de transferência de um único embrião,
diminuindo o risco de gestações múltiplas.
PGT-M (Preimplantation Genetic Testing for Monogenic disorders)
O PGT-M (teste pré-implantacional para identificação de doenças monogênicas) é o teste indicado para casais com alto risco pessoal ou familiar
para doenças monogênicas. Para casais com risco aumentado de gerarem filhos com doenças genéticas, o PGT-M pode ser realizado para
selecionar embriões que não tenham a mutação.Acompanhe a seguir:
Doenças monogênicas
Doenças monogênicas são um grupo de doenças genéticas causadas por uma mutação ou alteração na sequência de DNA de um gene específico e
transmitidas de forma hereditária.
Padronização para Doença Monogênica
Em geral, é necessário fazer um estudo genético prévio da família, chamado de Padronização para Doença Monogênica.
Detecção do histórico familiar
O PGT-M, portanto, é a técnica indicada para evitar a transmissão de doenças hereditárias pré-existentes, como Fibrose Cística,
Síndrome do X-Frágil, Distrofia Muscular, Doença de Huntington, Anemia Falciforme entre outras.
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Como você deve ter percebido, o critério para indicação do PGT-M é o histórico familiar. Atualmente, o PGT-M é realizado para mais de 400
desordens gênicas, incluindo aquelas manifestadas desde o momento do nascimento, até as manifestações tardias, na vida adulta.
PGT-HLA (Preimplantation Genetic Testing for Human Leukocyte Antigen)
Neste caso, não se trata de evitar a transmissão de uma doença pré-existente ao futuro filho, como no PGT-M, ou evitar aneuploidias, como no PGT-
A.
O objetivo do PGT-HLA (teste pré-implantacional para a tipagem do HLA) é gerar uma gravidez a partir da seleção de um embrião com HLA
compatível ao de uma criança afetada por um distúrbio genético que necessite de transplante de células-tronco hematopoiéticas (como nos casos
de talassemia, leucemia etc.), para que tenha chance de cura ou expectativa de vida prolongada.
Após a seleção por PGT-HLA e o nascimento desse bebê, as células tronco hematopoiéticas são coletadas do sangue do cordão umbilical ou da
medula óssea do irmão doador compatível, ou de uma combinação de ambas as fontes, e utilizadas para transplante no irmão afetado. O PGT-HLA
consiste na determinação indireta do HLA para identificar haplótipos compatíveis entre os embriões testados e a criança afetada.
Haplótipos
Haplótipo corresponde à combinação de um grupo de alelos de loci adjacentes, que fazem parte do mesmo cromossomo, geralmente herdados como
uma unidade. Um haplótipo pode ser formado por um ou vários alelos, ou até pelo cromossomo inteiro.
PGT-SR (Preimplantation Genetic Testing for Structural Chromosomal
rearrangements)
PGT-SR (teste pré-implantacional para a detecção de alterações cromossômicas) é o teste genético que identifica alterações cromossômicas
envolvendo rearranjos estruturais nos embriões. Vamos entender melhor?

Indivíduos com rearranjo estrutural balanceado
Nos casos em que um dos parceiros é portador de um rearranjo estrutural balanceado, como uma translocação ou inversão, esse rearranjo
resulta de uma quebra, recombinação ou troca cromossômica, seguida de reconstituição em uma combinação diferente da normalidade e
geralmente não causa fenótipo no portador (um dos parceiros).

Embriões com possíveis rearranjos estruturais desbalanceados
Porém, os embriões gerados por esse indivíduo podem apresentar rearranjos estruturais desbalanceados (ganho ou perda de um segmento
cromossômico), que podem levar a falha de implantação, aborto espontâneo ou síndromes genéticas. Como exemplo, podemos citar as
translocações robertsonianas como as mais comumente encontradas.
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Rearranjo estrutural balanceado
Alterações estruturais sem a perda ou acréscimo do material genético.
PGT-P (Preimplantation Genetic Testing for Polygenic disorders)
O PGT-P (teste pré-implantacional para doenças poligênicas) é a técnica mais recente de todas e ainda pouco difundida. As doenças poligênicas são
influenciadas por variantes genéticas em mais de um gene. A combinação das variantes nesses genes afeta a probabilidade de desenvolver
condições poligênicas durante o curso da vida de um indivíduo.
Durante a classificação dos embriões por esta técnica, cada embrião recebe uma pontuação chamada "Índice
Genômico". Esse índice é calculado a partir da combinação de pontuações poligênicas de diferentes preditores de
doenças e pode ser usado para comparar o risco geral de doença entre embriões e consequentemente auxiliar na
decisão de qual embrião selecionar para fazer a transferência.
Esse índice é utilizado para o cálculo do risco proporcional do desenvolvimento futuro da doença em comparação com o risco médio dessa mesma
doença na população em geral. Diferentemente do que vemos no PGT-A, no qual os embriões são classificados como “normal” ou “alterado”, ou no
PGT-M, em que recebemos o laudo de cada embrião como “portador” ou “afetado”, no PGT-P cada embrião recebe uma “razão de risco” de
desenvolvimento futuro de cada uma das doenças disponíveis para teste.
Saiba mais
As doenças poligênicas avaliadas pelo PGT-P são: diabetes tipo 1 e tipo 2; câncer de mama, de testículo, de próstata; melanoma maligno; carcinoma
basocelular; esquizofrenia; doença arterial coronariana; hipercolesterolemia; hipertensão; risco de ataque cardíaco.
Por outro lado, o PGT-P é uma ferramenta de avaliação de risco e não um método de diagnóstico. Com o uso dessa metodologia, há risco de
descartar embriões que poderiam ter um desfecho saudável em relação à doença poligênica testada. A maioria dessas doenças é influenciada
também por fatores ambientais (estilo de vida, hábitos alimentares) e esses fatores não podem ser considerados na análise embrionária.
NICS (Non-Invasive Preimplantation Aneuploidy Testing)
NICS (teste genético pré-implantacional não invasivo para aneuploidias) é um método não invasivo de screening cromossômico baseado no
sequenciamento do DNA genômico secretado no meio de cultura durante o desenvolvimento embrionário.
Placa de cultivo embrionário individual.
Recentemente, o NICS-PGT-A com a análise do cfDNA (DNA livre circulante) embrionário liberado para o meio de cultura foi proposto como uma
alternativa para superar a biópsia embrionária para teste de aneuploidia.
Para essa análise, é retirado o meio de cultura no qual o embrião se desenvolveu até o estágio de blastocisto e enviado para análise genética.
No entanto, o NICS ainda apresenta certas limitações, entenda:
Resultados falso negativos
Estudos mostram resultados falso negativos, ou seja, quando a análise do DNA obtido a partir dos meios de cultivo identificou alterações
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cromossômicas em embriões cromossomicamente normais.
Possível contaminação
Nesse caso, o erro foi atribuído pelos pesquisadores a uma possível contaminação por células foliculares maternas que rodeiam o óvulo,
denominadas células da granulosa.
