Conceitos de Biologia Molecular

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CONCEITOS DE
BIOLOGIA MOLECULAR
Jorge Mondego
Biologia Molecular
The “OME”-Era
Genome Transcriptome
The “OME”-Era
Proteome Metabolome
- Entendimento da fisiologia e reprodução de microorganismos
- Entendimento dos mecanismos de replicação, transcrição e tradução
- Enzimas de restrição
- Plasmídeos
- Purificação de proteínas e Enzimologia
- Polymerase Chain Reaction (PCR)
- Transcriptase reversa e RT-PCR
- Sequenciamento
- Fluoróforos
- Automação
Cromossomo bacteriano Plasmídeos
Plasmídeos
DNA extracromossômico capaz de se replicar independe ntemente da 
replicação cromossomal
- Resistência a antibióticos
- Produção de toxinas
- Conjugação (transmissão de material genético entre as bactérias)
- Origem de replicação própria
Conjugação
Transmissão de material genético
entre as bactérias
Transferência horizontal de genes
Transferência de material genético 
entre reinos
Agrobacterium tumefaciens
Transformação
Competência – Habilidade de uma 
célula receber DNA extracelular 
vindo do meio ambiente.
-Natural: Bactérias adquirem DNA do 
meio para nutrição, reprodução e 
reparo de seu DNA, através de reparo de seu DNA, através de 
mecanismo de transporte 
membranar.
- Artificial: Uso de procedimentos de 
laboratório que tornam as células 
passíveis de serem transformadas. 
Transdução
Fagos – vírus que infectam bactérias
Daniel Nathans, Werner Arber, Hamilton Smith - 1978
Enzimas de restrição (endonucleases)
Sistema de modificação - restrição
- Enzimas bacterianas que reconhecem e clivam DNA in vasor 
- Reconhecimento de seqüência palindrômica de DNA exó geno
- Seqüências bacterianas equivalentes são metiladas
5'-GTATAC-3'
|||||| 
3'-CATATG-5'Seqüência palindrômica
- Seqüências bacterianas equivalentes são metiladas
Pontas coesivas Pontas “cegas”Pontas coesivas
Cohesive ends
Pontas “cegas”
Blunt ends
Manipulação dos plasmídeos e a tecnologia do DNA recombinante
Sítio de 
Resistência
a antibióticos
Origem de replicação
clonagem
-Plasmídeo é digerido com enzimas
-Gene específico é ligado no plasmídeo,
replicado em diversas cópias 
“Clonagem” em vetores
Transformação
Choque térmico
Choque osmótico
Shuttle vectors
Plasmídeos que se propagam em 
duas espécies
-Transformação de plantas, leveduras, fungos filamen tosos e células animais
Bacteriófagos
Fagos como vetor
Vetores Tamanho do inserto
Plasmídeos de alta cópia 0–10 kb
Bacteriófago λ (inserção) 0–10 kb
Bacteriophage λ (substituição) 9–23 kb
Cosmídeos 30–44 kb
Bacteriófago P1 70–100 kb
BAC (cromossomos artificiais de bactérias) até 300 k b
YAC (cromossomos artificiais de leveduras) 0.2–2.0 M b
PCR - A REVOLUÇÃO DA TAQ
Kari Mullis – 1985
Premio Nobel de química -1993
PCR 1
95°°°°C
Tm
72°°°°C
PCR 2
n Ciclos de PCR
- Concentração dos reagentes
Tris-HCl pH 8,8 (20 mM)
KCl (10-50 mM)
MgCl 2 (1 a 4 mM) – Menos Mg – mais especificidade
Glicerol (menos que 5%)
dNTPs (200 a 10 µM – Menos dNTP - mais especificidade)
Taq (1 unidade)
PCR – Otimização da reação
Taq (1 unidade)
-Condições dos ciclos
Etapa de denaturação inicial (1-3 min a 95°C)
Etapa de denaturação (30 seg a 2 min a 95°C)
Etapa de anelamento 
Etapa de extensão (30 seg a 1min e 30 seg a 70-75°C)
- Desenhos dos primers
Características desejáveis em um Primer
● Temperatura de melting (Tm) na faixa de 50 ºC a 65 ºC.
