CARACTERIZAÇÃO DE UMA ENZIMA MITOCONDRIAL DESIDROGENASE

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PRÁTICA 4 – CARACTERIZAÇÃO DE UMA ENZIMA MITOCONDRIAL: 
DESIDROGENASE SUCCÍNICA 
 
 
 
 
DANIELE HARUMI ESSUMI 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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PRESIDENTE PRUDENTE - SP 
MARÇO/2019 
 
 
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SUMÁRIO 
 
 
 
 
INTRODUÇÃO 3 
OBJETIVOS 6 
PARTE EXPERIMENTAL 6 
RESULTADOS E DISCUSSÃO 9 
CONCLUSÕES 15 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 15​7 
 
 
 
 
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INTRODUÇÃO 
 
Para o estudo das enzimas, realizações de experimentos e análise geral, é 
necessário primeiramente saber a respeito das funções desta. Para o experimento de enzimas, 
sempre verifica-se a reação que esta catalisa e como é a sua participação (a maioria das 
reações com enzimas fazem parte de uma via metabólica). O isolamento da enzima tem a 
finalidade de investigar o mecanismo de reação, medir os parâmetros cinéticos e determinar a 
estrutura da proteína e/ou obter detalhes do seu sítio ativo. [1] 
As enzimas são as responsáveis por acelerar as reações químicas do metabolismo, 
portanto o seu funcionamento é de grande importância. A enzima possui uma parte chamada 
sítio ativo que é onde ocorre a ligação ao substrato (substância que sofre transformação), 
formando um complexo intermediário, que enfraquece as ligações do substrato gerando os 
produtos (substancia que resulta da transformação do substrato) que ao fim são liberados. [2] 
 
E a reação enzimática pode ser escrita genericamente pela equação: 
 
 
 
 
Onde: E= enzima; S= substrato e P= produto 
Equação 1 – Ação enzimática genérica 
 
Figura 1: Reação enzimática, representando a equação 1. 
 
Fonte: https://www.infoescola.com/bioquimica/enzimas/ 
 
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As enzimas são muito específicas para os seus substratos (esta especificidade 
pode ser relativa a apenas um substrato ou a vários substratos ao mesmo tempo). [4] E alguns 
modelos procuram explicar a especificidade substrato/enzima, como na figura 2. 
 
Figura 2: Reação enzimática. A) modelo chave/fechadura B) Modelo de ajusto induzido. 
 
a) Modelo Chave/Fechadura : Prevê um encaixe perfeito do substrato no sítio de ligação, 
que seria rígido como uma fechadura. 
b) Modelo do Ajuste Induzido : Prevê um sítio de ligação não totalmente pré-formado, 
nas sim moldável à molécula do substrato; a enzima se ajustaria à molécula do 
substrato na sua presença. 
Evidências experimentais sugerem um terceiro modelo que combina o ajuste induzido a uma 
"torção" da molécula do substrato, que o "ativaria" e o prepararia para a sua transformação em 
produto. 
 
As atividades das enzimas podem ser controladas pelos chamados moduladores, 
os mais conhecidos são o pH e a temperatura que possuem um valor adequado para que cada 
enzima trabalhe em sua velocidade máxima. As enzimas também podem ser controladas por 
algumas substâncias que possuem a capacidade de minimizar ou interromper as suas funções, 
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são conhecidos como inibidores enzimáticos. [5] Existem basicamente dois tipos de 
inibidores, os reversíveis e os irreversíveis. 
 
 
 
 
INIBIÇÃO 
REVERSÍVEL 
 
Inibidor competitivo 
Compete com o substrato, liga-se ao sítio ativo 
da enzima e impede a ligação do substrato com 
a enzima. 
 
Inibidor incompetitivo 
Liga-se ao sítio não ativo, quando já ocorreu a 
formação do complexo enzima-substrato, 
diminuindo a velocidade da reação. 
 