Ainda é cedo para adotar o diagnóstico genético pré-implantacional não invasivo (NICS), pois outros estudos precisam ser realizados para garantir a
efetividade da técnica que, quando estiver pronta para ser colocada em prática, representará um ponto de cisão entre o antes e o depois na
medicina reprodutiva de precisão.
Interpretação de resultados
Antes de conhecermos as técnicas propriamente ditas, precisamos entender algumas definições e conceitos para compreender melhor o que
estamos investigando e o que será encontrado no laudo do exame. Algumas dessas definições você já conhece, são elas:

Embrião euploide
É um embrião geneticamente normal, com 46 cromossomos completos, incluindo 22 pares de autossomos e um par de
cromossomos sexuais.
Embrião aneuploide
É um embrião geneticamente alterado. Ocorre quando há perdas ou ganhos de segmentos cromossômicos. Dessa forma, a falta de
um cromossomo resultando em somente uma cópia de um cromossomo específico se caracteriza como monossomia; a presença de
um cromossomo a mais, resultando em três cópias de determinado cromossomo, é caracterizada como trissomia.27/09/2022 22:29 Técnicas complementares na reprodução assistida
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Além desses conceitos precisamos conhecer outros, são eles:
Quando o embrião apresenta genes da doença monogênica familiar estudada.
Embrião que, após análise genética para doença monogênica, não apresenta a doença familiar estudada.
O embrião não tem a informação cromossômica necessária para a análise, o que pode ser justificado por qualidade embrionária inadequada
e/ou degradação do DNA obtido. Ainda durante a biópsia celular, tais células podem ser perdidas, o que pode contribuir para esse resultado.
Quando o laudo aponta DNA não detectado ou inconclusivo, caso seja tomada a decisão de repetir a análise com uma rebiópsia, é preciso
descongelar o embrião para refazer o procedimento de retirada das células e posterior recongelamento, para a espera do resultado da nova
análise.
Indica que uma parte de um cromossomo está ausente ou adquirida. Deleções e duplicações diagnosticadas em um feto ou em nascidos
vivos são geralmente associadas com anomalias físicas ou cognitivas. O relatório vai mostrar um “- / + p ou q” com a região do cromossomo
que é deletada ou duplicada, respectivamente.
Mosaico
O mosaicismo ocorre quando um embrião apresenta células euploides e aneuploides como resultado de erros na divisão celular
(mitose) produzidos durante o desenvolvimento embrionário.
Embrião afetado 
Embrião não afetado 
DNA não detectado ou inconclusivo 
Deleção/Duplicação Parcial 
Anormal Complexo 
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Uma amostra embrionária será classificada como anormal complexa se houver uma combinação de cinco ou mais achados anormais,
incluindo monossomia, trissomia e duplicação/deleção.
Técnicas de biópsia embrionária
Para realizar as técnicas de PGT, é recomendado que a paciente realize técnica de injeção intracitoplasmática de espermatozoide (ICSI) e não a
fertilização in vitro convencional a fim de evitar a contaminação de células remanescentes do cumulus ou células espermáticas residuais anexadas
à zona pelúcida.
Durante a formação do blastocisto, as células embrionárias se diferenciam nas linhagens de massa celular interna (MCI) e trofectoderma. Isso
ocorre pela formação de uma cavidade (blastocele) preenchida com fluido, devido à bomba de sódio e potássio.
Esquema representado o estágio de blastocisto.
Para biópsia das células embrionárias, é necessário primeiramente fazer uma abertura da zona pelúcida (ZP). Para isso, podemos realizar três
diferentes procedimentos, são eles: manipulação mecânica, perfuração química com ácido Tyrode ou perfuração a laser. A perfuração a laser é mais
fácil, rápida, precisa e trata-se da metodologia mais utilizada mundialmente.
Existem diferentes tipos de técnicas para a retirada do material embrionário a ser analisado, vamos conhecê-las?
Biópsia de blastômeros (embrião em estágio de clivagem)
São removidos 1 ou 2 blastômeros (células) do embrião. Inicialmente, as biópsias embrionárias eram frequentemente realizadas no estágio de
clivagem (embrião com 6 a 8 células). Essa técnica apresenta certa limitação, pois a quantidade de material genético analisado é pequena (menos
representativa da totalidade do embrião) e é um estágio que, por ser inicial, pode apresentar maiores taxas de mosaicismo – é sabido que o embrião
pode “corrigir" o mosaicismo ao longo do seu desenvolvimento, pela multiplicação de maior quantidade de células saudáveis que afetadas –
podendo ocorrer em até 60% das análises.
Biópsia de blastômero (retirada de célula no estágio de clivagem).
Já no estágio de blastocisto, a incidência de mosaicismo cai drasticamente, pelo número de células analisadas ser maior e, portanto, uma amostra
mais representativa do todo. Logo, a realização da biópsia na fase de clivagem pode indicar um alto índice de falso positivo para aneuploidia.
A vantagem da biópsia nesse estágio de desenvolvimento (estágio de clivagem) é oferecer tempo suficiente para o resultado da análise ser liberado
em 24 horas, possibilitando a transferência do embrião a fresco (embriões que são transferidos no mesmo ciclo de indução).
Biópsia de trofectoderma (embrião em estágio de blastocisto)
Essa técnica é a mais utilizada atualmente. É realizada uma abertura na ZP, no terceiro, quarto ou quinto dia de desenvolvimento embrionário. As
células são aspiradas e excisadas com auxílio do laser para a quebra das ligações celulares, ou aspiradas e feita a dissecção mecânica das células
biopsiadas.
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Excisão
Remoção de parte de um órgão ou tecido com instrumento cortante – nesse procedimento o instrumento cortante que utilizamos é o laser.
Devido à quantidade de células retiradas (de 6 a 8 células), esse método proporciona uma melhor precisão diagnóstica. O estágio de blastocisto
demonstra ser menos sensível a possíveis danos durante a biópsia, pois as células que vão originar o feto (provenientes da massa celular interna)
são deixadas intactas.
A biopsia de trofectoderma apresenta uma maior acurácia e diminui a incidência de possíveis resultados errôneos para mosaicismo. No entanto, ela
requer o cancelamento da transferência embrionária no mesmo ciclo, sendo necessária a criopreservação do embrião para transferência em ciclo
posterior.
Imagem ilustrativa da biópsia de trofectoderma (retirada de célula no estágio de blastocisto).
Curiosidade
O primeiro humano nascido vivo de uma transferência embrionária em estágio de blastocisto após biópsia de trofectoderma foi relatado em 2005.
Biópsia de corpúsculo polar
O primeiro corpúsculo polar é expelido nos oócitos maduros, enquanto o segundo corpúsculo polar é extruído após a fertilização. Eles não têm um
papel aparente no desenvolvimento embrionário e não são parte integrante do embrião, mas ambos contêm material genético materno (o primeiro
contém o conjunto de cromossomos duplicados resultante da primeira divisão meiótica e o segundo contém o conjunto de cromossomos simples
resultante da segunda divisão meiótica).
Morfologia do primeiro corpúsculo polar.