● Tamanho de 15 a 28 pares de bases
● Ausência da capacidade de dimerização.
● Ausência significativa da formação de grampos (>3 bp)
● Inexistência de sítios secundários de anelamento dos 
primers.
● Temperaturas de anelamento de primers formando um 
par devem ser próximas
Comprimento
- Quanto maior o comprimento do primer, maior a
possibilidade deste ser exclusivo; da mesma forma que
maiores serão as temperaturas de melting e anelamento.
- De uma forma geral, o comprimento do primer não deve ser
inferior a 15 bases para assegurar a unicidade. inferior a 15 bases para assegurar a unicidade. 
- A existência desta faixa está baseada no fato de se buscar
unique primers que apresentem temperatura de anelamento
dentro da faixa considerada como a mais adequada.
Temperatura de Melting (TM)
- É a temperatura na qual metade das fitas de DNA está na 
forma de fitas simples e a outra metade na
forma de dupla hélice.
- Tm é dependente da composição do DNA, de modo que
aumento do conteúdo de G+C no DNA gera um 
incremento na Tm ocasionado pelo maior número de 
ligações de H.ligações de H.
Temperatura de Anelamento
– É a temperatura na qual os primers se pareiam ao 
DNA molde. Ela pode ser calculada a partir da Tm . 
T anneal = Tm_primer – 4°C
Estringência no Anelamento do Primer
- A estringência determina a especificidade no produto de
DNA a ser amplificado.
- T anneal é o fator mais significante que afeta a estringência 
no anelamento do primer.
-T anneal : 
Muito baixa = menor estringência = primer pareia em qualquer 
lugar. 
muito alta = maior estringência = primer pode não parear.
Estrutura interna do primer
- Evitar essas estruturas...
..Pode-se utilizar primers com estas 
estruturas se estas forem formadas 
a uma temperatura em torno de 30°C 
menor que a Tm 
Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T)
atgatagaggctctcgaag ctgaggtgaccaggagaacgctcgagtttgacacgtgtaaa
·M··I··E··A··L··E··A··E··V··T··R··R··T··L··E··F··D· ·T··C··K·
gtcgt cgctctcccaatggtataa
·V··V··A··L··P··M··V··*· 
5´- atgatagaggctctcgaag – 3´ 5´- ttataccattgggagagcg – 3 ´
5´- atgatagaggctctcgaag ctgaggtgaccaggagaacgctcgagtttgacacgtgtaaagtcgtcgctc tcccaatg
3´- tactatctccgagagcttcgactccactggtcctcttgcgagctcaaa ctgtgcacatttcagcagcgagagggttac
gtataa – 3´
catatt – 5´
RNA
DNA
TRANSCRIPTASE REVERSA e A QUEBRA DO PARADIGMA
RNA
Proteína
Quebra do paradigma
RT “REVOLUTION”
PRIMERS UTILIZADOS
Oligo(dT)15-25
-“Somente mRNA”
Hexâmeros randômicosHexâmeros randômicos
- Anelamento em regiões aleatórias
Primer específico do gene
- Amplificação somente do gene alvo
Bibliotecas
Expressed Sequence Tags (ESTs)
Extrair RNA de diferentes 
tecidos/condições
cDNA
Bibliotecas
3’ EST5’ EST
Clonar em vetor
Full-Lenght cDNA
Controle Tratado
Extração de RNA e 
síntese de cDNA
Northern Eletrônico
sequenciamento sequenciamento
clusterização
Sequência consenso
controle
tratado = 2x
Adaptors
Driver Driver and Tester
Driver Tester
1-cDNA synthesis
2-cDNA digestion with 4 cutter 
enzyme
3-Adaptor ligation to tester 
sample
Control Treated
RNA Pools
Biblioteca subtrativa
Driver Driver and 
Tester
Tester
No amplificated
Exponential 
Amplification
Linear 
Amplification 
EliminatedEliminated
Enriched 
Tester
4-Tester/ driver 
hybridization
5-PCR with primers that 
anneal specifically to 
adaptor previously ligated 
to tester sample
6-Enrichment of cDNA 
library in genes 
preferentially expressed 
