Controle de Qualidade Microbiológico

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MICRÓBIOS
O que é crescimento microbiano?
· Crescimento microbiano é normalmente associado ao crescimento de uma população de células de um dado microrganismo, ou seja, refere-se ao aumento do número e não 
do tamanho das células.
Bactérias
Características gerais
· Reino Monera
· Procarionte
· Unicelular
· Autotróficas ou heterotróficas
· Reprodução assexuada (bipartição)
· Vivem isoladas ou em colônias
· Vivem em diferentes ambientes
· Podem ser anaeróbias, aeróbias ou facultativas
· Podem apresentar diferentes formas: cocos, bacilos, vibrião e espiral.
Componentes Celulares
· Principal componente da parede celular das bactérias (exceto as arqueas bactérias): peptideoglicano/mureína.
· As fímbrias tem função de adesão e estão envolvidas na formação de biofilmes e em superfícies.
· Os pili são mais longos que as fímbrias e há apenas 1 ou 2 por célula. Estão envolvidos na mobilidade celular e na transferência de DNA.
· Se locomovem por meio dos pili e flagelos.
Material Genético
· Nucleiode (onde se encontra o material genético);
· Plasmídeo (molécula de DNA extracromossomal);
· Resistência a antibióticos
· Produção de toxinas
· Ribossomos: Porção 70S
· Sem endomembranas/citoesqueleto
Classificação quanto às formas bacterianas
· Estafilococos – o mais comum de se encontrar
· Clostridium e bacillus spp: podem produzir endósporos.
· Existe também a forma Pleomórfica
· Algumas espécies podem apresentar mais de uma forma. Isso ocorre por alterações nas condições ambientais
· Ex.: Mycoplasma pneumoniae
Classificação quanto à característica nutricional
· Heterótrofas
· Parasitas
· Saprofágicas
· Autótrofas
· Fotossintetizantes
· Quimiossintetizantes
Reprodução das bactérias
· Assexuada
· Divisão Binária, cissiparidade ou bipartição
· Ocorre quando uma bactéria duplica seu material genético e logo em seguida se divide originando duas bactérias idênticas a ela.
· Esporulação
· Ocorre quando as baterias são submetidas a condições ambientais desfavoráveis, onde elas formam estruturas denominadas esporos. Em ambiente propício, o esporo se reidrata, reconstituindo uma nova bactéria, que passa a reproduzir por divisão binaria.
As bactérias não apresentam nenhum tipo de reprodução sexuada, e sim recombinação genética que pode ocorrer por:
· Transformação
· Uma bactéria absorve um pedaço de DNA disperso no seu ambiente que são incorporados ao seu material genético, transformando-se.
· Transdução
· Ocorre a troca de material genético entre as bactérias com a participação de um bacteriófago (vírus)
· Conjugação
· O DNA é transferido entre as bactérias através de um tubo entre as células (pili)
Coloração de Gram
A técnica consiste basicamente nas seguintes etapas:
· Preparar uma lâmina de vidro com uma fina camada de bactérias fixa (esfregaço);
· Cobrir o esfregaço com cristal violeta por 1 minuto. Enxaguar em água corrente;
· Cobrir com lugol por 1 minuto. Enxaguar em água corrente;
· Descorar com solução de álcool-acetona por 30 segundos. Enxaguar em água corrente;
· Contra-corar com safranina (ou fucsina) por 30 segundos. Enxaguar em água corrente.
· Deixar secar ao ar.
A coloração de Gram se baseia em algumas diferenças estruturais existentes entre a parede celular de uma bactéria Gram positiva e de uma Gram negativa.