Morfologia do primeiro corpúsculo polar.
A remoção de ambos os corpúsculos polares para fins de PGT é considerada menos invasiva do que as abordagens que envolvem a biópsia de
células em estágios embrionários posteriores. Essa técnica envolve a remoção de ambos os corpúsculos polares com o intuito de obter uma melhor
acurácia no diagnóstico do oócito. Essa análise pode ser usada para determinar aneuploidias relacionada a meiose materna, translocações
cromossômicas balanceadas derivadas da mãe e para detecção de doenças monogênicas do genoma materno, permitindo a transferência dos
embriões a fresco.
Os corpúsculos podem ser removidos juntos após a fertilização para detecção de aneuploidias ou separadamente para os casos de doenças
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Os corpúsculos podem ser removidos juntos após a fertilização, para detecção de aneuploidias, ou separadamente para os casos de doenças
monogênicas. Devido às informações desta técnica serem limitadas apenas ao material genético materno, ela não é amplamente utilizada,
destinando-se mais para casos específicos.
Saiba mais
Estudos mostram que a biópsia de corpúsculo polar pode aumentar a taxa de fragmentação embrionária e a parada do desenvolvimento, sugerindo
que mesmo essa manipulação aparentemente pouco invasiva pode impactar negativamente a viabilidade do embrião.
Biópsia da blastocele
A descoberta de DNA adequado para amplificação e teste genético na blastocele resultou em grande interesse sobre o potencial para uma nova erade testes genéticos pré-implantação minimamente invasivos. Para tal procedimento, uma micropipeta de ICSI perfura o trofectoderma no lado
oposto da MCI e o fluido é cuidadosamente aspirado, deixando o embrião totalmente colapsado.
Preparação do Tubing (tubo para armazenar as células para envio ao laboratório de genética).
O colapso dinâmico e a re-expansão da cavidade é um fenômeno frequentemente observado durante o cultivo de blastocisto in vitro antes da
eclosão. Embora a biópsia de blastocele seja um conceito atraente, esse tipo de procedimento não é comumente utilizado por apresentar
dificuldades em obter uma amplificação consistente do DNA, o que consequentemente restringe a análise genética. A quantidade de DNA presente
na blastocele varia consideravelmente e parece ser indetectável em alguns embriões (ou está presente em um estado que impossibilita a
amplificação) e a principal causa da falha na detecção de DNA provavelmente deriva de sua natureza degradada.
Técnicas de análise genética - plataformas de diagnóstico
Inicialmente, a técnica de FISH (Hibridação in situ por fluorescência) foi utilizada para diagnóstico genético com blastômeros. O teste foi idealizado
para detecção dos cromossomos 13, 18 e 21, mas expandiu para até 12 cromossomos. Para isso, uma ou duas células embrionárias (blastômeros)
eram incubadas com sondas fluorescentes específicas e, em seguida, as alterações cromossômicas numéricas ou estruturais apenas em 12
cromossomos eram avaliadas. Porém, com o desenvolvimento de técnicas que permitem a análise de todos os 24 cromossomos (22 autossomos,
X e Y), com amplificação do genoma completo em uma única célula, o CCS (do inglês, comprehensive chromossome screening), a técnica FISH
praticamente caiu em desuso.
Agora vamos conhecer as outras técnicas utilizadas para análise genética pré-implantacional. Você vai notar que essas técnicas são as mesmas
empregadas na biologia molecular, no diagnóstico de doenças genéticas e em alguns diagnósticos laboratoriais:
Hibridização genômica comparativa (CGH)
Essa foi a primeira técnica de CCS a ser disponibilizada em larga escala e envolve o isolamento e a marcação fluorescente de DNA obtido de
biópsia de blastômero, comparando com o DNA do cariótipo de um indivíduo normal.
O CGH convencional foi substituído pelo CGH-array (a-CGH), que envolve a hibridização do DNA a um microarranjo com cerca de 3 mil a 4 mil
fragmentos do DNA humano. A limitação dessa técnica para PGT se dá pela pequena quantidade de DNA. Isso pode contribuir para uma taxa de
erro de 2% a 5%. Essa metodologia tem sido aplicada desde 2010, e tem sensibilidade para detectar perda ou ganho em todos os cromossomos
em um único procedimento.
Polimor�smo de nucleotídeo único (SNP)
O microarranjo de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP microarrays) detecta pares de nucleotídeos únicos do DNA genômico que são
altamente variáveis dentro de uma espécie. O microarranjo geralmente avalia aproximadamente 300 mil SNPs ao longo do genoma de referência,
sendo possível identificar aneuploidias de número de cromossomos.
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Algumas limitações do SNP incluem a não detecção das anomalias estruturais abaixo de 5Mb e de rearranjos cromossômicos balanceados. De
forma geral, a técnica de SNP para PGT é considerada demorada, de alto custo e complexa.
Reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR)
A reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) foi desenvolvida como um método para identificar aneupolidias nos 24 cromossomos.
Neste método, ocorre uma etapa de pré-amplificação do DNA seguida de PCR multiplex na amostra. A vantagem do qPCR é o curto tempo para
análise (cerca de 4 horas). A taxa de erro para esta técnica é de 0,21% por embrião euploide. A técnica é realizada no trofectoderma, mas não
pode ser realizada com blastômero, além de só permitir a leitura simultânea de um reduzido número de amostras. Também não é capaz de
detectar aneuploidias segmentais. Por outro lado, a técnica de PCR é amplamente utilizada para o diagnóstico de doença monogênica (PGT-M).
Sequenciamento de nova geração (NGS)
O sequenciamento de nova geração (NGS) para PGT ultimamente é a técnica mais utilizada no mundo para o diagnóstico de aneuploidias (PGT-A).
Ela inclui amplificação completa do DNA genômico, seguida de preparação de uma base de dados comparativa padrão com marcação e
fragmentação do DNA antes do PCR.
O NGS permite a identificação de aneuploidias de cromossomos inteiros, mosaicismo, número de cópias de mitocôndrias; pode ser utilizada para
rastreamento de desordem de um único gene e para translocações. A taxa de erro da técnica varia entre 0,8% a 1,71%. A sensibilidade e a
especificidade do NGS para detecção de aneuploidias cromossômicas são de 100% e 99,98%, respectivamente.
Aneuploidias segmentais
As aneuploidias segmentais (parciais) afetam apenas uma parte do cromossomo. Do ponto de vista biológico, essas alterações são geradas
principalmente por erros na divisão celular meiótica, que ocorrem durante a gametogênese, bem como erros mitóticos que acontecem durante
desenvolvimento embrionário.
Ilustração de um cariótipo apresentando translocação balanceada.
Comparado com o a-CGH, o NGS tem a vantagem de ser realizado com menores custos e o sequenciamento de várias amostras simultaneamente.
Dentre as limitações da técnica encontram-se a impossibilidade de detecção de translocações balanceadas e a dificuldade de interpretação de
aneuploidias segmentadas secundárias.
