Apostila de Microbiologia Básica

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Serviço Público Federal 
Universidade Federal do Sul e Sudeste do Pará 
Instituto de Estudos do Trópico Úmido - IETU 
Faculdade de Medicina Veterinária - FAMEV 
 
 
 
 
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA - FAMEV 
 
 
 
 
Microbiologia Básica 
Roteiro de aulas práticas 
 
 
 
 
Aluno (a): 
Professores (as): 
Paulo V C Mendes 
Sumário 
PLANO DE ENSINO .................................................................................................. 3 
1. Biossegurança no laboratório de Microbiologia ............................................... 11 
2. O laboratório de Microbiologia ......................................................................... 14 
3. Lavagem das mãos ............................................................................................. 20 
4. Presença de microrganismos no ambiente e técnicas de semeadura ................ 27 
5. Técnicas de coloração simples ........................................................................... 30 
6. Coloração de Gram ............................................................................................ 34 
7. Técnica de Coloração de Ziehl Neelsen ............................................................. 37 
8. Preparo de Materiais e Vidrarias para Esterilização em Autoclave................ 47 
9. Preparo de Meios de Cultura ............................................................................ 51 
10. Antibiograma – Testes de Sensibilidade a Antimicrobianos (TSA) ................. 54 
11. Estrutura e morfologia microscópica de fungos................................................ 66 
12. Técnica de Microcultivo em Lâminas................................................................ 69 
 
3 
Estamos expostos às mais variadas situações de risco, devido à própria natureza 
da atividade que se desenvolve aqui: diferentes micro-organismos com diferentes graus 
de periculosidade à saúde humana, substâncias corrosivas e tóxicas, materiais radioativos. 
O primeiro passo para se evitar um acidente é saber reconhecer as situações que podem 
desencadeá-lo. Em seguida, é preciso conhecer e aplicar uma série de regras básicas de 
proteção individual e coletiva. Nas páginas seguintes você encontrará um grande número 
dessas recomendações; segui-las não somente contribuirá para seu bem-estar pessoal 
como, também, para sua formação profissional. 
 
Normas de segurança 
 
Segurança é assunto de máxima importância e especial atenção deve ser dada às 
medidas de segurança pessoal e coletiva em laboratório. Embora não seja possível 
enumerar aqui todas as normas de segurança em laboratório, existem certos cuidados 
básicos, decorrentes do uso de bom senso e de conhecimento científico, que devem ser 
observados. As normas foram divididas em cinco grupos: as que se referem à parte física 
do laboratório, às atitudes que o laboratorista deve ter, a seu trabalho no laboratório, à 
limpeza do laboratório e do material e aos procedimentos em caso de acidente. 
 
O laboratório 
 
1. Conheça a localização da saída de emergência, do chuveiro de emergência, do lava 
olhos, dos extintores de incêndio, dos registros de gás de cada bancada e das chaves gerais 
(elétricas). Saiba usar estes dispositivos. 
2. Mantenha as janelas abertas para ventilar o laboratório. 
3. Verifique se os cilindros de gás sob pressão estão presos com correntes ou cintas. 
4. Ao se retirar do laboratório, verifique se não há torneiras (água ou gás) abertas. 
5. Desligue todos os aparelhos. 
 
 
As atitudes 
 
 
1. É expressamente proibido que os alunos subtraiam qualquer material biológico e 
químico (especialmente solventes), vidraria ou equipamento (micropipetas, eletrodos, 
balanças etc.) dos laboratórios didáticos. Estes materiais podem ser utilizados somente 
4 
para a execução de experiências em aulas práticas e os infratores desta norma estarão 
sujeitos às sanções disciplinares e legais previstas no regimento interno da USP. 
2. Use jaleco devidamente fechado e de manga comprida. 
3. Não use sandálias ou chinelos, que não protegem de respingos e de queda de objetos. 
Use somente sapatos fechados, de preferência de couro. 
4. Prenda seu cabelo se for comprido. Pode pegar fogo. 
5. Não fume, não coma e não tome nada no laboratório. Isto pode contaminar reagentes, 
comprometer aparelhos e provocar intoxicação. 
6. Não coloque bolsas, malhas, livros, etc. sobre a bancada, mas apenas o caderno de 
anotações, caneta e calculadora. 
7. Não brinque no laboratório. Esteja sempre atento ao experimento que está sendo 
realizado. 
8. Não trabalhe sozinho no laboratório. É preciso haver outra pessoa para ajudar em 
caso de emergência. O trabalho experimental no laboratório pode ser executado somente 
na presença do professor (a) responsável. 
9. Não receba colegas no laboratório. Atenda-os no corredor. Apenas alunos da 
disciplina podem adentrar ao laboratório. 
10. Siga rigorosamente as instruções fornecidas pelo professor. 
11. Consulte o professor antes de fazer qualquer modificação no andamento da 
experiência e na quantidade de reagentes a serem usados. 
12. Caso esteja usando um aparelho pela primeira vez, leia sempre o manual antes e 
consulte o professor. 
13. Nunca teste um produto químico ou material biológico pelo sabor (por mais 
apetitoso que ele possa parecer). 
14. Não teste um produto químico ou material biológico pelo odor. 
 
 
O trabalho 
 
 
1. Para pipetar, use seringa, pêra de borracha ou pipetador para aspirar o líquido. Nunca 
aspire líquidos com a boca. 
2. Evite contato de qualquer substância com a pele. 
3. Encare todos os produtos químicos e microbiológicos como potencialmente nocivos à 
saúde, enquanto não verificar sua inocuidade, consultando a literatura especializada. 
5 
4. Conheça as propriedades físicas, químicas e toxicológicas das substâncias assim como 
o nível de periculosidade dos micro-organismos com que vai lidar, bem como métodos 
de descarte dos resíduos gerados. Consulte a bibliografia. 
5. Antes de usar qualquer reagente, leia cuidadosamente o rótulo do frasco para ter 
certeza de que aquele é o reagente desejado. 
6. Conserve os rótulos dos frascos, pois contêm informação importante. 
7. Não aqueça líquidos inflamáveis em chama direta. 
8. Nunca deixe frascos contendo solventes inflamáveis (por exemplo: acetona, álcool, 
éter) próximo a uma chama. 
9. Nunca deixe frascos contendo solventes inflamáveis expostos ao sol. 
10. Não armazene substâncias oxidantes próximo a líquidos voláteis e inflamáveis. 
11. Abra frascos o mais longe possível do rosto e evite aspirar ar naquele exato 
momento. 
12. Nunca torne a colocar no frasco uma droga retirada em excesso e não usada. Ela 
pode ter sido contaminada. 
13. Nunca aqueça o tubo de ensaio, apontando sua extremidade aberta para um colega 
ou para si mesmo. 
14. Cuidado ao aquecer vidro em chama: o vidro quente tem exatamente a mesma 
aparência do frio. 
15. Não deixe bicos de Bünsen acesos à toa. 
16. Dedique especial atenção a qualquer operação que necessite aquecimento 
prolongado ou que libere grande quantidade de energia. 
17. Use luva térmica para tirar material quente da estufa. 
18. Use luva de pano ou simplesmente um pano para proteger a mão ao inserir um tubo 
de vidro ou um termômetro numa rolha. 
 
A limpeza 
 
 
1 Água ou outros produtos derramados e não contaminados no chão podem tornar o 
piso escorregadio. Providencie imediatamente a limpeza. 
2. A bancada de trabalho deve ser mantida limpa e seca para evitar que se entre 
inadvertidamente em contato com uma substância tóxica, corrosiva ou biologicamente 
perigosa. 
3. Não jogue papéis ou outros sólidos nas pias. Provocam entupimentos. 
6 
4. Não jogue cultura de micro-organismos, solventes ou reagentes nas pias. Eles 
contaminam/poluem o ambiente e solventes inflamáveis na tubulação de esgoto podem 
levar a sérias explosões. Despeje solventes em frascos apropriados.Em caso de dúvida, 
consulte o professor sobre o método adequado de descarte. 
5. Não jogue vidro quebrado ou lixo de qualquer espécie nas caixas de areia. 
6. Ao se retirar do laboratório, lave sempre as mãos. 
 
 
Os acidentes 
 
 
1. Em caso de acidente, procure imediatamente o professor, mesmo que não haja danos 
pessoais ou materiais. 
2. Todo acidente, por menor que pareça, e qualquer contacto com reagentes químicos ou 
microbiológicos devem ser comunicados ao professor. 
3. Caindo produto químico ou microbiológico nos olhos, na boca ou na pele, lave 
abundantemente com água a parte atingida. A seguir, avise o professor e procure o 
tratamento específico para cada caso. 
4. Vidros quebrados devem ser descartados, depois de limpos, em depósitos para lixo de 
vidro. Nunca jogue vidros quebrados no lixo comum, onde podem causar cortes no 
pessoal de limpeza. 
5. Em caso de derramamento de mercúrio, chame imediatamente o professor ou o técnico. 
Vapores de mercúrio são muito tóxicos. 
7 
1. Biossegurança no laboratório de Microbiologia 
 
Introdução 
A Biossegurança é uma área de conhecimento definida pela Agência Nacional de 
Vigilância Sanitária (ANVISA) como: “condição de segurança alcançada por um 
conjunto de ações destinadas a prevenir, controlar, reduzir ou eliminar riscos inerentes às 
atividades que possam comprometer a saúde humana, animal e o meio ambiente”. 
As características peculiares dos agentes microbiológicos, dentre os quais se 
destacam o grau de patogenicidade, o poder invasão, a resistência a processos de 
esterilização, a virulência e a capacidade mutagênica, tornam de grande relevância o tema 
desta aula. Cabe ressaltar que os riscos biológicos são fruto ou consequência da atividade 
humana, portanto, nunca é demais lembrar que todo esforço deve ser concentrado na 
formação de recursos humanos bem capacitados. 
 