Lip
	Gram Positiva
	Gram Negativa
	+ Peptideoglicano
	- Peptideoglicano
	+ Grossa
	+ Fina
	+ Rígida
	+ Mole
	Com ácidos Teicóicos
	Sem ácidos Teicóicos
Os ácidos teoicoicos são divididos em 2: ácidos teicóicos de parede, que está ligado a camada de peptideoglicana e os ácidos lipoproteico que atravessam camada de peptideoglicana e está ligada a membrana plasmática. Os ácidos teoicoicos podem assumir um papel no crescimento celular, regulam o movimento de cátions para dentro e fora da célula e fornecem boa parte da especificidade antigênica da parede e, portanto, é possível identificar bactérias gram-positivas por meio de testes laboratoriais.
A peptideoglicana está ligada a lipoproteínas na membrana externa e está no periplasma, um fluido semelhante a um gel, entre a membrana externa e a membrana plasmática. A membrana externa da gram-negativa consiste em lipopolissacarídeos (LPS), lipoproteínas e fosfolipídeos. A membrana externa fornece uma barreira para certos antibióticos, enzimas digestivas, detergentes, metais pesados e certos corantes. Parte da permeabilidade da membrana externa se dá pelas porinas.
· Gram positiva: parede mais espessa, quimicamente mais simples, apresenta 90% de peptideoglicano (macromolécula) 
· Gram negativa: quimicamente mais complexa, é formada por uma ou poucas camadas de peptideoglicano, possui uma membrana externa (membrana extra – onde está presente os lipopolissacarídeos), separadas pelo periplásmico, contendo uma série de enzimas e proteínas.
Nota: Os lipopolissacarídeos (LPS - endotoxina) participa dos mecanismos de patogenicidade da célula bacteriana e é o maior responsável por sua virulência.
Toxinas
· Exotoxinas – moléculas proteicas que são secretadas e são sensíveis ao calor
· Endotoxinas – componente estrutural das bactérias (ex.: LPS – lipopolissacarídeos).
· Lipopolissacarídeos possui 3 componentes:
· Polissacarídeo O: Funciona como um antígeno – útil na diferenciação da bactéria gram-negativa
· Cerne polissacarídeo: Fornece estabilidade
· Lipídeo A: Endotoxina – responsável por sintomas como febre, dilatação dos vasos venosos, choque, formação de coágulos sanguíneos.
Biofilmes
· Polissacarídeos secretados formando um ambiente protegido das ameaças externas
Anotações: ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Fungos
Características gerais
· São células eucarióticas;
· Uni ou pluricelulares;
· Geralmente pleomórficos – dimórficos;
· Capacidade de mudar de forma.
· Leveduriforme/filamentoso
· São organismo essencialmente aeróbios podendo ser anaeróbios facultativos e mais raramente anaeróbios;
· Reproduzem-se de forma sexuada ou assexuada (esporos);
· Nutrem-se por absorção;
· São organismos heterótrofos;
· Propagação pelo ar (mais comum).
· Condições físico químicas preferidas
· Umidade elevada (molhadinho);
· Temperatura entre 30º e 40º - mesófilos (quentinho);
· pH ácido (azedinho).
Características estrutural
· Parede celular - composta por glucanas, mananas E QUITINA;
· Membrana plasmática - possui esteróis -> ERGOSTEROL (só os fungos possuem);
Unicelular Vs Multicelular
· Leveduriforme -unicelular
· Crescimento rápido (mitose)
· Filamentoso – multicelular
· Crescimento mais lento
· Hifas vegetativas: especializadas no consumo de substratos – crescimento
· Hifas aéreas: direcionam-se para cima – podem se especializar em estruturas reprodutivas
 
 
Fungos Leveduriformes
· Reprodução: Gemulação, Gemiparidade ou Brotamento;
· Macroscopicamente formam colonias semelhante às bacterianas.
 
Gemulação, Gemiparidade ou Brotamento
· Quando acontece o surgimento de brotos na superfície do organismo adulto, esses brotos darão origem a um novo indivíduo, o qual poderá crescer sobre o organismo que o originou, formando as colônias, ou ser liberado no ambiente.
· Os brotos:
· Originam novos organismos e esses novos organismos são idênticos ao inicial.
· Podem ser liberados ou não
· Os não liberados do “organimo-mãe” formam as colônias.