Visão geral
As técnicas de avaliação do perfil genético dos embriões humanos obtidos via tratamentos de Reprodução Humana Assistida estão em constante e
rápida evolução, com acurácia cada vez maior, o que, associado à alta proficiência do embriologista responsável pela biópsia, vitrificação e
desvitrificação desses embriões, resulta em taxas crescentes de gestação associadas a menores taxas de abortamento.
No entanto, devemos sempre levar em consideração que mesmo a melhora nas técnicas ainda não é suficiente para “compensar” a deficiência na
amostra fornecida para análise. Nesse contexto, vamos analisar três fatores sobre a biópsia de trofectoderma (embrião em estágio de blastocisto),
são eles:
Vitri�cação
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Congelamento ultrarrápido no qual o material fica em estado vítreo.
Desvitri�cação
Descongelamento do material biológico que está em estado vítreo, restabelecendo o desenvolvimento celular.
Por esse conjunto de fatores, é fundamental e obrigatório um correto aconselhamento genético realizado por um geneticista, bem como um perfeito
esclarecimento dos prós e contras da técnica, esclarecendo para o paciente as limitações que a envolvem. Considerando todos os pontos listados
acima, a genética da reprodução, quando corretamente indicada e realizada, permite resultados fantásticos, evitando doenças e aumentando o
sucesso dos tratamentos.
Atenção!
O diagnóstico genético para seleção de sexo é proibido no Brasil, mas pode ser indicado para casais que apresentem alguma doença ligada aos
cromossomos sexuais X ou Y, como, por exemplo, o X-frágil (doença que gera uma deficiência mental e, embora aconteça em ambos os sexos, é
mais grave nos homens).
Passo a passo do tratamento de fertilização in vitro com biópsia embrionária.
i é i
Biópsia de blastocisto X Biópsia de única célula
Por mais que a biópsia de blastocisto forneça múltiplas células em comparação à biópsia de uma única célula (que ocorria no estágio
de clivagem), essa amostra não é “homogênea” e, portanto, o conceito base das análises clínicas de que “a parte representa o todo”
não é perfeitamente aplicável aqui.
Células removidas para biópsia
Na biópsia de blastocisto, as células removidas pertencem a uma pequenaparte do trofectoderma que, por sua vez, é um
agrupamento celular já diferenciado dentro do embrião e pode não obrigatoriamente representar o embrião como um todo e as
células da massa celular interna, responsável pela formação do embrião propriamente dito. Prova disso são os conhecidos casos de
mosaicismo.
Capacidade de autocorreção
Soma-se a isso o pouco conhecimento que ainda temos sobre a real capacidade de autocorreção que esses embriões possam ter
para corrigir essas aneuploidias observadas nesse estágio de desenvolvimento, e ainda o impacto negativo que a biópsia pode causar
em blastocistos de prognóstico ruim.

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Epigenética
Neste vídeo, a especialista Vanessa Amil define o que é epigenética e correlaciona epigenética e reprodução humana assistida.
Falta pouco para atingir seus objetivos.
Vamos praticar alguns conceitos?
Questão 1
O diagnóstico genético pré-implantacional (PGT) é uma técnica complementar na Reprodução Assistida. Ele permite o estudo de alterações
genéticas e cromossômicas no embrião antes de sua implantação no útero. Inicialmente, esse teste foi desenvolvido para detectar que tipo de
alteração genética?
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Parabéns! A alternativa A está correta.
%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%2
paragraph'%3EIncialmente%2C%20a%20t%C3%A9cnica%20de%20PGT%20foi%20implementada%20para%20avaliar%20as%20muta%C3%A7%C3%B5e
A Para detecção de mutações gênicas.
B Para detecção de desordens numéricas.
C Para detecção de mutações poligênicas.
D Para detecção de rearranjos estruturais desbalanceados.
E Para seleção de um embrião com HLA compatível ao de uma criança afetada.
Questão 2
Para a realização da análise genética pré-implantacional existem diferentes tipos de materiais que podem ser analisados. Qual o material que
apresenta maior acurácia dos resultados e diminui a incidência de possíveis resultados errôneos para mosaicismo?
Parabéns! A alternativa B está correta.
%0A%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%3Cp%20class%3D'c-
paragraph'%3EA%20bi%C3%B3psia%20de%20trofectoderma%20(embri%C3%A3o%20em%20est%C3%A1gio%20de%20blastocisto)%20atualmente%20
A Blastômero.
B Trofectoderma.
C Corpúsculo polar.
D Blastocele.
E Células da granulosa.
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2 - Criopreservação
Ao �nal deste módulo, você será capaz de descrever as técnicas de preservação da fertilidade.
Criopreservação de oócitos e embriões
A partir do primeiro relato de nascimento após fertilização in vitro (FIV) em 1978 e do rápido progresso nas técnicas de reprodução assistida, surgiu
a necessidade de um programa de criopreservação eficaz. Inicialmente, devido às baixas taxas de sucesso, todos os embriões provenientes de
ciclos de FIV eram transferidos. Entretanto, o enorme avanço nas técnicas laboratoriais levou não apenas ao aumento das taxas de gestação, mas
também ao aumento de gestação múltipla. Uma maneira de diminuir o número de embriões a serem transferidos e a incidência de gestações
múltiplas seria armazenar os embriões excedentes para um potencial uso futuro, por meio da criopreservação.
Falando em criopreservação, você sabe o que é isso?
A criopreservação envolve o armazenamento de células e tecidos por longos períodos em temperatura muito baixa (-196°C).
Criopreservação.
Antigamente, transferências de embriões criopreservados apresentavam menor taxa de gestação quando comparadas à transferência de embriões
a fresco. Porém, com a introdução da técnica de vitrificação em 1999, houve completa revolução no campo da criopreservação, resultando em
melhores taxas de sobrevivência à criopreservação e resultados clínicos.
Além disso, a criopreservação de embriões tornou-se essencial para a melhoria da segurança e eficácia dos tratamentos de reprodução assistida, e
atualmente é um processo bem estabelecido.
Saiba mais
Em 1984 foi relatado o primeiro nascimento de uma criança proveniente de embrião descongelado.
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Apenas mais recentemente, com a introdução da criopreservação de oócitos, a técnica tornou-se disponível como uma opção adicional de
preservação de fertilidade em mulheres, visto que não necessita do material genético masculino, reservando à mulher a capacidade de procriar com
um parceiro escolhido no futuro.
Curiosidade
A primeira publicação relatando o nascimento de uma criança oriunda de oócitos criopreservados ocorreu em 1986, pelo protocolo de
congelamento lento.
Duas técnicas básicas são aplicadas à criopreservação: o congelamento lento controlado, muito utilizado nos primórdios da reprodução assistida, e
o resfriamento ultrarrápido por vitrificação, que atualmente é a técnica mais utilizada e muito bem estabelecida.
Vamos conhecer um pouco mais sobre essas técnicas. Mas antes vamos entender como ocorre a criopreservação.
Princípios �siológicos da criopreservação
Os princípios fisiológicos da criopreservação e suas restrições são de grande importância para compreender o sucesso (ou insucesso) da técnica. A
principal causa de morte celular no processo da criopreservação é a criolesão (lesão pelo frio).