Vias de penetração dos microrganismos 
 
• Via aérea 
 
Os laboratórios de microbiologia, em sua maioria, produzem aerossóis 
(micropartículas sólidas ou liquidas que podem permanecer em suspensão) por meio da 
pipetagem, centrifugação, maceração de tecidos, agitação, flambagem da alça 
bacteriológica, entre outras práticas. 
O aerossol pode ficar em suspensão, propagar-se à distância e contaminar, através 
da inalação de partículas, dependendo da concentração do agente infeccioso, da 
capacidade de patogenicidade e de sua virulência. 
• Via cutânea 
 
Uma das formas mais frequentes de transmissão por esta via é sem dúvida, o 
ferimento por agulhas contaminadas, sobretudo durante a prática incorreta de encapá- 
las após o uso. O corte ou a perfuração por vidraria quebrada, trincada ou ainda por 
instrumentos perfurocortantes contaminados também constituem modos de 
contaminação relevantes. 
• Via ocular 
8 
A contaminação da mucosa conjuntival ocorre, invariavelmente, por projeções de 
gotículas ou aerossóis de material infectante nos olhos. 
• Via oral 
 
O ato de pipetar com a boca representa uma das mais frequentes formas de 
infecção nos laboratórios. Porém, a contaminação oral não ocorre, necessariamente, 
por esta prática, sendo o hábito de fumar, fazer refeições no laboratório e a falta de 
procedimentos higiênicos (não lavar as mãos após manusear materiais contaminados) 
importantes formas de transmissão por esta via. 
 
Boas práticas laboratoriais 
 
 
Consiste em um conjunto de normas e procedimentos de segurança, que visa a 
minimizar os acidentes e aumentar o nível de consciência daqueles que estão no ambiente 
laboratorial. A seguir, encontram-se listadas algumas das principais normas: 
o Lavar as mãos antes de deixar o laboratório. 
o Nunca pipetar com a boca. Usar sempre pipetadores automáticos e peras 
de borracha. 
o No laboratório, não fazer refeições ou preparar alimentos, não beber, não 
fazer higiene bucal, não se maquiar, não fumar e não roer as unhas. 
o Guardar os artigos de uso pessoal em locais apropriados. 
o Não permanecer no laboratório com calçados abertos, ou seja, usar sapatos 
que protejam inteiramente os pés. 
o Não trabalhar com material patogênico se houver ferida na mão ou no 
pulso. 
o Quando usar luvas, não abrir portas e manusear o telefone. 
o Durante a presença no laboratório, utilizar vestuário apropriado. 
o Fazer sempre o uso de EPIs (Equipamentos de Proteção Individual) tais 
como: luvas, jaleco, toca, máscara. 
o Quando necessário fazer uso dos EPCs (Equipamentos de Proteção 
Coletiva) tais como: chuveiro de emergência, lava-olhos, cabine de 
segurança biológica. 
 
Exercícios de fixação 
9 
1. Qual a importância da Biossegurança no laboratório de Microbiologia? 
2. Como se deve proceder em um laboratório de Microbiologia, para assegurar a 
saúde do manipulador? 
3. Descreve, resumidamente, como os microrganismos podem ter acesso ao nosso 
corpo causando-nos uma infecção? 
4. Escolha 3 das boas práticas citadas anteriormente e explique como o não 
cumprimento a elas pode acarretar problemas. 
 
Referências bibliográficas 
 
Teixeira P, Valle S. Biossegurança: uma abordagem multidisciplinar. 2. Ed. Rio de 
Janeiro: Editora FIOCRUZ, 2010. 
14 
2. O laboratório de Microbiologia 
 
Introdução 
A Microbiologia é a ciência que estuda os microrganismos, abrangendo fatores 
relacionados ao seu funcionamento, diversidade, evolução e ecologia. Microrganismos 
habitam qualquer lugar do planeta capaz de fornecer suporte ao seu estabelecimento, o 
que inclui a água, o solo, animais e plantas, bem como estruturas criadas pelo homem e 
até mesmo ambientes considerados extremos. No corpo do ser humano, as células 
microbianas são mais numerosas do que as células do próprio corpo. 
Para manipulação dos microrganismos é de extrema relevância o uso correto de 
vidrarias e equipamentos, bem como conhecer a função de cada um deles. A seguir será 
apresentado as principais vidrarias e equipamentos mais utilizados no laboratório de 
microbiologia. 
 
Vidrarias e equipamentos 
 
 
Vidraria refere-se a uma grande variedade de equipamentos de laboratório que 
tradicionalmente são feitos de vidro, mas também podem ser plásticos. Em geral são 
utilizados em análises e experimentos científicos, principalmente nas áreas de química e 
biologia. Contudo o vidro ainda é muito utilizado devido a sua transparência, resistência 
ao calor e por ser praticamente um material inerte. 
 
 
 
 
Espátula: retirada de porções de 
reagentes sólidos. 
Tubo de ensaio: testes de reações, 
armazenamento de soluções. 
 
 
 
Béquer: transferência de líquidos, 
aquecimento de líquidos. 
Proveta: medida de volumes de 
líquidos. 
15 
 
 
Bastão de vidro: agitar/homogeneizar 
soluções. 
Pipeta graduada: medida de volumes 
líquidos. 
 
 
 
 
Funil de vidro: transferência de líquidos 
e filtrações. 
Erlenmeyer: preparo de soluções 
 
 
 
 
Balão volumétrico: preparo de 
soluções. 
Pinça de madeira: segurar tubos de 
ensaio ou lâminas durante aquecimentos 
diretos no bico de Bunsen. 
 
 
 
 
Bico de Bunsen: aquecimento em 
laboratório. 
Tripé: usado para sustentar a tela de 
amianto. 
16 
 
 
Pisseta: lavagens, remoção de 
precipitados e outros fins. 
Placa de Petri: culturas de 
microrganismos. 
 
 
Lâmina: acondiciona o material a ser 
examinado no microscópio. 
Lamínula: protege a objetiva do 
microscópio do material da lâmina. 
 
 
 
 
Pipeta de Pasteur: transferência de 
líquidos. 
 
Swab: coletar amostras. 
 
 
 
 
Tela de amianto: aquecimento. 
Alça de inoculação: ou alça de platina 
ou alça bacteriológica, inoculação de 
microrganismos. 
 
 
Meio de cultura: cultivar 
microrganismos. 
17 
 
 
Balão de fundo chato: preparo de 
soluções. 
 
Balão de fundo redondo: preparo de 
soluções. Kitassato: filtrações a vácuo. 
 
 
 
 
Capela de fluxo laminar: protege os 
produtos a serem manipulados. 
Capela de exaustão: manipulação de 
produtosquímicos, tóxicos, vapores 
agressivos. 
 
 
Autoclave: esterilizar materiais. Estufa bacteriológica: fornece 
ambiente controlado para cultura de 
microrganismos. 
 
 
 
 
 
Estante para tubos de ensaio 
18 
 
 
Estufa de secagem: secagem e 
esterilização de materiais. 
 
*Imagens retiradas do material: Guia para utilização de laboratórios químicos e 
biológicos. UNESP 
Exercícios de fixação 
 
1. Qual das vidrarias citadas abaixo apresenta maior precisão na medida de líquidos? 
a) Proveta 
b) Béquer 
c) Erlenmeyer 
 
2. Julgue o item a seguir como certo ou errado: 
Para dissolver substâncias sólidas em laboratório, deve-se utilizar o béquer, que, devido 
a seu formato afunilado, permite preservar o volume das substâncias no seu interior ao 
agitá-las, sem derramá-las. 
 
3. Como é denominado o equipamento utilizado durante o aquecimento de soluções 
para distribuir uniformemente o calor recebido pelo bico de Bunsen? 
 
4. Quais vidrarias podem ser utilizadas para armazenamento de meios de cultura 
bacteriológica. 
 
5. Um professor de bromatologia solicitou ao Assistente de Laboratório que 
preparasse a bancada com vidrarias volumétricas para aula prática sobre preparo 
de soluções. Assinale a alternativa que apresenta apenas as vidrarias volumétricas 
de precisão. 
 
a) Béquer, Erlenmeyer, pipeta volumétrica. 
b) Bureta, pipeta volumétrica, tubo de ensaio. 
c) Béquer, proveta, funil. 
d) Bureta, proveta, balão volumétrico. 
 
 
Referências Bibliográficas 
19 
Gavetti SMVC. Guia para utilização de laboratórios químicos e biológicos. UNESP, 
2013. 
Carvalho IT. Microbiologia Básica. Recife: EDUFRPE, 2010. 
20 
3. Lavagem das mãos 
 
Introdução 
 
As mãos constituem um dos elos mais importantes na cadeia de infecção cruzada. 
A quantidade de microrganismos constituintes da microbiota normal da pele do 
profissional de saúde deve ser reduzida, assim como possíveis microrganismos 
patogênicos devem ser eliminados. 
Em pesquisas bacteriológicas cuidadosas e verificou-se a eficiência do método de 
antissepsia das mãos geralmente usado pelos cirurgiões e outros profissionais de saúde. 
Considerada como a medida de biossegurança mais importante, a lavagem das mãos não 
diminui ou evita não só a transmissão de microrganismos do profissional para o paciente 
que está sendo diretamente assistido, como também é responsável pela redução da 
ocorrência de infecções em todo ambiente do serviço de saúde, seja ele primário, 
secundário ou terciário. 
A lavagem das mãos deve ser um hábito entre todos os profissionais de saúde e a 
adesão a esta prática é um desafio para a equipe de controle de infecção de cada hospital. 
A higienização básica das mãos com água e sabão visa remover a maioria dos 
microrganismos da microbiota transitória, células descamativas, suor, sujidade, 
oleosidades e outros fluidos, prevenindo assim o aumento dos índices de infecções 
transmitidas por contato manual direto entre pacientes no ambiente hospitalar. 
Antissepsia é o processo de eliminação ou inibição do crescimento dos 
microrganismos na pele ou em outros tecidos vivos. É realizada através de antissépticos. 
Os agentes antissépticos são usados para reduzir o número de microrganismos na 
superfície da pele. Esses compostos são selecionados em relação à sua segurança e 
eficiência. 
Os alcóois não são tóxicos e têm uma excelente atividade contra todos os grupos 
de microrganismo, exceto contra esporos. Ele também não tem atividade residual e são 
inativados pela matéria orgânica. Assim, a superfície da pele deve ser limpa antes de o 
álcool ser aplicado. 
O Álcool etílico ou etanol é o mais utilizado, tanto com antisséptico quanto como 
desinfetante. A concentração ideal é de 70%. Age rapidamente sobre bactérias vegetativas 
(inclusive micobactérias), vírus e fungos, mas não é esporicida. Por isso não se recomenda 
para esterilização, apenas para desinfecção de superfícies e antissepsia de pele. Atua por 
meio do rompimento de membranas, com rápida desnaturação de proteínas e consequente 
lise celular. A utilização de álcool para higiene de mãos também apresenta um menor 
custo. Quando comparadas formulações de álcool gel versus líquido, a última apresenta 
melhores resultados na descontaminação das mãos, mas a adesão ao uso é maior com a 
primeira. 
Os iodóforos também são excelentes antissépticos cutâneos, tendo uma faixa de 
atividade semelhante à dos álcoois. Eles são ligeiramente mais tóxicos para a pele do que 
o álcool e possuem limitada atividade residual e são inativados pela matéria orgânica. O 
iodo é um elemento altamente reativo que precipita proteínas e oxida enzimas essenciais. 
É microbicida contra praticamente todos os organismos, incluindo bactérias formadoras 
de esporos e microbactérias. 
Iodopovidona é combinação de 10% de iodopovidona e 1% de iodo livre. O 
polímero aumenta a solubilidade do iodo, promove sua liberação gradativa, aumenta a 
ação residual e reduz a irritação cutânea21. Iodopovidona pode ser encontrado em 
formulações aquosas, alcoólicas e degermante. 
Surfactantes (sabões e compostos quaternários de amônia) 
 
1. São compostos químicos que diminuem a tensão superficial de uma solução 
aquosa, classificados principalmente como sabões (surfactantes aniônicos) e 
detergentes (surfactantes catiônicos). 
2. A potência antibacteriana dos sabões e detergentes pode aumentar pela inclusão 
de antissépticos como o iodeto de potássio e o hexaclorofeno. 
3. São usados como agentes umedecedores, sabões, detergentes e emulsificantes. 
4. Os surfactantes aniônicos têm fraca ação contra bactérias gram-negativas e 
acidorresistentes. 
 