Inibidor não competitivo 
(mista) 
O inibidor pode se ligar tanto na enzima quanto 
no complexo enzima-substrato, sempre em um 
sítio diferente do ativo. 
INIBIÇÃO 
IRREVERSÍVEL 
Ocorre da destruição da enzima, da formação de uma ligação covalente 
inibidor-enzima ou até mesmo de uma ligação não covalente (estável). 
Tabela 1: Tipos e definições de inibidores. [2] 
 
 
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Figura 3: Três tipos de inibição reversível. A) Inibição competitiva. B) Inibição incopetitiva. 
C) Inibição mista. [2] 
OBJETIVOS 
● Demonstrar a técnica de isolamento de mitocôndrias. 
● Caracterizar a presença de desidrogenase succínica na fração mitocondrial. 
● Reforçar os conhecimentos sobre propriedades das enzimas. 
● Demonstrar a inibição enzimática competitiva. 
 
PARTE EXPERIMENTAL 
 
Materiais e reagentes 
● Meio de extração: sacarose 0,32 mol.L​-1 ​em tampão fosfato 0,02 mol.L​-1 
contendo EDTA 0,01 mol.L​-1; 
● Cloreto de 2,3,5-trifenil-tetrazólio a 0,56 g% pH 7,3; 
● Succinato de sódio 0,5 mol.L​-1 ​pH 7,3; 
● Malonato de sódio 0,5 mol.L​-1 ​pH 7,3; 
● Suspensão de mitocôndrias (contendo a desidrogenase succínica) com 
concentração de proteínas entre 40 e 50 mg/mL; 
● Tampão fosfato 0,02 mol.L​-1 ​pH 7,3; 
● Solução padrão de proteínas 5 mg/mL; 
● Reagente biureto 
● Fígado fresco de boi; 
● Água destilada; 
● Gelo triturado; 
● Almofariz e pistilo; 
● Centrífuga refrigerada; 
● Espectrofotômetro; 
● Béquer de 250 mL; 
● Tubos plásticos de centrífuga; 
● Erlenmeyer de 125 mL; 
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● Gaze; 
● Bastão de vidro; 
● Pipetas volumétricas (1 de 5 mL, 1 de 2 mL e 7 unidades de 1 mL) 
● 11 tubos de ensaio; 
Procedimentos experimentais 
 
Preparo das mitocôndrias 
Recebeu-se 50 g de fígado de boi picado e mantido em refrigeração, transferiu-se 
para um almofariz e macerou-se com a ajuda de um pistilo. Aos poucos, adicionou-se cerca de 
50 mL de meio de extração gelado, triturou-se. Em seguida, filtrou-se em gaze, para reter as 
partículas maiores. O filtrado foi recolhido em um erlenmeyer e transferiu-se para um tubo de 
plástico de centrífuga também resfriado em banho de gelo. O 
tubo foi equilibrado com outro tubo de outro grupo, usou-se a balança para obter o mesmo 
peso e centrifugou-se por 10 minutos 2000 rpm. Desprezou-se o sedimentado, colocou-se o 
sobrenadante novamente no tubos plástico de centrífuga, balanceou-se com o do outro grupo e 
centrifugou em refrigeração por 20 minutos à 6000 rpm. Ao 
fim dessa segunda centrifugação, desprezou-se o sobrenadante e solubilizou-se o material 
sedimentado a um volume total de 6 mL com meio de extração gelado. 
Pegou-se 1 mL dessa solução, colocou-se em um tubo de ensaio e levou-se ao 
banho-maria fervente por cerca de 5 minutos. E o restante usou-se para a quantificação da 
proteína na enzima mitocondrial e na determinação da atividade de desidrogenase, que será 
descritas a seguir. 
 
I - Quantificação da proteína na enzima mitocondrial 
Tomou-se 5 tubos de ensaio, o primeiro tubo como tubo branco, os tubos 2,3,4 são                             
as triplicatas da proteína padrão e o tubo 5 a amostra com a suspensão mitocondrial.                             
Adicionou-se os reagentes na ordem e nas quantidades apresentadas na tabela a seguir: 
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Após a adição de todos os reagentes, agitou-se todos os tubos e deixou-se em repouso 
por 10 minutos. Realizou-se a leitura no espectrofotômetro em 540 nm, sempre calibrando o 
aparelho com o tubo branco em todas as leituras. Durante a aula, calculou-se a concentração 
de proteínas na suspensão coloidal. 
 