Mas o que é criolesão?
Sua ocorrência é explicada por diversas teorias, como formação de cristais de gelo intracelular, volume celular
mínimo e transição de fases da membrana, danos à membrana celular e alterações no funcionamento do
metabolismo, tanto celular quanto mitocondrial.
O que é feito para evitar a criolesão? Vamos entender?
Crioprotetores não permeáveis à membrana plasmática
Atuam por meio de um efeito osmótico, induzindo a desidratação celular durante o resfriamento e regulando sua hidratação no aquecimento,
prevenindo a formação dos cristais de gelo
Princípio da criopreservação
Consiste em solidificar a solução por meio de um aumento extremo de sua viscosidade em temperatura extremamente baixa (-196°C,
temperatura do nitrogênio líquido). Com intuito de preservação celular durante essa exposição a temperaturas não fisiológicas, é
necessário a adição dos chamados crioprotetores.
Crioprotetores
O objetivo da adição de crioprotetor é causar efluxo da água celular que, ao ser resfriada, pode formar os cristais de gelo, lesionando a
célula. Crioprotetores são substâncias que atuarão no espaço intracelular ou extracelular dependendo do seu tipo: permeáveis à
membrana plasmática (etilenoglicol, glicerol, dimetilsulfóxido, propanediol, acetamida) ou não permeáveis à membrana plasmática
(sacarose, trealose).
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prevenindo a formação dos cristais de gelo.
Crioprotetores permeáveis à membrana
Atuam de forma dupla: atingem o meio intracelular, por difusão passiva, com a função de substituir a água intracelular e reduzir o seu ponto de
congelamento. Além disso, por permanecerem em altas concentrações no meio extracelular, auxiliam a desidratação celular, evitando a formação
dos cristais de gelo.
Os meios utilizados para a criopreservação contêm os dois tipos de crioprotetores, uma vez que essa combinação
permite preservar o equilíbrio osmótico entre os meios intra e extracelular.
Técnica de criopreservação de embrião e oócitos
Para o sucesso da técnica, as condições devem ser otimizadas para minimizar a incidência de lesões e manter alta a taxa de sobrevivência. Existem
duas técnicas que podem ser aplicadas à criopreservação:
CongelamentoLento
Como o próprio nome diz, o congelamento lento é uma técnica mais demorada, e tem a necessidade de utilizar equipamentos especiais e caros.
Essa técnica consiste na adição de crioprotetores ao material e seu posterior resfriamento em rampas de temperaturas lentas, ou seja, na
diminuição gradual e constante da temperatura.
Em 1971 foi registrada sua primeira utilização com sucesso, quando o congelamento ainda ocorreu de forma rudimentar e com rampas de
temperatura pouco controladas. Com esse registro e aumento do alcance do procedimento, vários equipamentos para controlar a rampa (variação)
de temperatura de resfriamento surgiram no mercado.
Cryobath fechado (foto superior) e aberto (foto inferior).
Em um protocolo de congelamento lento clássico, estabelecido e utilizado desde meados dos anos 1980, as células são expostas a baixas
concentrações de crioprotetores, e a temperatura é gradativamente diminuída de 0,3°C a 0,5°C por minuto, até alcançar a temperatura entre -30°C e
-65°C, e então é adicionado o nitrogênio líquido (-196°C), no qual ocorrerá o armazenamento. Durante esse processo, um delicado equilíbrio é
mantido pela indução de cristais de gelo extracelulares. Ainda que algumas alterações nos protocolos de congelamento lento tenham contribuído
para maiores taxas de sucesso, a eficiência clínica desta técnica ainda é questionável.
Acima, verificamos uma foto de um modelo de equipamento utilizado para o congelamento lento (embriões e oócitos). Na imagem, vemos que o
equipamento está conectado a um aparelho que controla a rampa de resfriamento.
Vitri�cação
Tem como foco evitar a formação de cristais de gelo, tanto nas soluções extra quanto nas intracelulares. Os embriões e os oócitos são expostos a
taxas extremamente rápidas de resfriamento, antes da submersão em nitrogênio líquido e em soluções com altas concentrações de crioprotetores
em volumes muito baixos (<1µL), criando o que é conhecido como estado vítreo.
Atualmente, a técnica de escolha para o congelamento de oócitos e embriões é a vitrificação, devido à menor
chance de ocorrer dano celular, sendo importante ressaltar que o uso dos crioprotetores representou um grande
avanço na criogenia. A vitrificação tem somado qualidade ao tratamento de reprodução assistida, com melhores
taxas de sobrevivência e desenvolvimento embrionário pós descongelamento, o que permite a programação da
transferência embrionária para um momento mais adequado, social e fisiologicamente.
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transferência embrionária para um momento mais adequado, social e fisiologicamente.
Existem diferentes tipos de meios de cultura comercializados, no entanto, todos são muito similiares, visto que contêm duas soluções base
utilizadas em duas etapas distintas: equilibration solution (ES) e vitrification solution (VS).
O oócito ou embrião é colocado no meio ES, no qual, inicialmente, tem a saída de água, sendo, depois, reidratado com a entrada dos meios
crioprotetores.
Após essa fase, o oócito ou embrião é submerso no meio VS com posterior inserção na palheta de vitrificação, onde sofrerá mais desidratação para
posterior imersão no nitrogênio líquido.
Placa, soluções e palhetas utilizados durante a técnica de vitrificação.
Existem dois sistemas de vitrificação: aberto e fechado.
No sistema aberto, a amostra entra em contato direto com o nitrogênio líquido no momento da imersão. No sistema fechado, a amostra é contida
em um invólucro selado (uma capa de plástico semelhante a um canudo, com as extremidades fechadas) que impede o contato direto com o
nitrogênio líquido.
Palheta com sistema aberto.
Sistema fechado. O “canudo” amarelo (invólucro) com amostra.
Estudos mostram que o sistema aberto consegue fazer a rampa de resfriamento mais rapidamente que o sistema fechado, no qual há primeiro o
resfriamento do invólucro para posterior resfriamento da amostra. Isso torna o sistema aberto mais seguro no que se refere à formação dos cristais
de gelo.
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Palheta aberta submersa no nitrogênio líquido.
Saiba mais
Para o congelamento de oócitos e embriões a concentração do agente crioprotetor utilizada deve seguir a indicada pelo fornecedor.
Além disso, estudos mostram que a vitrificação tem melhor taxa de sobrevida, fazendo com que, atualmente, poucas clínicas no mundo utilizem o
congelamento lento. No Brasil, somente uma clínica ainda utiliza essa metodologia.
Descongelamento de oócitos e embriões
O descongelamento ou aquecimento é o processo inverso da criopreservação. Nesse caso, retiramos os crioprotetores em três etapas: thawing
solution (TS) - solução de descongelamento -, diluent solution (DS) - diluente - e washing solution (WS) - solução de lavagem - para a reidratação do
embrião.