O sabão tem pouco valor como antisséptico, mas tem uma função importante na 
remoção mecânica dos microrganismos através da esfregação. Nesse sentido, os sabões 
são bons agentes degermantes. 
Gliconato de Clorexidina é antisséptico que age por rompimento de 
membranas citoplasmáticas, precipitando conteúdos celulares. Tem melhor atividade 
contra bactérias gram-positivas, menor atividade contra bactérias gram-negativas e 
fungos e mínima atividade contra o bacilo da tuberculose. Não é esporicida. Apresenta 
excelente ação residual, especialmente em adição com álcool. Usa-se em lavagem de 
mãos e antissepsia bucal. Encontram-se formulações aquosas, alcoólicas ou degermantes. 
Comparações entre clorexidina e iodopovidona (PVPI) geralmente demonstram 
superioridade do primeiro antisséptico. 
21 
22 
Para desinfecção em procedimentos mais demorados, especialmente 
cirúrgicos, deve-se optar por iopovidona 10% (solução alcoólica ou solução aquosa) ou 
clorexidina (alcoólica ou aquosa), que apresentam maior ação residual. 
 
 
Clorexidina 
1. A clorexidina é um composto catiônico sintético com melhor atividade contra 
micro-organismos gram-positivos do que contra gram-negativos. Tem ação 
fungicida variável e não atua bem contra vírus e esporos. 
2. A clorexidina está disponível em base de detergente como solução a 4% ou como 
espuma liquida a 2%. 
3. É amplamente usada como antisséptico pré-cirúrgico, irritação de feridas e 
imersão de tetas. 
4. Seu efeito é cumulativo, sendo recomendadas aplicações repetidas. Seu efeito 
depende da concentração. 
5. A sua ação se dá por precipitação de componentes da célula bacteriana. 
6. A clorexidina é incompatível com cloretos, sulfatos, fosfatos, carbonatos e nitratos 
inorgânicos, que reduzem sua atividade por precipitá-la. 
7. Usada para higienização oral em cães. 
 
 
 
A pele das mãos contém microrganismos considerados transitórios e permanentes, 
ou seja, microbiota transitória (possui meia-vida curta, e é responsável pela maioria 
das infecções hospitalares ou infecções em assistência em saúde) e microbiota 
residente (difícil remoção mecânica). A microbiota transitória pode ser eliminada 
com água e sabão, por 15 a 30 segundos. Já a residente pode ser eliminada com a 
utilização dedegermante antisséptico. É necessário destacar, todavia, que a 
eficiência dessa conduta está relacionada à correta aplicação de sua técnica e à 
frequência das ações recomendadas. 
23 
 
A técnica de lavagem simples das mãos envolve os seguintes passos: 
Duração do procedimento: 40 a 60 segundos. 
 
http://www2.ebserh.gov.br/documents/220250/1649711/POP+HIGIENIZA%C3%8 
7%C3%83O+DAS+M%C3%83OS+EBSERH.pdf/594de73c-0eb6-4ffb-968a- 
2875de13eae8 
 
Apesar de se um hábito bastante básico, higienizar as mãos ainda costuma ser 
ignorada no dia a dia, tanto por pessoas comuns como por profissionais de saúde e 
colocá-la em prática ainda é um desafio. A prática é tão importante que foi adotada 
pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como uma bandeira de combate à 
infecção hospitalar. 
 
No dia a dia, a lavagem de mãos previne, por exemplo, uma diarreia que muitas 
vezes é causada por falta de higiene na hora de tocar os alimentos, especialmente 
após ir ao banheiro. Por isso, lavar as mãos de forma adequada durante o preparo das 
refeições e antes de se alimentar é considerado um requisito básico de higiene. 
 
Higiene previne infecção no hospital 
http://www2.ebserh.gov.br/documents/220250/1649711/POP%2BHIGIENIZA%C3%87%C3%83O%2BDAS%2BM%C3%83OS%2BEBSERH.pdf/594de73c-0eb6-4ffb-968a-2875de13eae8
http://www2.ebserh.gov.br/documents/220250/1649711/POP%2BHIGIENIZA%C3%87%C3%83O%2BDAS%2BM%C3%83OS%2BEBSERH.pdf/594de73c-0eb6-4ffb-968a-2875de13eae8
http://www2.ebserh.gov.br/documents/220250/1649711/POP%2BHIGIENIZA%C3%87%C3%83O%2BDAS%2BM%C3%83OS%2BEBSERH.pdf/594de73c-0eb6-4ffb-968a-2875de13eae8
http://portal.anvisa.gov.br/documents/219201/0/cartaz%2Blavagem%2Bdas%2Bmãos/7fe4aded-7f47-455b-997d-a013ddb473b8
24 
A falta de cuidado afeta também os profissionais de saúde com resultados mais 
preocupantes. Em um único dia, cada profissional de saúde interage com dezenas e até 
centenas de pacientes. É nesses momentos que a mão do profissional pode se transformar 
em um veículo condutor de doenças. 
Atualmente, programas que enfocam a Segurança do Paciente nos serviços de 
saúde tratam como prioridade o tema da higiene das mãos. 
No caso de hospitais e clínicas, para que a lavagem correta das mãos seja adotada de 
forma efetiva é preciso que a gestão do serviço de saúde se envolva diretamente com o 
processo e faça as adequações necessárias. Isso envolve ter pias em locais estratégicos do 
serviço de saúde, adquirir sabonetes e antissépticos adequados, disponibilizar álcool gel 
e manter uma campanha constante junto aos profissionais. 
 
5 momentos para higienizar as mãos em serviços de saúde 
1. Antes de tocar o paciente 
2. Antes de realizar procedimento limpo 
3. Após exposição a fluidos corporais 
4. Depois que tocar o paciente 
5. Sempre depois que tocar superfícies próximas ao paciente 
 
 
Materiais 
 
 
Tubos contendo Ágar nutriente liquefeito esterilizado 
Placas de Petri esterilizadas 
Gazes esterilizadas 
Pisseta com sabão 
Pisseta com álcool a 70% 
Pisseta com povidine-iodo ou Pisseta com Clorexidina 
 
 
 
Procedimento 
• Mãos sujas: 
Lavar as mãos só com água destilada, enxugar com a gaze e espremer sobre a placa de 
Petri. Verter o Ágar nutriente liquefeito sobre a placa. Homogeneizar a placa com o meio 
25 
e colocar o nome do aluno. Aguardar a solidificação do meio e incubá-lo na estufa a 37°C 
por 24h. 
• Mãos lavadas com água e sabão: 
Lavar as mãos com água e detergente de acordo com a técnica, enxugar com a gaze e 
espremer sobre a placa. Verter o ágar nutriente liquefeito sobre a placa. Homogeneizar a 
placa com o meio e identificá-la. Aguardar a solidificação do meio e incubá-lo na estufa 
a 37°C por 24h. 
• Mãos lavadas com água e sabão + antisséptico por 1 minuto: 
Após lavar as mãos com água e sabão, aplicar o antisséptico (Povidine) ou Clorexidine 
por um minuto e enxaguar levemente com água. Enxugar com a gaze e espremer sobre a 
placa. Verter o ágar nutriente liquefeito sobre a placa. Homogeneizar a placa com o meio 
e identificá-la. Aguardar a solidificação do meio e incubá-lo na estufa a 37°C por 24h. 
Resultado 
 
 
 
Exercícios de fixação 
 
1- Diferencie desinfecção e esterilização? 
2– Pesquise sobre as práticas de esterilização e/ou desinfecção empregadas nos 
laboratórios, na indústria farmacêutica e em hospitais e faça uma argumentação sobre o 
tema. 
 
 
 
Referências Bibliográficas 
26 
KONKEWICZ, L. R. Controle de infecção em odontologia: antissépticos e desinfetantes. 
In: WANNMACHER, L.; FERREIRA, M. B.C. (Ed.). Farmacologia clínica para 
dentistas. 3. ed. Rio de janeiro: Guanabara Koogan, 2007. p. 333-350. 
 
JORGE, A. O. C. Microbiologia- atividades práticas. 2. ed. São Paulo: Santos, 2011. 
 