· Exemplos: poríferos/cnidários
BROTO SENDO NÃO LIBERADO, ORIGINANDO A COLÔNIA
BROTO LIBERADO
COLÔNIA
BROTO SENDO LIBERADO, ORIGINANDO UM NOVO ORGANISMO (IDÊNTICO AO ORGANISMO-MÃE)
BROTO
ORGANISMO
MÃE
Fungos Filamentosos
· Também denominados mofos ou bolores
· Macroscopicamente, possuem:
· Colônias “Grandes”
· Micélios aéreos;
· Pigmentação
· Reprodução: Esporulação
(Conjunto de hifas)
Tipos de Hifas
· Hifa septada: presenteem fungos mais complexos, as paredes divisórias (septos) separam o filamento internamente em segmentos mais ou menos parecidos.
· Hifa cenocítica: presentes em fungos simples, o fio é contínuo e o citoplasma contém numerosos núcleos nele inserido.
HIFA SEPTADA
HIFA CENOCÍTICA
Reprodução por Esporulação
Na esporulação, a produção de alguns tipos de esporos acontece por meio da ponta de uma hifa que destaca-se do substrato e, repentinamente, produz centenas de conidiósporos, que permanem unidos até serem liberados. Os pequenos e leves esporos esféricos (conidiósporos) brotam de conídios que surgem na extremidade de uma hifa especializada, o conidióforo. 
Ainda na esporulação, alguns fungos possuem estruturas chamadas de esporangióforos, que nada mais são do que hifas especiais que saem de determinados pontos do micélio. Na extremidade de cada esporangióforo, encontramos o local onde são produzidos os esporos, que é chamado de esporângio.
	Diferença entre Conidióforos e Esporangióforos
	Conidióforos
	Esporangióforos
	Hifas reprodutivas especiais de ascomicetos e basidiomicetos
	São hifas reprodutivas especiais de zigomicetos 
	Carregam conídeos
	Carregam esporangiósporos
	Os conidióforos produzem conídeos externamente
	Os esporangióforos produzem esporangiósporos internamente (no esporângio)
	Grupos de Fungos
	Tipo de
Hifa
	Estrutura reprodutiva
	Ascomicetos (orelhas de pau)
	Septada
	Conidióforo
	Basidiomicetos (cogumelos)
	Septada
	Fragmentação de hifas
	Zigomicetos (bolores)
	Cenocítica /
asseptada
	Esporângio
A
B
A. Os conidióforos darão origem aos conídios (conidiósporos);
B. Os esporangióforos darão origem aos esporângios (esporos – esporangiosporos).
Anotações:
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Importância dos Fungos
· Fungos Comestíveis;
· Fungos Venenosos;
· Produção de Substâncias químicas;
· Produção de alimentos;
· Doenças de plantas;
· Doenças de peixes e crustáceos;
· Doenças no homem:
· Micoses superficiais;
· Micetoma pulmonar;
· Micoses profundas relacionadas a fezes de aves.
Características nutricionais
· Saprofíticos
· Consumidores de matéria orgânica na natureza
· Parasitas
· Parasitam tecidos dos outros organismos
· Ex.: Fusariose e candidíase
· Quimioheterotróficos
· Dependem de fontes de substratos externas
· Nutrição absortiva: enzimas hidrolíticas liberadas no meio
· Digestão de substratos complexos extracelularmente
· Absorção de substratos simples
· Ex.: glicose
Caracteristicas físico-químicas ambientais
· Umidade: alta - forma filamentosa mais tolerante a ambientes secos
· pH: adaptados a diferentes concentrações de H+ ambientais, porém pH ~ 5 - ideal
· Temperatura: maioria das espécies é mesófila (temperatura corporal)
· Salinidade: 
· Espécies halofílicas – requerem sais para crescer, particularmente o cloreto de sódio;
· Halotolerantes – capazes de crescer em diferentes concentrações de sal, mas que apresentam seu crescimento ótimo em um meio sem sal;
· Halosensíveis – crescem em meios de concentração de menor de sal.