in tester sample
Fluoróforos e “molecular beacons”
Cianinas 
Emissão fluorescente - 570 nm 
(região do verde do espectro de luz) 
Emissão fluorescente - 670 nm Emissão fluorescente - 670 nm 
(região do verde do espectro de luz) 
SYBR GREEN
Emissão fluorescente - 522 nm 
(região do verde do espectro de luz) 
“molecular beacons”
Loop – complementar a seqüência alvo
Análise Qualitativa 
Visa detectar a presença ou não do gene
Análise Quantitativa
Visa detectar a quantidade (expressão) do gene na 
amostra
PCR – Quantidade X Qualidade
amostra
Difícil diferenciar 10 cópias de 50 cópias em 
gel de agarose
Detecção do PCR 
tradicional
Detecção do Real 
Time PCR
SYBR green assay
SYBR se liga a DNA dupla fita e 
fluoresce. Durante o processo 
de amplificação, a fluorescência vai 
aumentando, tornando mais fácil aumentando, tornando mais fácil 
a quantificação de DNA
Taq Man®
Sonda anela no gene alvo
Polimerase desloca repórter
liberação de fluorescência verde
Polimerase desloca quencher
www.appliedbiosystems.com
TTGTTCGAAGACTGGAAaCAACAGGTCGTCAGGCAGCAT
AACGAGTACAGGGCCCGTTATGGTGCACCCAACCTGTCC
TGGAGCGATGCTCTGTACCCGGATACTGCTCGATATGCC
GGACAGTGCAA GTTCcAACACAGGTATGACACGTCGTTGGTTCGTCGACATGTA AGGGTACTGACGACACATTCAAAG
Desenho de primers real time
Junção éxon - íntron
GTTCGTCGACATGTA AGGGTACTGACGACACATTCAAAG
CAACAGTGGCGGCAAGTACGGCGAAAACTTGGCTGCTG
GTACTGGAAACGCCTATGGTTTCTCGAGCGGCTTGAAGT
CGTGGATGGATGAAGCTTGTATGTCTAC
http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/primer_gensc ript.cgi
Quebrar em pedaços 
aleatórios ~2000pb 
(shotgun)
DNA genômico
reads
Clonagem de genomas
clonar em vetor
sequenciamento
reads
Sequência consenso
(DNA original)
Reconstrução do DNA original a partir do 
fragmentos (clusterização)
A reconstrução é feita a partir de sobreposição dos fragmentos
Quebrar em pedaços Quebrar em pedaços Quebrar em pedaços Quebrar em pedaços 
aleatoriamente desde aleatoriamente desde aleatoriamente desde aleatoriamente desde 
50Kpb até 300Kpb50Kpb até 300Kpb50Kpb até 300Kpb50Kpb até 300Kpb
DNA genômicoDNA genômicoDNA genômicoDNA genômico
Clonar em BAC’s e 
Shotgun de pedaços do genoma
~800 bp ~800 bp
Quebrar em pedaços de 
2000pb
Clonar em BAC’s e 
sequenciar apenas as 
pontas de cada fragmento
clonar em vetor e sequenciar 
os fragmentos
Primer Walking
Clone to sequenceVector
Primer Sequence
New 
Primer
Sequence
Repeat
Sempre desenhar o primer de forma que a sequência amplificada tenha 
sobreposição com a anterior (tipicamente 100 pb de sobreposição)
anelamento dos primers
denaturação
TTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCC
0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40 ...
O programa PHRED lê o chromatograma identificando e 
dando uma nota para cada base que forma a sequência :
- A identificação dos picos é feita através de uma 
transformada de fourier do sinal
- A nota é ligada com a resolução entre os picos vizinhos e a 
altura do background
Região de qualidade alta
Analisando o cromatograma
• Picos bem definidos e grandes.
• Linha de base boa.
• Distância entre picos anterior e posterior constante.
Região de qualidade média – poucas ambigüidades
• Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho médio.
• Linha de base boa a razoável.
• Distância entre picos anterior e posterior razoável.
Região de qualidade baixa – baixa confiabilidade
• Picos mal definidos e de tamanho pequeno.
• Linha de base confusa.