MURRAY, P. R. et al. Microbiologia médica. 8. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan 2017. 
WORLD HEALTH ORGANIZATION. WHO Guidelines on Hand Hygiene in Health 
Care. Geneva: WHO, 2009. 
http://portal.anvisa.gov.br/documents/33852/271858/NOTA+T%C3%89CNICA+N%C 
2%BA01-2018+GVIMS-GGTES-ANVISA/ef1b8e18-a36f-41ae-84c9-53860bc2513f 
 
http://portal.anvisa.gov.br/documents/33852/271858/NOTA+T%C3%89CNICA+N%C 
2%BA01-2018+GVIMS-GGTES-ANVISA/ef1b8e18-a36f-41ae-84c9-53860bc2513f 
 
http://www.fiocruz.br/biosseguranca/Bis/virtual%20tour/hipertextos/up1/lavagem_de_ 
maos.html 
http://portal.anvisa.gov.br/documents/33852/271858/NOTA%2BTÉCNICA%2BNº01-2018%2BGVIMS-GGTES-ANVISA/ef1b8e18-a36f-41ae-84c9-53860bc2513f
http://portal.anvisa.gov.br/documents/33852/271858/NOTA%2BTÉCNICA%2BNº01-2018%2BGVIMS-GGTES-ANVISA/ef1b8e18-a36f-41ae-84c9-53860bc2513f
http://portal.anvisa.gov.br/documents/33852/271858/NOTA%2BTÉCNICA%2BNº01-2018%2BGVIMS-GGTES-ANVISA/ef1b8e18-a36f-41ae-84c9-53860bc2513f
http://portal.anvisa.gov.br/documents/33852/271858/NOTA%2BTÉCNICA%2BNº01-2018%2BGVIMS-GGTES-ANVISA/ef1b8e18-a36f-41ae-84c9-53860bc2513f
http://www.fiocruz.br/biosseguranca/Bis/virtual%20tour/hipertextos/up1/lavagem_de_
27 
4. Presença de microrganismos no ambiente e técnicas de semeadura 
 
Introdução 
Os microrganismos são encontrados em toda parte. A população microbiana do ar 
não tem traços de especificidade. Ela é composta de espécies presentes nos ecossistemas 
terrestre e aquáticos trazidos para atmosfera junto com a poeira ou em gotas de água 
formadas durante a evaporação. O ar acima das áreas habitadas pode conter 
microrganismos patogênicos disseminados pela tosse ou presente em utensílios e 
excrementos do homem e animais. O tempo de sobrevivência dos microrganismos no ar 
depende de suas características e das condições ambientais. Os esporos são relativamente 
resistentes, enquanto as células vegetativas são eliminadas mais rapidamente. A 
irradiação solar, temperatura e precipitações são fatores ambientais que controlam a 
população microbiana no ar. 
Os microrganismos são passíveis de entrar no organismo do indivíduo cada vez 
que o mesmo respira. A poeira deposita-se nos cabelos, nas roupas, na pele e nas mucosas. 
Do ar passam para o alimento e para a bebida. Mas a maioria deles é inofensivo. 
 
Material 
Placas de Petri contendo Ágar Nutriente 
Swab 
Solução salina esterilizada 
 
 
Procedimento I: presença de micro-organismos no ambiente 
 
 
Coletar em diversas superfícies em diversos locais. Por exemplo: bebedouro, 
orelhão, corrimão, descarga e etc. Para a detecção de microrganismos presentes no meio 
ambiente, será distribuída para cada grupo com 1 placa de Petri contendo meio de cultura 
rico, solidificado, previamente esterilizado. Semeadas amostras de locais distintos 
utilizando swab umidificado em solução salina, à escolha (Ex: maçaneta da porta, sola de 
sapato, notas de dinheiro e etc). 
Alguns grupos poderão deixar as placas abertas durante a aula, para que se 
depositem microrganismos em suspensão no ar. Ao final da aula, as placas serão 
incubadas a 37ºC até a próxima aula, para permitir o crescimento dos possíveis 
microrganismos, o que irá originarcolônias visíveis a olho nu. As placas devem ser 
28 
incubadas invertidas para evitar que o meio desidrate e que a água de condensação caia 
sobre a superfície do meio. Após o período de incubação, anotar a presença e a 
diversidade morfológica das colônias microbianas que cresceram sobre a superfície do 
ágar. 
 
Procedimento II: Técnicas de semeadura 
• Meio líquido 
• Semeadura por esgotamento 
• Semeadura semi-quantitativa 
• Semeadura da placa de Petri em pour plate 
 
 
 
 
 
 
http://aneste.org/adriane-moro-mendes-professora-de-microbiologia-camila- 
carvalh.html 
 
Exercícios de fixação 
 
1) O que se entende por semeadura por esgotamento? Qual sua finalidade? 
2) O que se entende por “colônia” de microrganismos? 
3) Como pode ser obtida uma cultura pura de bactérias? 
 
Referências bibliográficas 
http://aneste.org/adriane-moro-mendes-professora-de-microbiologia-camila-carvalh.html
http://aneste.org/adriane-moro-mendes-professora-de-microbiologia-camila-carvalh.html
29 
http://aneste.org/adriane-moro-mendes-professora-de-microbiologia-camila- 
carvalh.html 
http://aneste.org/adriane-moro-mendes-professora-de-microbiologia-camila-carvalh.html
http://aneste.org/adriane-moro-mendes-professora-de-microbiologia-camila-carvalh.html
30 
5. Técnicas de coloração simples 
 
 
Introdução 
 
Como a maioria dos microrganismos aparece quase incolor quando observada 
através de um microscópio óptico padrão, muitas vezes devemos prepará-los para 
observação. Umas das formas pelas quais isso pode ser é através da coloração da amostra. 
A maioria das observações iniciais dos microrganismos é feita por meio de preparações 
coradas. Coloração significa simplesmente corar os microrganismos com um corante que 
enfatize certas estruturas. Porém, antes que os microrganismos possam ser corados,
 devem ser fixados (aderidos) à lâmina do microscópio. A fixação 
simultaneamente mata os microrganismos e os fixa na lâmina. Ela também preserva várias 
partes dos microrganismos em seu estado natural com apenas um mínimo de distorção. 
Os corantes são sais compostos por um íon positivo e um íon negativo, um dos 
quais é colorido e conhecido como cromóforo. A cor dos assim chamados corantes 
básicos está o íon positivo, em corantes ácidos está o íon negativo. As bactérias são 
levemente carregadas negativamente em pH 7. Desse modo, o íon positivo colorido em 
um corante básico é aderido à célula bacteriana carregada negativamente. Os corantes 
básicos, que incluem o cristal violeta, o azul de metileno, o verde de malaquita e a 
Safranina, são mais comumente usados que os corantes ácidos. Os corantes ácidos não 
são atraídos pela maioria dos tipos de bactérias porque os íons negativos do corante são 
repelidos pela superfície bacteriana carregada negativamente, assim a coloração cora o 
fundo, tal coloração é denominada coloração negativa. Exemplos de corantes ácidos são 
a eosina, a fucsina ácida e a nigrosina. 
Para aplicar corantes ácidos e básicos, os microbiologistas utilizam três tipos de 
técnicas de coloração: simples, diferencial (coloração de Gram e coloração álcool-ácido- 
resistente) e especial (coloração negativa de cápsulas, coloração para endósporos e 
coloração dos flagelos). 
Uma coloração simples é uma solução aquosa ou alcóolica de um único corante 
básico. Embora diferentes corantes se liguem especificamente a diferentes partes das 
células, o objetivo primário de uma coloração simples é destacar todo o microrganismo, 
para que as formas celulares e as estruturas básicas fiquem visíveis. 
 
Materiais 
31 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
https://edisciplinas.usp.br/ 
pluginfile.php/3136054/mo 
d_resource/content/1/Prati 
ca 
Cultura de bactérias 
Cristal violeta 
Azul de metileno 
Solução fisiológica (salina) estéril 
Lâminas para microscópio 
Lamínulas 
Pinça de madeira 
Alça bacteriológica 
Microscópio óptico 
Óleo de imersão 
Bico de Bunsen 
Suporte para lâminas 
Recipiente para descarte 
 
 
Procedimento 
 
 
Preparação de amostras 
 
1. Esfregaço e fixação 
 
Quando uma amostra precisa ser fixada, um filme delgado de material contendo 
os microrganismos é espalhado sobre a superfície da lâmina. Esse filme, denominado 
esfregaço, é deixado secar ao ar. Para o preparo do esfregaço deve-se colocar uma gota 
(ou colônia) de cada uma das culturas bacterianas sobre uma lâmina, misturar gentilmente 
com o auxílio da alça bacteriológica. 
Na maioria dos procedimentos de coloração, a lâmina é então fixada pela 
passagem (2 ou 3 vezes) sobre a chama de um bico de Bunsen, com o lado do esfregaço 
para cima. 
 
https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/3136054/mod_resource/content/1/Pratica%203%20-%20Bacterias%20-%20Colora%C3%A7%C3%A3o%20de%20Gram%20-%20negativa%20-%20positiva%20-%20Motilidade%202017.pdf
https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/3136054/mod_resource/content/1/Pratica%203%20-%20Bacterias%20-%20Colora%C3%A7%C3%A3o%20de%20Gram%20-%20negativa%20-%20positiva%20-%20Motilidade%202017.pdf
https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/3136054/mod_resource/content/1/Pratica%203%20-%20Bacterias%20-%20Colora%C3%A7%C3%A3o%20de%20Gram%20-%20negativa%20-%20positiva%20-%20Motilidade%202017.pdf
https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/3136054/mod_resource/content/1/Pratica%203%20-%20Bacterias%20-%20Colora%C3%A7%C3%A3o%20de%20Gram%20-%20negativa%20-%20positiva%20-%20Motilidade%202017.pdf
32 
Obs.: Se o esfregaço for feito a partir de um meio sólido deve usar solução salina para 
espalhamento do microrganismo. 
 
2. Coloração simples 
 
Deve-se aplicar o corante (cristal violeta ou azul de metileno) ao esfregaço fixo e 
aguardar 1 minuto e em seguida lavar a lâmina, secá-la e examiná-la ao microscópio 
na objetiva de 100X. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
http://www.vidrariadelaboratorio 
.com.br/coloracao-de-gram- 
passo-passo/ 
 
Exercícios de fixação 
1. Qual a importância de se realizar a coloração das bactérias? 
 