Caracteristicas gerais do metabolismo:
· Aeróbias, anaeróbias facultativas, anaeróbias estritas
· A maioria são aeróbias (filamentosos)
· Anaeróbios - fermentação alcoólica
· Anaeróbios facultativos - levedura (fazem fermentação).
CONTROLE DE QUALIDADE MICROBIOLÓGICO
Cultivo de microrganismos e métodos de quantificação
· Crescimento microbiano
· Tempo de geração
· Intervalo entre dois ciclos de divisão
· Meios de Cultivo
· Técnicas de Cultivo
· Métodos de Quantificação
Fatores que afetam o crescimento microbiano
É necessário conhecer as condições físicas ideais para que o cultivo e a identificação do contaminante ocorra de forma satisfatória.
· Físico - Temperatura, luminosidade, pH;Psicotróficos (<20º)
Mesófilos (30º~40º)
Termófilos (>60º)
· Químico - Disponibilidade de nutrientes, salinidade, O2;
· Biológico - Relações de antibiose, presença de inibidores de crescimento.
Concentração de gases (fator químico: concentração de O2 e CO2)
Oxigênio
· Aeróbios Estritos/obrigatórios
· depende exclusivamente do oxigênio;
· Anaeróbios facultativos
· Utilizam o oxigênio quando está presente, mas em sua ausência, continuam crescendo por meio da fermentação ou respiração anaeróbica.
· Via de regra são fermentadores.
Diminuição da concentração do oxigênio
· Anaeróbios Restritos/obrigatórios
· São incapazes de utilizar o oxigênio molecular, pois é prejudicial para eles.
· São de especial importância, porque existem medicamentos que são envasados à vácuo. Os anaeróbios restritos conseguem sobrevivem no meio. (Endósporos)
· Aerotolerantes
· Não podem utilizar o oxigênio para o crescimento, mas, em sua presença, o toleram relativamente bem.
· Microaerófilas
· Usam oxigênio, mas em concentrações bem pequenas inferiores à do ar.
Capnofílicas
· Vivem em ambientes pobres em O2 e rico em CO2; condições semelhantes às encontradas no trato intestinal e respiratório.
· Agente causador de diarréia, desinteria e Guillain-Barré Syndrome.
Semeio da Amostra
· 20-24h (crescimento das bactérias/ leveduras no meio de cultura);
· 36h-48h (crescimento de fungos filamentosos no meio de cultura).
Meio de Cultura
· Substrato nutriente preparado em condições sintéticas (laboratoriais) visando crescimento microbiano.
· Se utiliza meio sólido ou líquido. O que difere o meio sólido do líquido, é a presença do ágar (agente solidificante)
· Sólido – cresce só na superfície (usado para verificar o crescimento);
· Líquido – cresce de forma mais rápida, pois fica em contato direto com os nutrientes.
 
· Algumas bactérias podem crescer bem em qualquer meio de cultura; outras requerem meios especiais, e outras ainda não podem crescer em qualquer dos meios não vivos até agora desenvolvidos.
Macronutrientes e Micronutrientes
Macronutrientes
· CHONPS 
· Utilizados em maior concentração
· CHO – presente em carboidratos e lipídeos;
· NPS – presente em proteínas e ácidos nucleicos.
Micronutrientes
· Minerais e vitaminas
· Utilizados em menor concentração.
Meio quimicamente definido
· É aquele em que a sua composição exata é conhecida.
· Deve conter fatores de crescimento orgânicos que servem como fonte de carbono e energia.
· Muitos fatores de crescimento orgânicos devem ser fornecidos no meio quimicamente definido utilizado para cultivar espécies. 
· Fastidiosos
· Requerem muitos fatores de crescimento: Precisa de componentes nutricionais específicos;
· Não fastidiosos
· Não é necessário componentes nutricionais específicos, portanto os meios de cultivo são mais simples e mais fáceis de se manipular.