Placa de descongelamento. Palheta submersa na primeira etapa do descongelamento (TS).
Após a finalização desse processo, o embrião e o oócito ainda necessitam de tempo para a completa reidratação até retomar o tamanho normal.
Blastocisto após descongelamento.
Blastocisto 3 horas após descongelamento.
Criopreservação de embrião e oócitos
Neste vídeo, a especialista Vanessa Amil mostra as técnicas de congelamento e descongelamento de oócitos e embriões e pontua as suas
principais diferenças.

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Indicações da criopreservação de embriões
Em algumas situações clínicas, a paciente poderá ter indicação de congelamento total dos embriões produzidos naquele ciclo de FIV, seja devido a
alguma doença, alteração ou risco clínico, seja por não desejar a transferência a fresco naquele momento.
As indicações que justificam o congelamento embrionário são: baixa reserva ovariana, teste genético pré-implantacional, cavidade uterina
inadequada, progesterona elevada, risco de síndrome do hiperestímulo ovariano e embriões excedentes.
Agora, vamos conhecer melhor cada uma dessas indicações.
Baixa reserva ovariana
Esse diagnóstico advém dos testes de reserva ovariana basal realizados (dosagem de FSH, LH, estradiol, progesterona e AMH –
hormônio antimülleriano). A opção para esse casal é a realização da FIV (fertilização in vitro) e o congelamento dos embriões para
que possa ter um número maior de embriões (acúmulo de embriões), permitindo que, no futuro, tenham embriões que possibilitem o
aumento da prole.
Teste genético pré-implantacional
Após o cultivo dos embriões, os blastocistos biopsiados podem ser transferidos no mesmo dia, caso o estudo genético seja feito
imediatamente (esse procedimento só é possível se a clínica estiver localizada na mesma cidade do laboratório de análise genética).
Na maioria dos centros, pela indisponibilidade desse imediatismo, é necessário o congelamento destes embriões para que haja
tempo do resultado ser disponibilizado. Nesses casos, o blastocisto euploide será transferido em outro ciclo.
Cavidade uterina inadequada
O congelamento embrionário pode ser indicado em alguns casos, devido a doenças que diminuem as chances de implantação.
Doenças como adenomiose, miomatose e endometriose podem tornar inadequada a cavidade uterina e assim reduzir o sucesso do
tratamento.
Progesterona elevada
Durante a FIV, o estímulo hormonal responsável pelo recrutamento folicular pode alterar o endométrio, fator importante para o
processo do tratamento. Caso ocorra aumento da progesterona plasmática acima de 1.500pg/mL no dia do gatilho com o HCG
(gonadotrofina coriônica humana), o ideal é o congelamento embrionário total, visto que essa situação está associada à baixa taxa de
gravidez.
Risco de síndrome do hiperestímulo ovariano
A Síndrome da Hiperestimulação Ovariana (SHO) é uma complicaçãodecorrente do estímulo ovariano com indutores de ovulação,
podendo levar a quadros graves Geralmente ocorre devido a uma resposta exacerbada dos ovários ao estímulo hormonal e resulta
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Indicações da criopreservação de oócitos
A indicação da criopreservação de oócitos são as seguintes:
Baixa reserva ovariana
Nesses casos, podem ser realizados vários ciclos com criopreservação de oócitos, e quando for alcançado o número desejado de oócitos, realiza-
se o descongelamento e prossegue-se com a FIV.
Preservação social
Consiste naqueles casos em que as pacientes desejam adiar a gravidez devido a diversas razões pessoais.
Pacientes oncológicas
Visto que uma das grandes complicações do tratamento para o câncer é a esterilidade ou perda da função gonadal, faz-se necessária a
criopreservação dos gametas femininos para preservação da fertilidade.
Doação de oócitos
Os gametas são criopreservados nesses casos quando não há sincronização entre o ciclo da doadora e o preparo endometrial da receptora.
Criopreservação de sêmen e espermatozoides obtidos por
biópsia
O congelamento de espermatozoides humanos começou a ser introduzido na prática clínica e laboratorial a partir de 1960, e desde então é
considerado uma parte fundamental dentro das técnicas de reprodução humana assistida (TRA).
Apesar de não ser possível recuperar a motilidade de todos os espermatozoides que eram inicialmente móveis, a
técnica passou a ganhar importância especialmente em casos de pacientes ainda sem filhos que seriam
submetidos a tratamento de quimioterapia ou radioterapia, que os deixariam inférteis, subférteis ou com
prognóstico desconhecido.
Para que a amostra de sêmen fosse criopreservada de maneira segura, foram desenvolvidos industrialmente inúmeros crioprotetores para serem
adicionados aos espermatozoides.
podendo levar a quadros graves. Geralmente ocorre devido a uma resposta exacerbada dos ovários ao estímulo hormonal e resulta
em um número grande de oócitos. Assim, quando ocorrer esta síndrome, a criopreservação de embriões é indicada por ser uma tática
importante para minimizar o risco de hiperestimulação em pacientes suscetíveis, visto que a transferência a fresco desencadeia um
novo pico de HCG.
Embriões excedentes
Segundo a resolução do Conselho Federal de Medicina (CFM) n° 2.294, de 27 de maio de 2021, não é permitido o descarte de
embriões viáveis e a quantidade de embriões a serem transferidos é limitada (< 37 anos até 2 embriões,> 37 anos até 3 embriões).
Sendo assim, após a transferência dos embriões, os excedentes viáveis devem ser criopreservados.
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O mecanismo de ação deles deve garantir a proteção das estruturas intracelulares. Como já sabemos, a função dos crioprotetores é retirar água dos
gametas, evitando a formação de cristais de gelo. Quanto mais permeável a membrana plasmática do gameta, melhor será a resposta do
espermatozoide ao processo de criopreservação.
Aspectos laboratoriais da criopreservação de espermatozoides
O sucesso da criopreservação dos espermatozoides é afetado pela taxa de resfriamento durante o congelamento. No congelamento rápido, a água
presente no meio intracelular congela, causando danos às organelas pela formação de cristais de gelo. Se a taxa de congelamento for baixa, as
células serão danificadas em razão da formação lenta de gelo no meio extracelular, aumentando a concentração de solutos extracelulares e, por
causa dessa diferença de osmolaridade, a água sai das células, resultando em desidratação.
Atenção!
Para evitar uma lesão ao espermatozoide, é realizado o rígido controle das taxas de congelamento e são adicionados à amostra de sêmen os
crioprotetores e diluentes.
O crioprotetor mais utilizado é o glicerol, que foi descoberto em 1949. As concentrações de glicerol no volume final mais adequadas para a proteção
durante o congelamento são de 6% e 7%. Quando combinados aos diluentes, a sobrevivência espermática é maior do que com uso exclusivo do
glicerol. Atualmente, os diluentes que contêm gema de ovo, tampões, citrato e sacarose são os mais indicados.
Técnica para criopreservação de espermatozoides obtidos por biópsia e
sêmen
A adição e a remoção do crioprotetor em concentração proporcional provoca estresse momentâneo na membrana plasmática dos
espermatozoides.