2. Explique por que é necessário a realização da etapa de fixação. 
 
3. Qual diferença existe no preparo de um esfregaço com material líquido e com 
material sólido? 
 
4. Esquematize o que foi visto ao microscópio. 
 
http://www.vidrariadelaboratorio.com.br/coloracao-de-gram-passo-passo/
http://www.vidrariadelaboratorio.com.br/coloracao-de-gram-passo-passo/
http://www.vidrariadelaboratorio.com.br/coloracao-de-gram-passo-passo/
33 
Elaborado pela Profª Aline Rodrigues 
 
 
Referências bibliográficas 
Tortora GJ, Funke BR, Case CL. Microbiologia. 10 ed. Porto Alegre: Artmed, 2012. 
34 
6. Coloração de Gram 
 
Introdução 
Ao contrário das colorações simples, as colorações diferenciais reagem de modo 
distinto com diferentes tipos de bactérias, podendo assim ser usadas para diferenciá- 
las. As colorações diferenciais mais frequentemente utilizadas para bactérias são a 
coloração de Gram e a coloração álcool-ácido resistente. 
A coloração de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista dinamarquês 
Hans Christian Gram. Ela é um dos procedimentos de coloração mais uteis, pois 
classifica as bactérias em dois grandes grupos: gram-positivas e gram-negativas. 
Os diferentes tipos de bactérias reagem de modo distinto à coloração de Gram, 
pois diferenças estruturais em suas paredes celulares afetam a retenção ou a liberação 
de uma combinação de cristal violeta e iodo, denominada complexo cristal violeta- 
iodo (CV-I). Entre outras diferenças, as bactérias gram-positivas possuem uma parede 
celular de peptideoglicano mais espessa (dissacarídeos e aminoácidos) que as 
bactérias gram-negativas. Além disso, as bactérias gram-negativas contêm uma 
camada de lipopolissacarídeo (lipídeos e polissacarídeos) como parte de sua parede 
celular. 
Quando aplicados a células gram-positivas e gram-negativas, o cristal violeta e o 
iodo penetram facilmente nas células. Dentro das mesmas, o cristal violeta e o iodo 
se combinam para formar o CV-I.As células gram-positivas retêm o corante e 
permanecem com a cor púrpura (roxa) e as gram-negativas não retêm o corante, elas 
ficam incolores até serem contracoradas com o corante fucsina ou safranina 
adquirindo a cor rosa. 
A reação de Gram de uma bactéria pode fornecer informações valiosas para o 
tratamento da doença. As bactérias gram-positivas tendem a ser mortas mais 
facilmente por penicilinas e cefalosporinas. As bactérias gram-negativas geralmente 
são mais resistentes porque os antibióticos não podem penetrar a camada de 
lipopolissacarídeo. 
 
Materiais 
 
 
Cultura de bactérias 
Solução fisiológica (salina) estéril 
35 
Bateria de reagentes para coloração de Gram (cristal violeta, lugol, solução descorante 
e fucsina/Safranina) 
Lâminas para microscópio 
Alça bacteriológica 
Microscópio óptico 
Óleo de imersão 
Papel absorvente 
Pisseta com água destilada 
 
 
Procedimento 
 
1. Recobrir o esfregaço com o cristal violeta e após 1 minuto o corante deve ser 
lavado. 
2. Cobrir o esfregaço com iodo (lugol) e após 1 minuto lavá-lo. 
3. A seguir, a lâmina deve ser lavada com solução descorante aguardando 30 
segundos. 
4. Lavar a solução descorante e corar a lâmina com fucsina/Safranina deixando por 
30 segundos. 
5. Lavar novamente o esfregaço, secá-lo com papel e examinar ao microscópio. 
 
 
 
https://kasvi.com.br/bacteria-gram-positiva-gram-negativa/ 
 
 
Exercícios de fixação 
 
1. Qual o objetivo do uso de um descorante na coloração de Gram? 
https://kasvi.com.br/bacteria-gram-positiva-gram-negativa/
36 
 
2. Preencha a seguinte tabela sobre a coloração de Gram: 
 
 
 Aparência ap ós esta etapa 
Etapas Células gram-positivas Células gram-negativas 
Cristal violeta 
Lugol 
Solução descorante 
Fucsina/safranina 
 
 
3. Durante a coloração de Gram, uma etapa pode ser omitida e ainda assim permitir 
a diferenciação entre células gram-positivas e gram-negativas. Que etapa é essa? 
4. Esquematize o que foi observado ao microscópio: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Referências bibliográficas 
Tortora GJ, Funke BR, Case CL. Microbiologia. 10 ed. Porto Alegre: Artmed, 2012. 
Padilla G. Apostila de aulas práticas. Universidade de São Paulo. São Paulo, 2017. 
37 
7. Técnica de Coloração de Ziehl Neelsen 
 
Introdução 
A coloração de Ziehl-Neelsen baseia-se na capacidade de algumas bactérias 
(micobactérias e actinomicetos) resistirem aos métodos comuns de coloração devido à 
composição altamente lipídica da parede celular. Após um processo de coloração 
especial, a quente, uma vez coradas, não sofrem ação de descorantes fortes, como a 
solução de álcool-ácido. Desta forma, a fucsina de Ziehl cora todas as bactérias de 
vermelho, e após a descoloração com álcool-ácido, somente os bacilos álcool-ácido 
resistentes (B.A.A.R.) conservarão esta cor. Para facilitar a visualização cora-se o fundo 
com azul de metileno, estabelecendo-se um contraste nítido entre elementos celulares e 
outras bactérias (azuis) e os B.A.A.R (vermelhos). 
A parede celular das micobactérias, consiste de um complexo (mAGP) 
mycolylarabinogalactan-peptidoglycan. A parede é responsável pela resistência inata aos 
antibióticos e desempenha um papel importante, para a sua virulência e viabilidade. 
Possui em sua constituição química diversos lipídeos, entre eles os ácidos micólicos (AM) 
que são responsáveis pela morfologia do bacilo e utilizados em testes de identificação das 
espécies e subspécies de micobactérias. É também na parede que se encontra o composto 
6-6’ dimicolato de trealose responsável pela película que M. tuberculosis forma em meio 
de cultivo líquido e pelo aspecto de corda do crescimento bacilar em esfregaços. A 
estrutura do fator de corda (FC) foi completamente esclarecida por Noll et al em 1956. 
 
 
Representação esquemática da parede celular de Mycobacterium. CM: Membrana 
Citoplasmática, PG: Peptidioglicano, AG: AG: arabinogalactana, MA: acidos micólicos. 
38 
Adaptado de Wu & Zhou (2009). Fonte: 
https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/14737/3/mariana_santos_ioc_mest_2015.pdf 
 
Materiais 
Palito de picolé 
Lâminas limpas e desengorduradas 
Kit para coloração de Ziehl Neelsen 
Bandeja inox 
Palitos de madeira 
Recipiente com tampa para descarte dos palitos 
Papel toalha 
Bico de bunsen 
 
 
Procedimento 
Tipos de amostras: 
Amostra de escarro: Provém da árvore brônquica, obtida após o esforço de tosse. 
Espécime clínico de escolha para diagnóstico de tuberculose pulmonar. Deve ser colhido 
sempre que possível antes do início da antibioticoterapia. 
• Colhida, preferencialmente, pela manhã (antes de refeição e após higiene oral). lavado 
bronquioalveolar ou lavado gástrico (< sensibilidade). 
OBS: Crianças e pacientes que não conseguem expectorar ou que engolem o escarro: 
realizar coleta com swab laríngeo (utilizado para pesquisa microscópica de BAAR (bacilo 
álcool-ácido resistente) e isolamento em cultura. 
• Pacientes com dificuldade de expectoração: induzir escarro com inalação com solução 
salina hipertônica - 5 a 15 min. 
Urina: 1ª micção (mínimo 3 e máximo 6 amostras em dias consecutivos. 
Líquido cefalorraquidiano, pleural, ascítico e outros: colhidos em tubo estéril (liquor: 
> 5 mL) 
Fragmentos de tecidos e fluidos de punção: biópsia (H2O destilada ou salina estéril). 
Punção – diluir em H2O ou salina fisiológica)transferir para frasco ou tubo estéril 
(purulentas ou viscosas 
https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/14737/3/mariana_santos_ioc_mest_2015.pdf
39 
 
 
 
 
 
 
Frasco utilizado na coleta da amostra: 
Fonte:https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22142/mod_resource/content/1/ 
manualTubercurlose.pdf 
 
Aspectos que podem ser observados nas amostras de escarro 
 
 
Fonte:https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22142/mod_resource/content/1/ 
manualTubercurlose.pdf 
 
Formas de preparo da amostra: 
Exame direto: Por ser um material clínico mais utilizado no diagnóstico da tuberculose 
pulmonar, descreveremos a seguir a preparação do esfregaço para o exame microscópico 
do escarro: 
1- Após a preparação do local de trabalho identificar os potes de escarro no corpo 
dos mesmos. A numeração da lâmina pode ser feita com fita crepe; 
https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22142/mod_resource/content/1/manualTubercurlose.pdf
https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22142/mod_resource/content/1/manualTubercurlose.pdf
https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22142/mod_resource/content/1/manualTubercurlose.pdf
https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22142/mod_resource/content/1/manualTubercurlose.pdf
40 
2- Colocar as amostras em ordem crescente e as respectivas lâminas em frente de 
cada pote. Essas devem ser novas e desengorduradas por imersão em solução 
álcool. 
3- Numerá-las do lado oposto do esfregaço. Fazer uma linha divisória que 
corresponda a 1/3da lâmina, sendo o restante destinado ao esfregaço. Deve-se ter 
cuidado para não tocar os dedos na parte destinada ao esfregaço; 
4- Abrir somente o pote da amostra que se vai fazer o esfregaço; 
5- Com o aplicador de madeira partido em dois e utilizando o lado das pontas 
farpadas, escolher a partícula mais densa ou purulenta do escarro ou uma mistura 
da amostra, quando só existirem pequenas partículas purulentas ou mucosas; 
6- Colocada a partícula próxima á linha divisória, estender com o mesmo aplicador 
até o extremo oposto. Evitar os espaços vazios. Desprezar o excesso no próprio 
frasco da amostra. 
7- Não se deve aquecer a lâmina enquanto o esfregaço estiver sendo preparado, pois 
ocorre a formação de círculos e precipitados com o calor, prejudicando com isso 
os resultados da leitura, além do que projeta aerossóis. 
8- Ao término do esfregaço, desprezar o aplicador de madeira no recipiente para 
autoclavação ou incineração e colocar o pote bem fechado na geladeira para ser 
guardadoaté a saída dos resultados; 
9- Evitar confeccionar esfregaço com alça metálica, pois há grande formação de 
aerossóis durante a flambagem no bico de bunsen; 
10- Colocar as lâminas sobre a estante para secagem natural (sem aquecimentos); 
11- Após a secagem fixar três vezes ao fogo rapidamente, mantendo o esfregaço na 
parte superior da lâmina; 
12- Nunca deixe lâminas sem fixar, após a realização do esfregaço, mesmo que se vá 
corá-las no dia seguinte, por exemplo. Desta forma não se perde o material da 
lâmina; 
As lâminas fixadas podem conter bacilos viáveis. O ideal é que se core logo depois de 
confeccionado o esfregaço. Se for armazenar embrulhe as lâminas no papel alumínio e 
coloque na geladeira. 
Exemplo de retirada da partícula da amostra de escarro e colocação na lâmina. 
41 
 