II - Determinação da atividade da succinato-desidrogenase 
 
Pegou-se ​6 tubos de ensaio, adicionou-se todos os reagentes na ordem e na 
quantidade indicada na tabela a seguir: 
 
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Agitou-se suavemente todos os tubos, colocou-se os tubos no banho Maria e 
acompanhou-se a mudança de cor durante 10 minutos. Interpretou-se os resultados juntamente 
com a professora e anotou-se a discussão. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 
I. Quantificação da proteína na enzima mitocondrial 
 
Primeiramente, iremos descobrir a concentração de proteínas na suspensão 
mitocondrial dofígado, lembrando que é necessário estar dentro do intervalo de 40 a 50 
µg/mL, para a observação da reação. Utilizou-se a reação do biureto, uma técnica já usadas 
nas práticas anteriores que a partir da formação de um complexo entre o Cobre e as cadeias 
proteicas é possível observar a mudança da coloração da solução de azul ciano para violeta. 
Para esse experimento, usou-se um tubo branco (sem a proteína padrão – tubo 1), realizou-se 
a triplicata com o padrão de proteínas para obter um resultado com maior precisão (tubos 2,3 
e 4) e uma amostra da solução contendo a enzima mitocondrial (tubo 5). 
 
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Figura 4: Resultado da coloração após a adição de todos os reagentes. 
 
TUBOS Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 
ABSORBÂNCIA 0 0,119 0,126 0,121 2,107 
Tabela 2: Resultados da quantificação da proteína na enzima mitocondrial 
 
Calculou-se a média das triplicatas, para obter-se um resultado mais preciso do 
padrão de proteínas. 
 
Média = (Tubo 2) + (Tubo 3) + (Tubo 4) / 3 
Média = 0,119 + 0,126 + 0,121 / 3 
Média = 0,122 
 
Sabe-se que a concentração do padrão de proteínas é de 5 mg/mL, portanto é 
possível realizar o cálculo para determinar a concentração final em mg/mL de padrão de 
proteínas em 1 mL. 
C​1​.V​1 ​=​ ​C​2​.V​2 ​�​ ​C​2 ​= C​1​.V​1 ​/ V​2 
C​2 ​= 5 mg/mL . 0,8 mL / 1 mL 
C​2 ​= 4 mg/mL de padrão de proteínas 
 
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A partir da concentração de padrão de proteína, da média da triplicata e da 
absorbância anotada da amostra, pode-se calcular a concentração de proteínas na suspensão 
mitocondrial. 
 4 mg/mL ------------------- 0,122 
x ------------------- 2,107 
x = 69,08 mg/mL 
 
Lembrando que este valor encontrado foi apenas para a amostra de 0,2 mL da 
suspensão mitocondrial. Para encontrar em 1 mL da suspensão mitocondrial, resolveu-se o 
cálculo seguinte. 
69,08 mg/mL --------------------- 0,2 mL 
 x --------------------- 1 mL 
x = 345,5 mg/mL 
 
Para obter a solução da suspensão mitocondrial dentro da faixa de concentração 
entre 40 e 50 mg/mL, seria necessário fazer uma nova diluição, determinando o volume 
necessário da concentração inicial para obter-se em média 45 mg/mL. 
 
C​1​.V​1 ​=​ ​C​2​.V​2 ​�​ ​V​1 ​= C​2​.V​2 ​/ C​1 
V​1 ​= 45 mg/mL . 1,0 mL / 69,08 mg/mL 
V​1 ​= 0,65 mL de suspensão mitocondrial inicial 
 
II - Determinação da atividade da succinato-desidrogenase. 
Nessa etapa a preparação das reações foram realizadas para uma análise 
qualitativa, para observar a diferença de cores e a partir disso interpretar os resultados. Para o 
primeiro tubo, usou-se como o branco (tubo sem a suspensão mitocondrial e sem inibidores) 
para a calibração de todas as leituras. Os demais tubos variou-se a quantidade de solução 
tampão, e/ou uso de inibidores e/ou uso de suspensão mitocondrial aquecida. A partir da 
tabela de reagentes seguida, as observações provenientes das reações colorimétricas foram 
registrados na tabela 3 seguinte. 
 