Vamos entender melhor:
Adição do crioprotetor
Quando a adição do crioprotetor é feita na mesma concentração de uma só vez, o estresse na membrana plasmática dos espermatozoides é muito
alto.
Redução do dano
Esse dano pode ser diminuído e a sobrevivência dos espermatozoides aumentada se a adição do crioprotetor for de forma lenta (em gotas), em
velocidade de cerca de 1mL por minuto.
Após a adição total do crioprotetor, o material é armazenado em recipiente criogênico (criotubo) e submetido ao vapor de nitrogênio e em seguida
submerso em nitrogênio líquido (-196°C).
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Recipientes criogênicos (Criotubos) que armazenam o sêmen na criopreservação.
Saiba mais
Antes do congelamento, avaliamos os parâmetros seminais (concentração, motilidade e vitalidade). A baixa qualidade seminal pode ser devido a
varicocele, fator hormonal, genético, traumas etc. Quando o paciente apresenta uma amostra com alteração significativa, mas é possível selecionar
espermatozoide para realizar a FIV, conversamos com ele e explicamos qual seria a recuperação da amostra e orientamos quantas amostras ele
precisará criopreservar para um tratamento.
Os parâmetros seminais devem ser avaliados antes do congelamento. Essa análise é realizada no laboratório de andrologia.
Para o descongelamento, a maneira mais comum é retirar o material congelado do nitrogênio líquido e deixá-lo à temperatura ambiente até sua total
liquefação. Após o descongelamento, é feito o processo de capacitação espermática, que consiste em separar os melhores espermatozoides do
líquido seminal, pelas técnicas laboratoriais que eliminam da amostra os espermatozoides imóveis, os detritos celulares, os leucócitos e as células
imaturas.
Recomendação
Os espermatozoides obtidos a partir de biópsia de testículo devem ser criopreservados da mesma maneira que aqueles provenientes do sêmen.
Apesar dos inúmeros avanços na área da criopreservação, ainda há muitos vieses da técnica a serem aprimorados. Durante essa avaliação, é
fundamental avaliar alguns indicadores após o descongelamento da amostra, como a qualidade seminal. Vamos entender o porquê?
Qualidade seminal
A diminuição da qualidade do sêmen, principalmente da sua motilidade, e o aumento da fragmentação de DNA são fatores esperados
após o descongelamento da amostra e, por essa razão, são também exemplos de indicadores de que a técnica precisa ser refinada.
Além disso, as taxas de recuperação em geral dependem da qualidade da amostra antes da criopreservação. Amostras de sêmen de
baixa qualidade são mais propensas a sofrer danos ao DNA e apoptose do que aquelas de boa qualidade.
Motilidade dos espermatozoides
A motilidade dos espermatozoides é o aspecto mais afetado pelo processo de criopreservação, pois lesiona algumas estruturas
celulares dos gametas. As mitocôndrias são as estruturas celulares que envolvem a peça intermediária dos espermatozoides, agindo
como fornecedoras de energia para a cauda e promovendo o movimento flagelar característico dos espermatozoides. Aparentemente
o que provoca a diminuição da atividade mitocondrial nos espermatozoides após seu descongelamento é o aumento dos níveis de
apoptose celular.
Diminuição da atividade mitocondrial
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Indicações da criopreservação do sêmen e dos espermatozoides obtidos por
biópsia
A criopreservação de sêmen deve ser considerada como procedimento preventivo diante das seguintes situações: antes de quimioterapia e
radioterapia; antes de cirurgia de testículo ou próstata; em caso de dificuldade de coleta ou ausência do companheiro no dia do tratamento de
reprodução assistida; em indivíduos que vão realizar cirurgia de vasectomia e desejam preservar a fertilidade futura; em indivíduos que trabalham
em profissões de alto risco para fertilidade (indústrias químicas, exposição aos agrotóxicos e pesticidas e exposição a radiações ionizantes); em
amostras obtidas por técnicas cirúrgicas, do epidídimo e/ou testículo.
Dentre as técnicas de recuperação cirúrgicas estão:
PESA (do inglês, Aspiração Percutânea de Espermatozoides do Epidídimo);
MESA (do inglês, Aspiração Microcirúrgica de Espermatozoides do Epidídimo);
TESA (do inglês, Aspiração de Espermatozoides do Testículo);
TESE (do inglês, Extração de Espermatozoides do Testículo);
Micro-TESE (do inglês, Extração de Espermatozoides do Testículo por Microdissecção).
Congelamento de tecido ovariano e ovário
A criopreservação de tecido ovariano é atualmente o método de escolha para preservar a fertilidade de pacientes jovens com diagnóstico de câncer.
O primeiro país a relatar o nascimento de uma criança após a criopreservação de tecido ovariano com autotransplante ortotópico (implante do
fragmento de tecido ovariano retirado do próprio ovário da paciente) foi a Bélgica, em 2004.
A técnica aplicada foi baseada em experimentos que demonstraram, pela primeira vez, a possibilidade de êxito em
transplantes ortotópicos (transplantar o órgão na posição anatômica original). Nos anos seguintes, com o
aprimoramento das técnicas, outros nascimentos esporádicos provenientes tanto de gestação espontânea quanto
de fertilização in vitro, foram reportados.
Exemplo
Em 2009, um grupo espanhol reportou o nascimento de gêmeos após tratamento quimioterápico e criopreservação de tecido ovariano, seguido de
transplante, estimulação ovariana induzida e vitrificação dos oócitos.
As mitocôndrias são as estruturas celulares que envolvem a peça intermediária dos espermatozoides, agindo como fornecedoras de
energia para a cauda e promovendo o movimento flagelar característico dos espermatozoides. Aparentemente o que provoca a
diminuição da atividade mitocondrial nos espermatozoides após seu descongelamento é o aumento dos níveis de apoptose celular.
Taxas de recuperação
As taxas de recuperação em geral dependem da qualidade da amostra seminal antes da criopreservação. Amostras de sêmen de
baixa qualidade são mais propensas a sofrer danos ao DNA e apoptose do que aquelas de boa qualidade.
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As dificuldades de se criopreservar o ovário e o tecido ovariano humano se devem à hipóxia dos tecidos, à não revascularização, à permeabilidade
ineficaz do crioprotetor e à complexidade da foliculogênese, além do risco de se transplantar células malignas, principalmente na vigência de
neoplasias.
Técnica de criopreservação de tecido ovariano e ovário
A partir de um procedimento cirúrgico, realizado por videolaparoscopia (com visualização utilizando câmeras de vídeo especializadas), é retirada
uma parte ou todo o ovário, de acordo com a indicação. O tecido ovariano é cortado em fatias finas da região cortical, onde estão presentes os
folículos primordiais, e incubado por 5 minutos em meio de cultura suplementado e tamponado, antes da criopreservação.
A desidratação acontece em duas fases:
Primeira fase
Na primeira, o tecido é imerso no meio de cultivo, ao qual são adicionados dimetilsulfóxido (DMSO) e sacarose em concentrações de 2,0mol/L e
0,1mol/L, respectivamente, por 5 minutos.