Fonte:https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22142/mod_resource/content/1/ 
manualTubercurlose.pdf 
 
 
 
Distensão da amostra 
Fonte:https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22142/mod_resource/content/1/ 
manualTubercurlose.pdf 
 
Fixação do Esfregaço 
Fonte:https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22142/mod_resource/content/1/ 
manualTubercurlose.pdf 
 
Esfregaço concluído 
https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22142/mod_resource/content/1/manualTubercurlose.pdf
https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22142/mod_resource/content/1/manualTubercurlose.pdf
https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22142/mod_resource/content/1/manualTubercurlose.pdf
https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22142/mod_resource/content/1/manualTubercurlose.pdf
https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22142/mod_resource/content/1/manualTubercurlose.pdf
https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22142/mod_resource/content/1/manualTubercurlose.pdf
42 
 
Fonte:https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22142/mod_resource/content/1/ 
manualTubercurlose.pdf 
 
Técnica de concentração da amostra 
Para Concentrar (V/V) = hipoclorito a 5% + escarro (usar tubo de centrífuga de 50mL) 
Agitar em vórtex, deixar em TA por 15 minutos 
• Completar o volume de 50mL com água destilada ou deionizada• Centrifugar a 3.000 
rpm por 15 minutos 
• Desprezar sobrenadante e ressuspender sedimento com gotas de água destilada e estéril 
• Preparar o esfregaço 
Cuidados: * Volume das amostras: aproximadamente 2 a 5 mL e acondicionar em frascos 
plásticos transparentes com tampa de rosca. 
 
Fonte: OPAS/OMS – Anvisa/MS 
 
• Escolher pequena porção purulenta ou com sangue 
• Esfregaço: diretamente da amostra (sens.50%) ou após centrifugação (sens.70%) 
 
Métodos de Coloração 
Técnica de Ziehl Neelsen 
https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22142/mod_resource/content/1/manualTubercurlose.pdf
https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22142/mod_resource/content/1/manualTubercurlose.pdf
43 
 
 
Fonte: OPAS/OMS – Anvisa/MS 
 
 
Microscopia bacteriana / baciloscopia 
Vantagens e Limitações 
• Permite detectar a presença de BAAR - menos sensível que cultura para 
micobactérias. 
• Importante nos programas de controle da tuberculose, monitorar eficácia 
do tratamento e/ou confirmar a presença de BAAR pós-cultura. 
• Amostras não estéreis: descontaminação (escolher um dos métodos 
disponíveis). Em seguida realizar concentração da amostra por 
centrifugação. 
• Amostras estéreis (líquor, líquido pleural, sangue): realizar a concentração 
da amostra. 
• Escarro: método simples, rápido e econômico; 
• Sensibilidade varia de acordo com o nº de bacilos na amostra; 
• Estimar a carga bacilar e avaliar tratamento (paucibacilar e multibacilar); 
• Há 3 limitações: 1ºNegativa em amostras com < 5.000 bact/mL 
(extrapulmonar ou estágio inicial da TB pulmonar) 2º Não permite 
identificação da espécie; 3º Não permite ≠ bacilos viáveis e mortos 
Microscopia 
44 
Com a técnica de Ziehl Neelsen, as micobactérias apresentam-se como bastonetes 
delgados, ligeiramente curvos, isolados, aos pares ou em grupos, corados em vermelho 
com fundo azul e, portanto referidos como bacilos álcool ácido resistente (BAAR). A 
leitura deve ser feita no mínimo em cem campos microscópicos, o que corresponde, 
aproximadamente, á leitura de uma linha reta que vai do extremo onde estás a numeração 
até o extremo aposto, isso corresponde as mais ou menos 5 minutos de observação. 
Recomenda-se um intervalo de 10 minutos de descanso para cada dez lâminas lidas. Após 
a leitura, as lâminas que não forem enviadas para o controle de qualidade devem ser 
desprezadas num cemitério ou num frasco contendo hipoclorito de sódio a 1%. 
Recomenda-se utilizar um desenho quadriculado para ir anotando o número de bacilos 
encontrados em cada campo microscópico e o resultado deve ser informado em número 
de cruzes segundo a escala apresentada abaixo: 
Formas de apresentação dos BAAR na visualização microscópica. 
Fonte:https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22142/mod_resource/content/1/ 
manualTubercurlose.pdf 
 
Leitura e interpretação dos esfregaços 
Escala semi-quantitativa para informe do número de BAAR observados em 
esfregaços de escarro corados pelo método de Ziehl-Neelsen 
 
Fonte: OPAS/OMS – Anvisa/MS 
 
 
Exercícios de Fixação 
https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22142/mod_resource/content/1/manualTubercurlose.pdf
https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22142/mod_resource/content/1/manualTubercurlose.pdf
45 
1- Qual a principal utilização do método de coloração de Ziehl-Neelsen? 
2- Quais os reagentes utilizados no método de coloração de Ziehl-Neelsen? 
3- Indique as estruturas das micobactérias que explicam sua reação tintorial no 
método de coloração de Ziehl-Neelsen? 
4- Qual é a cor apresentada pelos BAAR na reação tintorial do método de coloração 
de Ziehl-Neelsen? 
5- O que são BAAR? 
6- Explique detalhadamente como deve ser realizado o esfregaço das amostras de 
escarro. 
7- Explique como deve ser a liberação do resultado de uma baciloscopia. 
 
Referências bibliográficas 
 
Brasil. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Manual de Microbiologia Clínica para 
o Controle de Infecção Relacionada à Assistência à Saúde. Módulo 6 : Detecção e 
identificação de bactérias de importância médica /Agência Nacional de Vigilância 
Sanitária.– Brasília: Anvisa, 2013. 
 
Brasil. Agência Nacional de Vigilância Sanitária Manual de Microbiologia Clínica para 
o Controle de Infecção Relacionada à Assistência à Saúde. Módulo7: Detecção e 
Identificação de Micobactérias de Importância Médica/Agência Nacional de Vigilância 
Sanitária.– Brasília: Anvisa, 2013. 47p..: il.9 volumes. 
 
TRABULSI, L. R. Microbiologia. 6. ed. Rio de Janeiro: Atheneu, 2015. 
 
MURRAY, P. R. et al. Microbiologia médica. 8. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan 2017. 
 
https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22142/mod_resource/content/1/manual 
Tubercurlose.pdf 
http://www.saude.mt.gov.br/upload/documento/81/manual-de-bacteriologia-da- 
tuberculose-%5B81-080909-SES-MT%5D.pdf 
 
https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/14737/3/mariana_santos_ioc_mest_2015.pdf 
https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22142/mod_resource/content/1/manualTubercurlose.pdf
https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22142/mod_resource/content/1/manualTubercurlose.pdf
http://www.saude.mt.gov.br/upload/documento/81/manual-de-bacteriologia-da-tuberculose-%5B81-080909-SES-MT%5D.pdf
http://www.saude.mt.gov.br/upload/documento/81/manual-de-bacteriologia-da-tuberculose-%5B81-080909-SES-MT%5D.pdf
https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/14737/3/mariana_santos_ioc_mest_2015.pdf
46 
file://file/docusuarios$/641024/Desktop/MODELO%20Apostila%20de%20Microbiolog 
ia%20CBB%201047%202017%202.pdf 
 
file://file/docusuarios$/641024/Desktop/MODELO%20Apostila%20de%20Microbiolog 
ia%20CBB%201047%202017%202.pdf 
47 
8. Preparo de Materiais e Vidrarias para Esterilização emAutoclave 
 
Introdução 
Uma das formas mais eficientes para destruir quaisquer formas de vida 
microbiana, é a através da esterilização, sendo que o aquecimento é o método mais 
utilizado na realização desse procedimento. Normalmente, feito com vapor sob pressão. 
O calor desnatura e coagula as proteínas das células dos microrganismos e a água 
influencia na destruição das membranas e enzimas, pois pode induzir na quebra das 
ligações de hidrogênio. Para realizar esse procedimento utiliza-se a autoclave. 
A autoclave é usada para esterilização de vidrarias e materiais que suportam alta pressão 
e calor e algumas soluções aquosas. O seu funcionamento tem o mesmo princípio de uma 
panela de pressão. Para obter o resultado desejado é necessário fique de 15 a 30 minutos 
a temperatura de 121 ºC. 
O acondicionamento correto de materiais e de vidrarias é de vital importância para 
a esterilização eficiente em autoclave. O sucesso das análises depende da obtenção de 
materiais livres de contaminações iniciais, a fim de que se possa determinar apenas o 
microrganismo presente em determinada amostra. Vidrarias, por exemplo, as Pipetas, 
placas de Petri, tubos de cultura e demais instrumentos usados em microbiologia devem 
estar corretamente embalados, para que, depois de esterilizados, possam ser guardados 
sem que sofram nenhum tipo de contaminação subsequente. 
Placas e pipetas devem ser acondicionadas em papel de embrulho, ou em papel 
Kraft, e identificadas antes da esterilização. Tubos de cultura e balões de fundo chato com 
meio de cultura devem possuir um tampão de algodão e gaze (boneca) obtido por meio 
da técnica de “embuchamento”. Em seguida, devem ser cobertos por uma coifa, feita com 
um pedaço de papel Kraft (10 cm por 10 cm) que será amarrado com um fio sobre a 
boneca de gaze. Para testar a eficiência da esterilização, poderão ser realizados um 
processo químico com uma fita própria para autoclave (fita adesiva), um indicador 
biológico. 
Compreende-se por esterilização a completa destruição de qualquer 
microrganismo vivo. Essa destruição pode ser realizada pelo chamado controle de 
microrganismo, sendo que o mais frequentemente método físico utilizado é o calor e 
também o mais barato. O emprego de calor se faz por meio de flambagem e estufa (calor 
seco) e de água fervente, autoclavagem e tindalização (calor úmido). 
48 
O calor seco exerce a maioria de seus danos pela oxidação das moléculas. O calor 
úmido destrói os microrganismos principalmente pela desnaturação protéica, pela 
presença de moléculas de água, que ajudam a romper as ligações de hidrogênio, além de 
romperem membranas lipídicas. Sendo que o primeiro método exige temperaturas mais 
elevadas para alcançar o objetivo de esterilização. 
 