Meios seletivos e diferenciais
Frequentemente é necessário detectar presença de microrganismo específico associados com doenças ou saneamento deficiente. Para essa tarefa os meios seletivos e diferenciais são utilizados.
Um meio pode ser:
· Seletivo
· Permite o crescimento específico de um microrganismo de interesse
· Meio ágar sulfeto bismuto
· crescimento especifico de bactérias do gênero Salmonella
· Diferencial
· Permite diferenciar certas espécies, mesmo quando crescidas com outros organismos na mesma placa (através da cor, por exemplo).
· Ágar sangue
Meio de Enriquecimento
Como algumas bactérias em pequeno número podem ser perdidas, em particular se outras bactérias estiverem presentes em maior número, algumas vezes é necessário utilizar um meio de enriquecimento
· Fornecem nutrientes e condições que favorecem o crescimento de um microrganismo específico e não de outros
· Inóculo original com baixa concentração e proveniente de amostras com comunidades microbianas complexas
· Agrobacter spp
· Utiliza esse meio para amostras que se crer que existe contaminante, mas que esse contaminante não foi muito desenvolvido: aumenta o número de microrganismos de interesse até níveis detectáveis.Fases do crescimento bacteriano
· Curva de crescimento bacteriano
· Mostra o crescimento as células em função do tempo
· Existem 4 fases básicas de crescimento: a fase lag, log, estacionária e a fase de morte celular.
· Lag: preparação para o crescimento populacional, mas sem aumento na população.
· Log ou fase exponencial de crescimento: as células começam a se dividir e entram em um período de crescimento ou aumento logarítmico/exponencial.
· Fase estacionária: período de equilíbrio, momento em que as mortes microbianas são equilibradas pela produção de novas células
· Fase de Morte Celular: o número de mortes ultrapassa o número de células novas formadas, em outras palavras, a população se reduz a uma taxa logarítmica. 
Cultura
· Microrganismos crescendo em meio
· Cultura pura
· Quando há apenas um tipo de organismo presente.
· Cultura mista
· Quando existem populações de organismos diferentes presentes
Faz vários testes no meio de cultura misto para chegar a uma cultura pura, através dos meios seletivos e diferenciais.
Métodos de semeio
Esgotamento por estrias
· Utilizado para obter culturas puras.
· Uma alça de inoculação estéril é mergulhada dentro de uma cultura mista, que contém mais de um tipo de microrganismo, e é semeada em estrias na superfície de um meio nutritivo. Ao longo da estria, as bactérias são depositadas quando a alça entra em contato com o meio. As últimas células depositadas na alça são afastadas o suficiente para crescer em colônias isoladas. Essas colônias podem ser repicadas com uma alça de inoculação e transferidas para um tubo de ensaio com meio nutritivo para obtenção de uma cultura pura contendo somente um tipo de bactéria.
Esgotamento em picada
· Semear com agulha bacteriológica, no centro do Agar. Dependendo da finalidade, o inóculo deve penetrar até 2/3 do tubo ou até o fundo deste. PICADA CENTRAL
PICADA EM PROFUNDIDADE
Incorporação em Placa ou Pour Plate (derramamento)
· Um mL ou 0,1 mL das diluições em suspensão bacteriana é introduzido em uma placa de petri. O meio nutritivo é vertido sobre a amostra (líquido a 50ºC), que é então misturada com o meio por agitação lenta da placa. O ágar se solidifica, a placa é incubada. As colônias crescerão tanto dentro do ágar nutriente, quanto na superfície da placa de ágar.
· Nesta técnica deve-se tomar cuidado para não adicionar o meio em temperatura elevada sobre o inóculo, pois isto poderá matar os micro-organismos. 
· Esta é uma técnica mais utilizada para o isolamento de bactérias.
Espalhamento em Placa ou Spread-Plate (espalhamento)
· Consiste em espalhar o material (suspensão de células) com o auxílio de uma alça de Drigalski (para obtenção de colônias isoladas após diluição), fazendo a semeadura por toda a superfície da placa de Petri. Deve-se ter o cuidado de garantir que toda a superfície da placa seja semeada, evitando regiões sem semeadura. 
