Determinação de Coliformes em Águas

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 
Instituto de Biociências – Campus de Rio Claro 
Departamento de Bioquímica e Microbiologia 
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DETERMINAÇÃO DE COLIFORMES EM AMOSTRAS DE ÁGUAS – Parte I 
 
Disciplina: Microbiologia Geral e Aplicada                                                                 Prática 09 
Prof. Dr. André Rodrigues 
 
 Objetivos 
 
a)  Compreender  a  importância  das  bactérias  do  grupo  coliformes  como  indicadores  da  qualidade 
microbiológica da água 
b) Familiarizar‐se com a técnica de tubos múltiplos utilizada na determinação de coliformes.  
 
 Considerações 
 
O monitoramento da qualidade da água potável para consumo humano é  fundamental na saúde 
pública. O padrão de potabilidade é  regulado por  legislação específica de monitoramento e  controle da 
qualidade da água considerada própria para consumo. No Brasil, a portaria n°. 518 de março de 2004 do 
Ministério da Saúde estabelece os padrões de potabilidade da água. Na portaria  toda agua destinada ao 
consumo humano deve ser avaliada quanto a parâmetros físicos, químicos, radioativos e microbiológicos, 
de modo a não oferecer riscos a saúde. Assim, águas de poços, cisternas, nascentes, minas e reservatórios 
estão todas sujeitas ao controle microbiológico.  
Os  métodos  de  análise  da  portaria  brasileira  estão  baseados  no  “Standard  Methods  for  the 
Examination  of Water  and Wastewater,  de  autoria  das  instituições  American  Public  Health  Association 
(APHA),  American  Water  Works  Association  (AWWA)  e  Water  Environment  Federation  (WEF),  ou  das 
normas publicadas pela  ISO  (International  Standartization Organization)”  (trecho extraído da portaria n. 
518  p.  11,  Art.  17).  Desse  modo,  a  portaria  baseia‐se  em  padrões  internacionais  para  avaliação  da 
qualidade microbiológica da água. 
Vários  são os micro‐organismos utilizados  como bioindicadores da qualidade da agua potável. A 
presença de tais micro‐organismos indicam a possível presença de patógenos advindos de fezes animais ou 
humanas. As bactérias do grupo coliformes são os principais indicadores utilizados para inferir a qualidade 
da águas para consumo. Esse grupo é dividido em coliformes totais e termotoletantes, sendo Escherichia 
coli um  representante do último  grupo  e  indicador de  contaminação de origem  fecal. Na  aula de hoje, 
iremos determinar a presença de coliformes em diversas amostras de águas utilizando a técnica de tubos 
múltiplos (ou conhecida como número mais provável ‐ NMP). Com os resultados obtidos, iremos compara‐
los com os níveis aceitáveis estabelecidos na portaria n. 518. 
 
 Técnica dos tubos múltiplos ou “Número Mais Provável” (NMP) 
 
A presente técnica compreende três etapas, a saber: (1) ensaio presuntivo, (2) ensaio confirmatório 
e (3) identificação de E. coli. Nesta aula iremos realizar apenas primeira etapa. 
 
(1) Ensaio presuntivo  
 
O objetivo do ensaio presuntivo é detectar a presença das coliformes totais (gêneros Enterobacter, 
Citrobacter e Klebsiella) nas amostras, através da formação de gás nos tubos. As amostras de agua foram 
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coletadas em  recipientes estéreis e  foram mantidas a 4o C. Nesta pratica utilizaremos uma  série de  três 
tubos por diluição ou invés de um série de cinco tubos, a qual é recomendada pelos padrões internacionais. 
 
a) Homogeneizar a amostra agitando‐a suavemente.   
b)  Retire  uma  pipeta  graduada  de  10 mL  do  cilindro  de  esterilização  e  inserir  o  pipetador  (OBSERVE 
ATENTAMENTE AS INSTRUÇÕES DO PROFESSOR PARA EVITAR ACIDENTES).  
c)  Inocular  um  volume  de  10 mL  em  cada um dos  três  tubos  contendo  10 mL de Caldo  Lauril  Triptose 
duplamente concentrado (2x). Cada tubo contem um tubo menor invertido (tubo de Durhan). 
d) Com auxílio de uma pipeta de 1mL inocular tal volume da amostra em cada um dos três tubos contendo 
9 mL de Caldo Lauril Triptose com concentração normal. 
e) Com auxílio de uma pipeta de 1mL inocular 0,1 mL da amostra em cada um dos três tubos contendo 9,9 
mL de Caldo Lauril Triptose com concentração normal.  
f) Incubar os tubos à 35º C por 24 horas. Caso o resultado seja negativo, incubar por mais 48 horas. 
g) Após o período de  incubação, a  leitura  será  realizada pela  contagem dos  tubos  com presença de gás 
(tubos positivos) em cada uma das diluições.  
h) Com a sequencia de tubos positivos será possível comparar com os valores presentes na tabela de NMP 
(tabela de McCrady) e determinar o número de coliformes.  
 
 Meio Caldo Lauril Triptose 
 
Triptose............................... ............................. 20,0g 
Lactose................................. ............................ 5,0g 
Fosfato de potássio dibásico.............................2,75g 
Fosfato de potássio monobásico......................2,75g 
Cloreto de sódio.................... ........................... 5,0g 
Lauril sulfato de sódio........ .............................. 0,1g 
Água destilada............... ................................... 1000ml 
pH final = 6.8 
 
 Referências 
 
ALCÂNTARA,  F.;  CUNHA,  M.  A.;  ALMEIDA,  M.  A.  Microbiologia:  práticas  laboratoriais.  2ª  ed.  Aveiro: 
Universidade de Aveiro, 2001. 297 p.  
BRASIL. Ministério da Saúde. Portaria no 518 de 25 de março de 2004. Dispõe sobre os procedimentos e 
responsabilidades relativos ao controle e vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu 
padrão de potabilidade. Diário Oficial (da) República Federativa do Brasil, Brasília, DF, 2004 
PEPPER,  I.  L.;  GERBA,  C.  P.  Environmental microbiology:  a  laboratory manual.  2nd  ed.  Elsevier  Press: 
Amsterdam, 2004. 209 p.