Segunda fase
Na segunda fase, o tecido é adicionado ao meio suplementado com DMSO (dimetilsulfóxido), PROH (1,2-propanodiol) e sacarose, em concentrações
de 2,0mol/L, 2,0mol/L e 0,2mol/L, respectivamente, também por 5 minutos.
Imediatamente após a segunda fase, as tiras desidratadas devem ser aspiradas com pipeta Pasteur e vagarosamente liberadas diretamente no
nitrogênio líquido. Após estarem congelados, os fragmentos de tecido ovariano podem permanecer armazenados por tempo indeterminado.
Por exemplo, após o tratamento de quimioterapia ou radioterapia, há uma chance considerável de a mulher entrar na menopausa precocemente.
Caso isso aconteça, os fragmentos do ovário criopreservados poderão ser descongelados e reimplantados no organismo da paciente de forma a
proporcionar a chance de uma gravidez futura. A seguir vemos um esquema mostrando o passo a passo da técnica do congelamento de tecido e
ovário.
Passo a passo da técnica do congelamento de tecido e ovário.
Descongelamento do tecido ovariano e ovário
O processo de descongelamento consiste em expor o recipiente ou a palheta em que o tecido está armazenado, a uma temperatura de 37°C por um
minuto, e submergir o material em um gradiente decrescente de sacarose, cuja função é regular a troca de crioprotetor por meio de cultura
essencial.
Atenção!
Após o descongelamento do tecido ovariano, ele deve ser reimplantado no sítio ortotópico ou heterotópico (transplantar o órgão em outra posição
anatômica diferente da orignal), dependendo da técnica e do objetivo do reimplante.
I di ã i ã d t id i á i
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Indicação para a criopreservação de tecido ovariano e ovário
Pacientes que, após o diagnóstico do câncer, não têm tempo suficiente para congelamento de oócitos/embriões ou contraindicação para receberem
estimulação ovariana com hormônios são candidatas à técnica. Além disso, essa é a única opção para preservação de fertilidade em meninas antes
da puberdade.
Falta pouco para atingir seus objetivos.
Vamos praticar alguns conceitos?
Questão 1
Vimos alguns métodos de criopreservação de embriões e oócitos. Sobre esses métodos, analise as afirmativas a seguir.
I. A vitrificação consiste na adição de crioprotetores ao material e seu posterior resfriamento em rampas de temperaturas lentas.
II. A eficiência da técnica de criopreservação pelo método lento ainda é questionável.
III. No congelamento lento, os embriões e os oócitos são expostos a taxas extremamente rápidas de resfriamento, antes da submersão em
nitrogênio líquido.
IV Existem dois tipos de palhetas de vitrificação (sistema aberto e sistema fechado)
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IV. Existem dois tipos de palhetas de vitrificação (sistema aberto e sistema fechado).
É correto o que se afirma em:
Parabéns! A alternativa E está correta.
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paragraph'%3EO%20congelamento%20lento%20%C3%A9%20uma%20t%C3%A9cnica%20que%20tem%20efici%C3%AAncia%20question%C3%A1vel%2
A I e II.
B I e III.
C I e IV.
D II e III.
E II e IV.
Questão 2
Aprendemos que a criopreservação de sêmen e espermatozoides obtidos por biópsia é realizada por uma técnica diferente da empregada para
a criopreservação de oócitos e dos embriões. Sobre a criopreservação dos espermatozoides obtidos pelo sêmen ou por biópsia, analise as
afirmativas a seguir e assinale a alternativa correta:
A O congelamento dos espermatozoides e do sêmen não é afetado pela taxa de resfriamento.
B O crioprotetor mais empregado durante o congelamento do sêmen é o dimetilsulfóxido.
C A criopreservação de espermatozoides provenientes da biópsia testicular é igual à criopreservação do sêmen.
D
Na criopreservação dos espermatozoides, não são empregadosos diluentes, pois eles diminuem a sobrevivência
espermática.
E
Após a criopreservação, o descongelamento deve ser realizado em uma rampa de temperatura, com declínio lento da
temperatura.
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Considerações �nais
Ao longo deste conteúdo, estudamos algumas técnicas complementares realizadas durante a reprodução assistida auxiliando na identificação de
causas de infertilidade e aumentando o sucesso dos tratamentos.
Vimos que o PGT é um teste realizado a partir da análise de células embrionárias, retiradas do embrião por biópsia e posteriormente analisadas em
laboratório especializado, de acordo com a doença a ser identificada. Esse procedimento é indicado para casais que tenham alto risco de
transmissão de doenças genéticas para seus filhos. Este teste é dividido em, PGT-A, PGT-M PGT-HLA, PGT-SR, PGT-P e NICS e pode ser realizado em
embriões no estágio de clivagem ou de blastocisto. Entretanto, estudos mostram que, quando realizada no estágio de blastocisto, a técnica
demonstra ser menos prejudicial ao embrião, pois as células que vão originar o feto (provenientes da massa celular interna) são deixadas intactas.
Aprendemos também que a criopreservação de gametas e embriões é uma técnica complementar que visa preservar a fertilidade tanto masculina
quanto feminina. Essa técnica consiste na conservação de gametas ou embriões em baixas temperaturas para que sejam utilizados em tratamentos
futuros de reprodução assistida (transferência embrionária ou fertilização in vitro).
Podcast
Neste podcast, a especialista Vanessa Nayane Pino Perez falará sobre como entrou para a reprodução assistida, a rotina, os procedimentos e os
cuidados que devem ser tomados em diferentes procedimentos e muito mais. Vamos lá?
Referências
ALMODIN, C. G.; COSTA, R. R. Criopreservação em Reprodução. Dental Press, 2014.
AZAMBUJA, R. et al. Reprodução assistida: Técnicas de Laboratório. Porto Alegre: Age, 2017.
BORGES, E.; CORTEZZI, S. S.; FARAH, S. Reprodução humana assistida. Rio de Janeiro: Atheneu, 2011.
BORGES JUNIOR, E.; BRAGA, D. P. A. F.; SETTI, A. S. Reprodução humana assistida: Associação estudo Sapientiae. 2. ed. Rio de Janeiro: Atheneu,
2020.
DZIK, A. et al. Tratado de reprodução assistida. Segmento Farma, 2011.
MARINHO, R. M. Preservação da fertilidade: uma nova fronteira em medicina reprodutiva e oncologia. 1. ed. Rio de Janeiro: MedBook, 2015.
TREFF, N. R. et al. Preimplantation genetic testing for polygenic disease relative risk reduction: evaluation of genomic index performance in 11,883
adult sibling pairs. Genes. 2020; 11, 648.
Parabéns! A alternativa C está correta.
%0A%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%3Cp%20class%3D'c-
paragraph'%3EOs%20espermatozoides%20devem%20ser%20criopreservados%20pela%20mesma%20t%C3%A9cnica%2C%20independentemente%20
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Leia o livro Reprodução Assistida, disponível na página da internet da REDLARA.