Tabela 3: Resultados da determinação da atividade de desidrogenase succínica 
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TUBOS REAGENTES COLORAÇÃO 
FINAL ​(FIGURA 6) 
1 BRANCO: solução tampão, substrato e tetrazólio. Incolor 
2 Solução tampão, tetrazólio e suspensão mitocondrial. Laranja 
3 Sol. tampão, substrato, tetrazólio e suspensão mitocondrial. Vermelho 
4 Solução tampão, substrato, tetrazólio e suspensão mitocondrial 
aquecida. 
Amarelo 
5 Solução tampão, substrato, tetrazólio, inibidor e suspensão 
mitocondrial. 
Laranja 
6 Substrato, tetrazólio, inibidor e suspensão mitocondrial. Vermelho 
OBSERVAÇÃO: solução tampão= Tampão Fosfato 0,02 mol.L​-1 pH 7,3; 
Substrato= Succinato de sódio 0,5 mol.L​-1 pH 7,3; Tretazólio= cloreto de 
2,3,5-trifenil-tretazólio a 0,56% pH 7,3; Inibidor= Malonato de sódio 0,5 mol.L​-1 pH 7,3; 
Suspensão mitocondrial= sem ferver; Suspensão mitocondrial aquecida= após 5 minutos em 
banho-maria fervente. 
 
Figura 5: Resultados da coloração antes da incubação em banho-maria. 
 
 
Figura 6: Resultados da coloração depois da incubação em banho-maria. 
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Lembrando, que o experimento realizado simula uma das etapas do ciclo de 
Krebs, a conversão do succinato a fumarato, sendo catalisado pela desidrogenase succínica na 
cadeia respiratória. 
 
Figura 7: Conversão do succinato a fumarato. 
 
Para o tubo 1 (tubo branco/padrão), contém substrato, tretazólio (mesma 
quantidade para todos os tubos) e completou-se com solução tampão (maior quantidade), este 
é utilizado para a calibração de todas as leituras, sendo sua coloração a inicial sem o reagente 
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de suspensão mitocondrial, uma vez que a partir da adição dos demais reagentes a coloração 
inicialmente amarela translúcida (tetrazólio a 0,56%) se tornou incolor devido a diluição. 
No tubo 2, usou-se para identificar a coloração da solução de enzimas sem ferver 
(analito) e sem o uso de susbtrato. A cor do aceitador final de elétrons em solução aquosa é 
amarelo pálido, porém com a adição da suspensão mitocondrial obteve-se a coloração 
alaranjado. 
No tubo 3, é a reação ideal/completa, contendo as enzimas sem ferver, o substrato 
(succinato) e o reagente colorimétrico (2,3,5-trifenil-tetrazólio). Como esperado, a coloração 
observada foi a vermelho claro devido ao processo de redução ocorrido na molécula de 
2,3,5-trifenil-tetrazólio (amarelo) o convertendo em trifenil-formazan (vermelho). Para 
entender o que ocorreu deve-se lembrar da reação principal que é a oxidação da molécula de 
succinato a fumarato catalisada pela enzima succinato-desidrogenase, reação presente na sexta 
etapa do ciclo de Krebs. Portanto, o tubo 3 reação servirá de base para comparação com os 
demais tubos. 
 
