Eletroforese: Método Analítico de Separação

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Eletrofores�
● Separação/caracterização de componentes
(MÉTODO ANALÍTICO)
● Partículas devem ter CARGA (macromoléculas)
● Migração diferencial dependente de campo
elétrico
● Determina quantidade e grau de pureza
Ex: Ponto isoelétrico e massa relativa de uma proteína
● Moléculas (-) —-------------> Ânodo
● Moléculas (+) —-------------> Cátodo
Força elétrica que move a partícula para seu determinado
eletrodo: Fel = Δϕ.q
Onde Δϕ é o potencial elétrico é q é a carga líquida da
molécula.
Força de fricção: Ff = V.ffr
Onde V é a velocidade da partícula é ffr é o coeficiente de
fricção.
Em caso de campo elétrico constante as duas forças se
balanceiam e a molécula migra em V constante.
Fl�� migraciona� da� partícula�
carregada�.
O fluxo, J, é proporcional a:
● a carga pontual (q),
● a concentração da molécula (C),
● a área que o fluxo atravessa (A),
● a mobilidade da molécula (u)
● o potencial elétrico
Fatore� qu� interfere� n� V d�
migraçã�:
● Viscosidade do meio (n)
● Raio da partícula ( r)
● Densidade de carga (q)
● Potencial etérico
Outros fatores que interferem na v de migração:
● pH do meio (tampão);
● força iônica do tampão;
● interação com a fase fixa;
● tipo de suporte;
● grau de embebição (adsorção) do suporte;
● temperatura;
A adsorção é a característica que certos suportes,
principalmente o papel, agar e alguns tipos de agarose
apresentam interagindo fisico-quimicamente com os
anfolitos, como por exemplo, proteínas carregadas
positivamente. Para eliminar este problema, devemos
trabalhar com soluções-tampão cujo pH seja superior ao
pI dos anfólitos, de modo que a carga dos anfolitos seja
negativa e repulse a carga negativa presente nestes
meios.
Eletrofores� Livr�
● Arne Tisllus
● Mede a mobilidade eletroforética pelo método
do movimento de fronteiras
● Fase ascendente e Descendentes
● Proteínas migram de acordo com sua carga e
eletrodo de atração
● pH do tampão deve ser de acordo com o ponto
em que todas as proteínas possuam mesma
carga
● A v de migração das proteínas é mais rápida
para as que assumem as fronteiras
● ÍNDICE DE REFRAÇÃO (RF) muda de acordo
com a passagem das proteínas
● Método em desuso por apresentar problemas
como: aquecimento que interfere diretamente
no movimento de convecção do líquido e ondas
mecânicas.
Eletrofores� e� suport�
sólid�
● O suporte sólido deve ser embebido
previamente no tampão para receber a amostra.
● Extremidades do papel serão mergulhadas no
tampão (onde estão mergulhados os eletrodos
qeu gerarão o campo elétrico).
● Os suportes sólidos mais utilizados são: PAPEL
DE FILTRO (EPF) e ACETATO DE CELULOSE
(EAC) —-----> INERTES
● EAC > EPF: Maior rigidez na separação de
potencial de fracionamento ( ex: Beta-globulina
e Beta-lipoproteína)
● O processo é mantido até a formação de
ZONAS NÍTIDAS
● Posição e densidade das proteínas é feita pelo
DENSITÔMETRO
Eletrofores� e� suport�
sem�-sólid�
● Géis de AGAROSE ou POLIACRILAMIDA
● Suporte e material da matriz retardam ou
excluem moléculas de acordo com o tamanho.
—---------> Causam maior resolução
eletroforética.
➢ Eletrofores� e� ge� d� ágar o� agar�� (EA)
● Processo parecido com o de EAC
● IMUNOELETROFORESE: define e
caracteriza substâncias a partir de
sua mobilidade, coeficiente de difusão
e especificidade que confere as
propriedades imunológicas.
1º realiza-se a separação
eletroforética
2º faz-se uma reação antígeno
anticorpo (Ag-Ac)
3º Separa-se as proteínas solúveis
dos complexos Ag-Ac insolúveis.
➢ Eletrofores� e� ge� d� poliacrilamid�
(EGPA)
● Polímeros entrecruzados de
poliacrilamida
● Filtração da amostra pela rede do gel
● Redução da V de migração= Separa
pela massa relativa proteínas de
mesma carga.
● Regiões com grandes poros do gel se
encontram na parte superior, diferente
da inferior que os poros são menores.
★ Protocol�:
➔ Eletrofores� e� suport� sólid�:
1. Preencher cuba com tampão de
corrida até a metade e observar pólos
elétricos.
2. Retirar fita de AC com pinça do
pacote e embeber na solução tampão
durante 3-5 min.