• Distância entre picos anterior e posterior inconstante.
http://www.454.com/
Pirosequenciamento
Roche (454) GS FLX sequencer
Fita simples
Câmera de 
CCD
Reação de 
degradação
Quebrar em pedaços 
aleatórios ~2000pb 
(shotgun)
DNA genômico
Shotgun do genoma inteiro
Ligação do 
adaptador e 
separação em fita 
simples
- O adaptador permite que o DNA se ligue em grânulos
minúsculos (diâmetro de 28 mm). Apenas um DNA é
ligado em cada grânulo
- Os grânulos são envolvidos em gotas de óleo que
contêm todos os reagentes necessários para amplificar o
DNA
- Cada gota contendo o grânulo é mantida isolada para- Cada gota contendo o grânulo é mantida isolada para
evitar contaminação e consegue produzir 10 milhões de
cópias numa reação de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reação de pirosequenciamento
produz 1011 moléculas de ATP gerando mais de 109
fótons, num comprimento de onda de 560 nm, e num
período de 3-4 segundos. Facilmente detectado por uma
câmera de CCD
O sequenciador 454
Câmera de 
CCD
Bombeamento 
de fluídos
Câmara de fluxo 
contendo as 
amostras e as 
fibras ópticas
(1,6 milhões/slide)
Computador
Pirograma
Linearidade é mantida até homopolímeros de 8 nt
Illumina/Solexa Genome Analyzer 
Sequenciamento por síntese + clustering PCR
http://www.illumina.com/
- O adaptador permite que o DNA se ligue a uma placa na
superfície dos canais de fluxo
- PCR em fase sólida permite que as moléculas
resultantes de uma PCR fiquem próximas. Ciclo é
repetido várias vezes
- Adição de polimerase, primers e de nucleotídeos,- Adição de polimerase, primers e de nucleotídeos,
marcados por fluoróforos, com o 3’OH inativado – adição
de um nucleotídeo por vez. Após incorporação, há a
detecção do fluoróforo, reverte-se a inativação do 3’OH e
e retira-se o fluoróforo. Ciclo se repete.
Applied Biosystems SOLiD TM
Sequencer
http://www.appliedbiosystems.com.br/site/abhome.jsp
- O adaptador ligado ao DNA e a grânulos magnéticos.
Ocorre PCR em emulsão e as fitas de DNA são
depositadas numa placa
- Ligação de primer universal n ao adaptador e de óligos
degenerados (7 bases) marcados contendo duas
primeiras bases fixas.
- Ocorre detecção do sinal, clivagem das duas últimas
bases e adição de novos óligos
- Ao fim de n rounds, a fita resultante é liberada e há a
ligação de um novo primer universal, (agora n-1). Ciclo se
repete mais três vezes (até n-4).
SANGER Novas tecnologias
• Depende de clonagem em 
bactéria (2 semanas de 
trabalho)
• Não há clonagem
• Reads de ~700 bp • Reads de 200 a 25 pb
• Clones de fita dupla 
Sanger vs Novas tecnologias
• Milhões de bp em menos de 4 
horas 
• 1 milhão de pb em 24 horas
• Clones de fita dupla 
permitem seqüenciamento 
em ambas direções (facilita 
orientação e montagem)
• Fragmentos fita simples não 
permitem seqüenciamento em 
ambas direções. Aplicação da 
técnica de paired-end
• 6 meses de sequenciamento, 
24 horas por dia, para 
sequenciar o genoma de um 
fungo
• 24 horas para sequenciar o 
genoma de um fungo
Conclusão : a união faz a força
454 Solexa SoliD
Sequencing 
chemistry
Pyrosequencing
Polymerase-based sequencing-
by-synthesis
Ligation-based 
sequencing
Amplification 
approach
Emulsion PCR Bridge amplification Emulsion PCR
Paired 
ends/separation
Yes/3 kb Yes/200 bp Yes/3 kb
Novas Tecnologias
ends/separation
Yes/3 kb Yes/200 bp Yes/3 kb
Mb/run 100 Mb 1300 Mb 3000 Mb
Time/run (paired 
ends)
7 h 4 days 5 days
Read length 250 bp 32–40 bp 35 bp
Cost per run 
(total direct a)
$8439 $8950 $17 447
Cost per Mb $84.39 $5.97 $5.81