 
Figura 8: Reação de oxidação do succinato a fumarato. 
A reação da etapa possui o FADH2 que é fornecedor de elétrons que reduz o 
2,3,5-trifenil-tetrazólio (o reagente colorimétrico na solução) o convertendo na molécula de 
trifenil-formazan (VERMELHO). 
O tubo 4 tem a mesma constituição do tubo 3 com a alteração do analito que é a 
solução de enzimas mitocondriais após a fervura. Onde é observado a inativação da enzima, 
mesmo com todos os reagentes disponíveis não há mudança na coloração, pois a enzima 
perdeu sua função devido à forte temperatura que destrói sua estrutura quaternária e terciária, 
responsáveis por garantir sua atividade biológica. 
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No tubo 5 tem a mesma constituição que o tubo 3, diferenciando-se pelo fato de 
conter o malonato (inibidor). O malonato se encontra no ciclo de Krebs, porém, em uma etapa 
à frente da reação ensaiada. Observou-se que a coloração da solução ficou amarela alaranjada, 
distanciando-se da cor observada no tubo 3, ou seja, houve a diminuição na velocidade da 
reação, uma vez que a cor final não foi o vermelho claro. Como todos os tubos tiveram o 
mesmo tempo de reação, este demoraria muito mais para apresentar mesma coloração da 
reação ideal, sendo assim, identifica-se o malonato como inibidor, ou seja, interfere na ação 
da enzima e desacelera a velocidade da reação [5]. Para determinar se é um inibidor do tipo 
reversível basta observar que a reação continuou acontecendo mesmo na presença do inibidor, 
se fosse do tipo irreversível a interação entre o inibidor-enzima implicaria na sua inativação;agora para analisar a inibição competitiva ou não, altera-se a concentração do substrato para 
observar se a interferência é vencida. E o tubo 6 analisou isso, apenas se diferenciando do 
tubo 5 pela maior concentração de succinato, mostrando que o aumento da concentração do 
substrato venceu parcialmente a ação do inibidor, mas não suficientemente, tanto que a cor 
permanece no laranja e não atinge o vermelho (reação ideal no tubo 3). Logo, a ação do 
inibidor mostra ser do tipo competitiva, em que o agente inibidor só se liga ao sítio ativo por 
afinidade e não gera produtos, se fosse o contrário o aumento da concentração do substrato 
não alteraria a velocidade da reação, pois as duas reações seriam favorecidas por gerar 
produtos. 
 
 
 
 
 
CONCLUSÃO É importante evidenciar que as reações foram extremamente 
coerentes com o que se deveria observar e que a primeira parte dos testes foi de extrema 
importância para garantir a boa visualização da reação. Como quantificamos a concentração 
das enzimas logo no início, não tivemos problemas quanto ao escurecimento da solução por 
excesso de agente colorimétrico que observamos nos demais grupos. Observamos mais uma 
vez como é importante o controle da temperatura e agitação da solução contendo enzimas, 
uma vez que a desnaturação inviabiliza a atividade biológica das mesmas e indicada na 
segunda parte dos testes e, especificamente, na reação do tubo 4. Quanto à identificação da 
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ação de inibição do malonato, foi possível observar sua interação reversível e competitiva 
com o succinato. A reversibilidade se dá pelo fato de não inativar a ação da enzima, por ter 
estrutura molecular muito parecida com o substrato ele acaba ocupando o sítio ativo, mas não 
altera a conformação da mesma possibilitando que o substrato interaja com o sítio ativo e 
produza o que a reação inicial provê. Competitiva por que o aumento da concentração do 
substrato faz a diferença na velocidade de ação da enzima e comprova que realmente a 
interação enzima-inibidor não fornece produtos, sendo assim, pois favorece a interação do 
substrato. Caso contrário, a mudança na concentração não seria tão drástica por ambas 
gerarem produtos. A reação ensaiada na segunda parte da prática também constata a 
veracidade da sexta etapa do ciclo de Krebs, mostrando que as espécies redutoras são mesmo 
formadas e com capacidade real de redução. E mais uma vez foi possível interpretar os dados 
através de análises colorimétricas, fazendo uso de reagentes que modificam a sua estrutura 
química e alteram a cor de forma evidente como o 2,3,5-trifenil-tetrazólio. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
[1] BRACHT, A. ISHI-IWAMOTO, E. L. Métodos de laboratório em bioquímica. Barueri – 
SP: MANOLE, 2003. 
 
[2] NELSON, D. L. e COX, M. M.. Princípios de Bioquímica de Leningher. 3ª Edição. São 
Paulo-SP: SARVIER. 2002. 
 
[3] GALLO, L. A. Enzimas 2. <http://docentes.esalq.usp.br/luagallo/Enzimas2.htm> 
Acesso em: 22/03/2019 
 
[4] GALLO, L. A. Enzimas 1. <http://docentes.esalq.usp.br/luagallo/enzimas.html> 
Acesso em: 23/03/2019 
[5] LIEBERMAN, M., MARKS, A.D., SMITH, C.M., 2009. Marks' basic medical 
biochemistry : a clinical approach, 3rd ed. Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins, 
Philadelphia. 
<https://www.ufrgs.br/lacvet/site/wp-content/uploads/2014/08/inibid_enzim_intox.pdf>