3. Remover o excesso de tampão da fita
e escolher o lado permeável (opaco)
4. Esticar a fita na ponte e certificar que
ambas extremidades se encontram
em contato com o tampão e com a
superfície permeável para cima.
5. Fechar a cuba e ligar a fonte,
equilibrando, assim, os poros com o
tampão.
6. Desligar a fonte. Pipetar uma amostra
de soro em uma placa de Petri e
corar com o corante líder. Aplicar 5
Uml da amostra 1-2 cm do polo
negativo e picotar com a tesoura os
dois lados do ponto de partida
7. Fechar a cuba e ligar a fonte. (30 min
de corrida)
8. Desligar a fonte. Marcar com a
tesoura a chegada em um lado da
fita. Cortar as extremidades da fita e
colocar sobre a placa de Petri.
Aplicar corante revelador( 2 minutos)
9. Retirar corante revelador e aplicar
solução descorante agitando.
Lavagens com descorante em
temperatura ambiente e duas com ele
quente com o objetivo de retirar
excesso de corante revelador e líder.
10. Estender a fita sobre a tampa de uma
placa de petri.
11. Procedimentos de medição
Medir migração das proteínas com
uma régua e calcular a migração
relativa (RF) e comparar com os
padrões de migração de proteínas.
Rf = DP /DL
● DP é a distância percorrida por proteína, mm, e
DL é distância percorrida por corante líder, mm.
12. Colocar a fita numa solução
transparentizante
13. Retirar da solução, colocar numa
placa de Petri e deixar na estufa até
que a mesma fique transparente.
14. Colocar a fita num densitômetro
(fotocolorímetros específicos) para
realização da leitura e determinação
da quantidade (relativa ou absoluta)
de cada proteína
Densitômetr�: Baseia-se na capacidade das moléculas
de absorver a luz (absorbância) diretamente proporcional
à concentração de moléculas. Espectrofotômetro
específico.
Quantidade relativa definida a partir do peso de cada
onda (balança analítica) ou pelas relações matemáticas
das áreas dessa curva.
➔ Eletrofores� e� suport�
sem�-sólid�
As amostras (misturas das proteínas a ser analisadas
estão colocadas com ajuda das micropipetas, nos poços
do gel (1-3). O campo elétrico está aplicado (4) e as
proteínas migram com velocidades diferente (5, 6)
dependendo das cargas elétricas livres e tamanhos.
➢ Eletrofores� n� presenç� d� SDS
● Determinação de pureza e peso molecular
● Dodecilsilfato de sódio
● Se liga por ligações hidrofóbicas em
quantidades proporcionais ao peso molecular e
em proporções de 1 aminoácido para 2
moléculas de SDS
● O SDS ligado adiciona uma grande carga
negativa a molécula, tornando insignificantes as
cargas intrínsecas.
● Separa-se exclusivamente pela massa.
➔ Focal�açã� Isoelétric�
Procedimento para determinar o Ponto ISOELÉTRICO de
uma proteína.
● Anfólitos (Base + Ácido de pequena massa)
aplicados no suporte, aplica-se um campo para
distribuir os anfólitos, estabelece um gradiente
linear de ph no gel de poliacrilamida.
● Formação de uma área estacionária, proteínas
migram de acordo com seu pI. Quando atingido
o pI a proteína para de migrar e para na fita
● Eletrofores� bidimensiona�.
. Combinação de Eletroforese na presença de
SDS e Focalização Isoelétrica
● Géis bidimensionais
● Misturas mais complexas de
proteínas
● Difere moléculas de massa relativa
idênticas, mas diferentes pontos
isoelétricos ou o inverso
● Corante COOMASSIE
● Revelação: Prata e corantes
fluorescentes.
● Iontofores�
Eletroforese para injeção de medicamentos
através da pele.
● Facilitação da penetração dos tecidos
p/ substâncias ionizadas quando
submetidas a um potencial elétrico
adequado.
● Transporte significativo de fármacos
para a região cutânea e sub do
tecido.
Benefícios:
● Menos invasivo
● Sem dor
● Absorção de drogas sem
ser pelo trato
gastrointestinal
● Diminui riscos de
superdosagem
● Aplicação de drogas
transpondo o metabolismo
hepático
Aplicações clínicas:
● Inflamação com dor constante
● Artrite Reumatóide
● Espasmos musculares
● Cicatrização
● Depósitos de Cálcio
● Neuropatias
● Verrugas
● Gôta
➔ Eletrofores� da� proteína� sérica�
●Importante papel na investigação clínica
● Ordem de mobilidade crescente
● Proteínas do soro
● fração albumina, alfa-1, alfa-2, beta e gama
globulina.