Por filtração (cultivo de amostras filtradas)
· Quando a quantidade de bactérias é muito pequena, como em lagos ou correntes de água relativamente puras, as bactérias podem ser contadas pelo método de filtração
· Pelo menos 100mL de água passam através de uma membrana filtrante fina com poros estreitos o suficiente para não deixar que as bactérias passem, ficando assim retidas na superfície do filtro. Esse filtro é transferido para uma placa de petri contendo um suporte embebido em um meio líquido nutriente, que permite que as colônias se desenvolvam.
· É um método utilizado para detectar e registrar bactérias coliformes, indicadoras de contaminação fecal em alimento ou água.
· As colônias formadoras podem ser identificadas quando um meio nutritivo diferencial é utilizado.
Conceitos importantes:
· Descontaminação: tratamento de objeto ou superfície de forma a torná-lo seguro à manipulação.
· Desinfecção: morte ou inibição do crescimento de microrganismos patogênicos.
· Desinfetante: matam microrganismos, mas não necessariamente os endósporos. São utilizados em objetos inanimados.
· Antisséptico: matam ou inibem o crescimento de microrganismos. São atóxicos podendo ser utilizados em tecidos vivos.
· Esterilizante: destrói todas as formas vivas, inclusive esporos. O material é considerado estéril quando todas as formas vivas foram destruídas.
· Sanitizante: reduzem o número de microrganismos a níveis considerados seguros, porém não os eliminam.
· Pasteurização: técnica em que se aplica calor para reduzir a carga microbiana de um produto líquido sem causar alteração em suas propriedades. Tem por objetivo matar organismos causadores de algumas doenças importantes, bem como evitar a fácil deterioração do produto.
· Inóculo: microrganismos introduzidos em um meio de cultura para iniciar o crescimento.
· Cultura: microrganismos que crescem e se multiplicam dentro ou sobre um meio de cultura.
MÉTODO DIRETO DE CRESCIMENTO MICROBIANO
Contagem em placa
Método utilizado para medir populações bacterianas. As contagens em placas muitas vezes são denominadas de unidades formadoras de colônias (UFC).
Quando a contagem é feita, é importante que somente um número limitado de colônias se desenvolva na placa. A FDA recomenda que a contagem de placa tenha somente de 25 a 250 colônias, mas muitos microbiologistas preferem de 30 a 300. Para assegurar que algumas contagens de colônias estejam nessa faixa, o inóculo inicial é diluído várias vezes, em um processo chamado de diluição seriada.
Diluição Seriada:
É a técnica que permite a contagem do número de microrganismos de amostras com concentrações muito elevadas.
Cálculo:
Nº de colônias na placa x índice de diluição a amostra = números de bactérias/mL
Ex.: Se 32 colônias estão na placa de diluição de 1:10.000 (104), a contagem pode ser estimada em 32x10.000 = 320.000 bactérias/mL na amostra.
O Método do Número Mais Provável (MNP)
· Baseado na utilização de tubos contendo meios de cultura líquidos (caldo)
· Essa técnica tem o seguinte princípio: quanto maior o número de bactérias em uma amostra, maior será o número de diluições necessárias para reduzir a densidade até um ponto no qual mais nenhuma bactéria esteja presente nos tubos de diluição seriada.
· Método utilizado quando os microrganismos não crescem em meio sólido.
Contagem em lâmina ou contagem microscópica direta
· Um volume conhecido de suspensão bacteriana é colocado em uma área definida da lâmina microscópica.
 
MÉTODO INDIRETO PARA DETERMINAÇÃO DO NÚMERO DE BACTÉRIAS
Turbidimetria
· Monitora o crescimento bacteriano
· À medida que as bactérias se multiplicam em um meio líquido, o meio se torna turvo ou opaco com as células
· Instrumento utilizado é o espectrofotômetro
· Transmitância e absorbância da luz