Calor seco 
 
 
O calor seco (como forno ou estufa) penetra nas substâncias mais lentamente que 
o calor úmido (vapor). Usado para esterilizar objetos de metal e de vidro, e é o único meio 
satisfatório para esterilizar óleos e pós. Os objetos são esterilizados por calor seco quando 
submetidos a 160ºC-170°C por 2 horas. 
Uma chama aberta (flambagem) é a forma de calor seco usada para esterilizar, 
pela incineração, alças de inoculação e bocas dos tubos de cultura e para secar o interior 
de pipetas. Quando os objetos forem flambados no laboratório, deve-se evitar a formação 
de cinzas flutuantes e aerossóis (gotículas liberadas no ar). Essas substâncias podem se 
constituir em um meio de espalhar agentes infecciosos, se os organismos presentes não 
forem mortos pela incineração como pretendido. 
 
Calor úmido 
 
 
O calor úmido é um agente físico amplamente usado. A água fervente destrói células 
vegetativas da maioria das bactérias e dos fungos e inativa alguns vírus. Porém não é 
eficiente na destruição de todos os tipos de esporos. 
 
O processo de autoclavagem utiliza água aquecida sob pressão. Seu ponto de ebulição é 
elevado e, assim, temperaturas acima de 100ºC podem ser alcançadas. Assim atinge 
temperaturas altas o suficiente para matar esporos, como também organismos vegetativos, 
e para romper a estrutura dos ácidos nucléicos nos vírus. 
Na tindalização, o material é submetido a três sessões de exposição a vapor de 
água a 100°C, durante 20 a 45 minutos; durantes 45 minutos; e durante 20 a 45 minutos; 
com um tempo de repouso entre elas de 24h. Consegue-se a esterilização visto que os 
esporos germinam entre duas sessões e depois são destruídos. Essa técnica é utilizada 
para soluções açucaradas ou que contenham gelatina. 
49 
 
Materiais 
Tubos de ensaio 
Estante para tubo de ensaio 
Placas de Petri 
Pipetas graduadas 
Balão de fundo chato 
Erlenmeyer 
Papel pardo ou Kraft ou jornal para esterilização 
Fita de autoclave 
Tesoura 
Algodão e gaze 
Barbante 
 
Procedimento 
Separar as vidrarias que serão necessárias para a análise microbiológica. Embalar os 
materiais no papel pardo e fechar com a fita adesiva com indicador de temperatura. 
Observar se o nível da água da autoclave está correto, caso não esteja completar o volume. 
Colocar o balde dentro da autoclave, colocar todo material a ser esterilizado na parte 
superior do balde, de acordo com a capacidade da autoclave. Fechar a tampa, apertando 
os manípulos em cruz. Ligar a autoclave na potência máxima e abrir o registro (válvula 
de escape). Aguardar a saída do vapor por 3 a 5 minutos, fechando o registro passado esse 
tempo, alcançada a temperatura de trabalho (121°C), colocar a chave na posição média, 
ajustando quando necessário, os pesos que controlam a quantidade de vapor. Marcar o 
tempo, que deverá ser de 15 a 30 minutos. Terminado o tempo de esterilização, desligar 
a autoclave e deixar que o ponteiro do manômetro atinja a posição zero. 
Abrir o registro aos poucos e aguardar a saída do vapor da autoclave, de maneira que ele 
seja escoado completamente. 
 
Em seguida, abrir os manípulos em cruz e retirar os materiais, colocando-os em estufa de 
secagem, e incubando-os a 100ºC por 30 minutos. 
 
Observações: 
50 
Não abrir o registro antes que o manômetro atinja a posição zero, para evitar que o 
material esterilizado fique muito molhado e que os papéis que o envolvem se rasguem; 
Nunca abandonar o local de esterilização, conferindo sempre a temperatura da autoclave, 
e evitando a quebra de materiais e o RISCO DE EXPLOSÃO. 
 
 
 
Referências bibliográficas 
TRABULSI, L. R. Microbiologia. 6. ed. Rio de Janeiro: Atheneu, 2015. 
JORGE, A. O. C. Microbiologia- atividades práticas. 2. ed. São Paulo: Santos, 2011. 
http://paginapessoal.utfpr.edu.br/geraldo/microbiologia- 
pratica/micropratpreparodemateriaisevidrarias.pdf/view 
http://paginapessoal.utfpr.edu.br/geraldo/microbiologia-pratica/micropratpreparodemateriaisevidrarias.pdf/view
http://paginapessoal.utfpr.edu.br/geraldo/microbiologia-pratica/micropratpreparodemateriaisevidrarias.pdf/view
51 
9. Preparo de Meios de Cultura 
 
Introdução 
Para o cultivo e identificação de microrganismos, usam-se soluções e substâncias 
nutritivas chamadas meios de cultura, que devem atender às exigências nutricionais 
das espécies a serem cultivadas. Os meios usuais em laboratório são simples, 
enriquecidos ou seletivos, podendo apresentar-se nas formas líquidas, sólida ou semi- 
sólida. Os primeiros meios de cultura usados foram líquidos, até 1880, Koch 
introduziu os meios sólidos, adicionando o ágar aos mesmos. 
A constituição: fontes de carbono (proteínas e açúcares, fontes de nitrogênio 
(peptonas) e fontes de energia). Alguns inorgânicos, vitaminas e outros fatores 
acessórios de crescimento. 
Em sua composição, há a necessidade em haver nutrientes considerados 
essenciais, e em concentrações relevantes, para que não ocorra uma situação 
inibitória de crescimento. A esterilização deve ser realizada após a preparação de 
cada meio de cultura. O objetivo desta etapa é eliminar qualquer organismo vivo 
classificado como contaminante.Após finalização da preparação, o meio de cultura 
deve ser mantido em local livre de contaminação, para que no momento de sua 
utilização, o mesmo esteja em perfeitas condições. 
Meios básicos de Cultura 
Caldo simples: constituído basicamente de extrato de carne e peptona. 
Ágar simples: adiciona-se ágar à fórmula do caldo simples. 
Ágar – é um polissacarídeo extraído de algas marinhas, que não é utilizado pelas 
bactérias, possuindo a finalidade de solidificar o meio de cultura. 
Propriedades do Àgar 
 Poucos microrganismo podem degradar o ágar e, portanto, ele permanece 
sólido quando adicionado ao meio de cultura. 
 O ágar funde a uma temperatura inferior à temperatura de ebulição da água e 
permanece líquido até a temperatura de 40°C. 
 Após solidificação o ágar pode ser incubado a uma temperatura de até 100°C 
sem perder suas características. 
Os meios de cultura são classificados em alguns tipos, que seguem abaixo: 
• Seletivo: são aqueles que suprimem o desenvolvimento (ato de crescimento) 
de determinados microrganismos em benefício de outros. De uma maneira bem 
52 
“básica e popular”, eles “inibem o microrganismo na qual o usuário não deseja, e 
deixa prevalecer somente o que o mesmo deseja focar”. 
• Diferencial: entre diversos grupos de microrganismos baseando-se na 
capacidade de metabolização de componentes específicos do meio de cultura ou 
morfologia das colônias, permitem a distinção. 
• Enriquecimento: proporcionam nutrientes favoráveis ao crescimento de 
microrganismos presentes geralmente sob baixos números ou de crescimento lento. 
• Transporte: são meios que mantêm as bactérias viáveis por mais tempo – 
quando não é possível a semeadura imediata do material. 
Materiais 
Bico de bunsen 
Tela de amianto 
Béquer de 500mL 
Proveta de 100mL 
Balança 
Espátula 
Meio de cultura Ágar nutriente 
Placas de Petri 
 
 
Procedimento 
Pesar o pó para preparo do Ágar nutriente, seguindo o protocolo indicado, e 
adicionar separadamente à água destilada, tomando-se o cuidado de homogeneizar a 
cada componente adicionado. Os meios de cultura mais utilizados em laboratórios de 
microbiologia estão disponíveis comercialmente, já na forma desidratada. Nestes 
casos, pesar a quantidade de mistura especificada na embalagem do produto e 
acrescentar à água destilada. Levar ao aquecimento até quase fervura. Verter sobre 
as Placas de Petri e esperar a solidificação. A esterilização é efetuada após a su 
preparação, para assim eliminar os microrganismos contaminantes. E geralmente 
ocorre na autoclave. 
 
Exercícios de fixação 
53 
1. Qual a constituição do ágar? Qual a finalidade da incorporação do mesmo nos 
meios de cultura? 
2. Que vantagens os meios de cultura sólidos apresentam para o estudo dos 
microrganismos? 
3. O que são meios de cultura enriquecidos? Exemplifique. 
4. O que são meios de cultura seletivos? Exemplifique. 
Referências bibliográficas 
TRABULSI, L. R. Microbiologia. 6. ed. Rio de Janeiro: Atheneu, 2015. 
 
 
JORGE, A. O. C. Microbiologia- atividades práticas. 2. ed. São Paulo: Santos, 2011. 
54 
10. Antibiograma – Testes de Sensibilidade a Antimicrobianos (TSA) 
 
Introdução 
A determinação do teste de sensibilidade a antimicrobianos (TSA) conhecido 
também como antibiograma e sua interpretação é uma ferramenta importante tanto do 
ponto de vista clínico quanto epidemiológico. Não se trata de uma tarefa fácil, por suas 
limitações e principalmente pela crescente descoberta de novos mecanismos de 
resistência, o que exige cada vez mais atualização e treinamento dos profissionais. Um 
ponto fundamental para estabelecer o perfil de sensibilidade de uma bactéria é determinar 
o valor da concentração inibitória mínima (CIM) em relação ao antimicrobiano, ou seja, 
a menor concentração do antimicrobiano que e capaz de inibir a sua multiplicação e 
estabelecer os pontos de corte (breakpoints) para interpretação dos testes de sensibilidade. 
Existem vários comitês que trabalham na padronização dos testes de sensibilidade como 
o Clinical laboratory Standards Institute (CLSI), o European Committee on 
Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) e mais recentemente o Brazilian 
Comittee on Antimicrobial Susceptibility Testing (BrCAST). 
Para cada método são preconizados aspectos que dizem respeito ao inoculo, meio 
de cultura, temperatura, tempo e atmosfera de incubação, bem como cepas-padrão 
utilizadas no controle de qualidade do teste. Em cada combinação micro-organismo e 
droga são também estabelecidos os critérios interpretativos de acordo com o seguinte: 
• Sensível: o isolado é inibido quando doses usuais dos antimicrobianos são 
utilizadas; 
• Intermediário: inclui isolados cuja CIM possa ser atingida por níveis de 
antimicrobianos no sangue e nos tecidos, mas a taxa de resposta possa ser menor 
que para aqueles classificados como sensíveis. A categoria intermediária implica 
eficácia clínica em sítios aonde fisiologicamente as drogas são mais concentradas 
como por exemplo, as quinolonas e beta-lactâmicos na urina, ou quando doses 
maiores possam ser utilizadas (beta-lactâmicos); 
• Sensível dose dependente (SDD): trata-se de uma categoria recentemente 
introduzida para interpretação do perfil de sensibilidade de bactérias. Implica que 
a susceptibilidade do isolado é dependente do regime terapêutico utilizado. Estas 
doses são superiores àquelas referendadas para classificação da categoria sensível; 
55 
• Resistente: refere-se a isolados que não são inibidos por concentrações de 
antimicrobianos utilizados em doses habituais ou que os limites indicam a 
presença de um mecanismo de resistência como, por exemplo, a produção de beta- 
lactamases. 
Espera-se que estes testes de sensibilidade possam detectar os principais mecanismos 
de resistência, porém deve-se ficar sempre atento para a detecção de novos mecanismos 
que possam ser descritos.Os testes de sensibilidade podem ser realizados manualmente 
ou de forma automatizada. 
Métodos Manuais: 
 
✓ Disco difusão/técnica de Kirby e Bauer: flexível e bem padronizado para 
uma série de gêneros e espécies de bactérias; consiste no plaqueamento de um 
inoculo padronizado em 1,5x 108 U.F.C/ml (0,5 da escala de MacFarland) em 
um meio sólido e adição de discos de papel-filtro impregnados com 
concentrações pré estabelecidas de antimicrobiano. Em geral, distribui-se até 
12 discos na placa de 100 mm, após incubação, procede-se a leitura dos halos 
de inibição de crescimento ao redor dos discos. Pra cada combinação micro- 
organismo e droga se faz a interpretação da categoria (S, R, I, SDD) 
consultando-se as tabelas dos órgãos de padronização. A vantagem do método 
está na simplicidade de execução, facilidade de leitura e eliminação do uso de 
dispositivo automatizado. Ao contrário de outros métodos, que serão citados 
abaixo, produz resultados somente qualitativos. Uma das desvantagens do 
método, é que não existe uma padronização para todas as bactérias e todos os 
antimicrobianos. 
✓ Diluição em caldo-macrodiluição 
 
56 
✓ Diluição em caldo-microdiluição. 
 
 
✓ Difusão em Agar com diferentes gradientes de concentrações (Etest®) 
 
 
✓ Diluição em Agar 
57 
 
 
 
 
 
 
 
 
Métodos 
 
 
 
 
 
Automatizados: são métodos que através da tubidimetria, colorimetria e fotometria 
possuem a vantagem de liberação de resultados em um período de tempo reduzido. 
Utilizam cartões, placas ou geladeiras que são específicos para Gram-negativos e Gram 
positivos e que, após serem inoculados, são incubados no equipamento. Os sistemas 
disponíveis no nosso meio são o Vitek® (BioMerieux), Phoenix® (BD) e Microscam® 
(Siemmens). Todos eles são acoplados a um software e que após a leitura automatizada, 
tem a capacidade de interpretar os resultados obtidos. Dependendo dos valores de CIM 
obtidos caracterizam-se por serem métodos semi-quantitativos. 
 
Outros métodos: 
 
✓ Biologia molecular58 
 
 
✓ MALDI TOF: A sigla MALDI-TOF significa Matrix Associated Laser 
Desorption-Ionization - Time of Flight e consiste num sistema no qual material 
biológico (uma colônia ou um concentrado de hemocultura) é colocado em uma 
placa em que há a matriz polimérica. Isso é irradiado com um laser que vaporiza 
a amostra e há ionização de várias moléculas, que são aspiradas num tubo de 
vácuo e levadas a um detector: conforme a molécula, o tempo de chegada ao 
detector (time of flight) é diferente. Isso é colocado em gráfico, dando vários picos 
e, para cada espécie bacteriana ou fúngica, obtém-se um gráfico específico. Uma 
base de dados computadorizada interpreta e fornece o resultado - tudo com muita 
rapidez 
59 
 
 
Materiais 
Pacas de petri grandes contendo Àgar Mueller Hinton 
Swab 
Padrão de turbidez 0,5 de MacFarland 
Solução fisiológica 0,9% 
Cultura bacteriana de 24 horas 
Discos de antimicrobianos 
Pinça anatômica 
 
Procedimento 
Método de Difusão em Ágar (Kirby-Bauer) 
 
4. Preparo de uma suspensão de bactérias de cultivo recente. 
 
Inocular colônias bactérias em solução fisiológica 0,9%até que a solução apresente a 
mesma turbidez da escala 0,5 de MacFarland: aproximadamente 1,58UFC/ml. 
60 
 
 
 
5. Inóculo da suspensão. 
 
Inocular a suspensão na superfície de uma placa contendo ágar Müller-Hinton e, em 
seguida, adicionar os discos de papel impregnados com antibiótico. Após a incubação em 
estufa, analisar o padrão de crescimento ou inibição ao redor de cada disco, utilizando 
tabela apropriada. 
 
3. Aplicação dos discos 
1. Escolher as drogas (discos antimicrobianos) – temperatura ambiente 
Se possível, semear o micro- 
organismo em Agar nutriente antes 
do preparo do inóculo 
61 
2. Utilizar pinça estéril (flambada) 
3. Pressionar o disco no ágar (assegura contato com a superfície) 
4. Evitar reaplicação – novo disco, novo local (difusão rápida). 
 
100mm 5 a 6 discos 
150mm 12 discos 
 
 
6. Incubação 
 
Incubar a 35ºC por 24 horas (tampa para baixo) 
 
7. Instruções para leitura 
 
Os halos são medidos em mm na placa invertida (halômetro ou régua) – laudo em mm; 
Comparar halo de crescimento: sensibilidade ou resistência. 
 
FATORES TÉCNICOS QUE INFLUENCIAM NO TAMANHO DO HALO 
62 
8. Densidade do inóculo: 
 
Muito concentrado: > quantidade de bactéria no inoculo > halo de resistência – 
falsa resistência. 
Pouco concentrado: < quantidade de bactérias no inoculo < halo de sensibilidade – 
falsa sensibilidade 
2- Temperatura de inoculação 
Temperatura elevada: diminui viscosidade, > difusão, > halo. 
Diminuição da temperatura: diminui crescimento bacteriano: > halo. 
3- Tempo de incubação 
Antes (tempo <): não há crescimento. 
Após (tempo >): contaminação e cepas mutantes. 
4- Tamanho da placa, profundidade do meio e distância entre discos tamanho: 
halos podem se encontrar ou entrar um dentro do outro (impede leitura) 
Altura: 4mm difusão igual / > 4mm: difusão para o fundo / < 4mm: difusão para os 
lados. 
Distância: mínima de 2cm 
5. pH 7,2 a 7,4: interfere na atividade dos antibióticos – Ácido: ↓ atividade do antibiótico 
(< halo). 
6. INTERFERENTES 
A execução desta técnica está sujeita a diferentes interferentes, por isso deve ser 
rigorosamente controlada. Das interferências mais comuns: 
Análise de mais de uma cepa concomitantemente; 
Inoculo muito denso ou muito fraco; 
Altura do ágar fora das especificações recomendadas; 
Quantidade de discos excessivos; 
Disposição dos discos muito próximos; 
Discos e meios fora do padrão de qualidade. 
 
Na forma de discos estão disponíveis as seguintes combinações: 
63 
 
 
 
Exemplos de antibacterianos e padrão interpretativo dos mesmos 
 
 
 
64 
 
Exercícios de fixação 
 
 
Observação: Justificar cada item das questões objetivas abaixo. 
1- A tabela abaixo mostra os resultados obtidos após as técnicas do antibiograma e 
determinação da concentração inibitória mínima de 3 antibióticos para uma mesma cepa 
bacteriana. Sobre a interpretação dos resultados, é possível afirmar: 
 
A) os antibióticos 1 e 2 são os mais eficazes contra a bactéria, pois apresentam a 
menor concentração inibitória mínima. 
B) o antibiótico 1 é o mais eficaz por apresentar o maior halo de inibição e a menor 
concentração inibitória mínima. 
C) o antibiótico 3 é o mais eficaz por apresentar a maior concentração inibitória mínima. 
D) o antibiótico 1 é mais eficaz que o antibiótico 2, pois apesar de apresentar a mesma 
concentração inibitória mínima, apresenta o maior halo de inibição no antibiograma. 
E) somente podemos determinar qual o melhor antibiótico após a determinação da 
concentração bactericida de cada antibiótico. 
 
2- O antibiograma apresenta como objetivos a identificação e a análise do perfil e da 
sensibilidade de bactérias isoladas a um painel de antibióticos. Esse exame é realizado 
em culturas de material obtido em diversas áreas do organismo que tenham apresentado 
crescimento bacteriano. Existe também a possibilidade de utilização do antibiograma 
automatizado, que fornece a concentração inibitória mínima de antibiótico para 
determinada bactéria. 
Na realização do antibiograma 
A) por disco-difusão, caso ocorra crescimento de bactérias homolíticas, a leitura deve ser 
realizada na zona de hemólise, selecionando-se a área de maior lise. 
 
 
B) por disco-difusão, todo crescimento no halo de inibição deve ser ignorado, não sendo 
tais bactérias subcultivadas. 
65 
 
C) por disco-difusão, após inoculação e período de incubação, devem ser checados a 
característica do crescimento e o padrão das zonas de inibição ao redor dos discos, 
usando-se um paquímetro ou halômetro Cefar. 
D) automatizado, o inóculo deverá ser preparado a partir de colônias confluentes para que 
sejam levados em conjunto todos os agentes que cresceram na placa de isolamento 
primário. 
E) automatizado, a grande desvantagem se relaciona à impossibilidade de uma abordagem 
quantitativa da sensibilidade dos micro-organismos isolados. 
3- Descreva todo o procedimento técnico utilizado na realização do TSA. 
4- Explique dois métodos além do disco difusão, utilizados na determinação do perfil de 
sensibilidade das bactérias frente aos antimicrobianos. 
 
 
 
Referências bibliográficas 
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