MANUAL_DE_PRaTICAS

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MANUAL ATIVIDADES PRÁTICAS DA DISCIPLINA
RELAÇÕES MICRORGANISMOS HOSPEDEIROS
I
Manual de atividades
Práticas da disciPlina
relações
MicrorganisMos
HosPedeiros
MANUAL ATIVIDADES PRÁTICAS DA DISCIPLINA
RELAÇÕES MICRORGANISMOS HOSPEDEIROS
II
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Manual Atividades Práticas da Disciplina
Relações Microrganismos Hospedeiros
Indaial: Uniasselvi, 2020.
Professora Dra. Marcia Regina Pelisser
1. Relações Microrganismos Hospedeiros
I. Centro Universitário Leonardo da Vinci
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III
suMário
APRESENTAÇÃO ....................................................................................................................................
1
PRÁTICA 1 – PRINCÍPIOS BÁSICOS DE BIOSSEGURANÇA EM LABORATÓRIO DE 
MICROBIOLOGIA ..................................................................................................................................
3
PRÁTICA 2 – ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA E TÉCNICAS 
MICROBIOLÓGICAS ............................................................................................................................
7
PRÁTICA 3 – MICROBIOTA E HIGIENIZAÇÃO DE MÃOS .......................................................
17
PRÁTICA 4 – COLORAÇÃO DE GRAM ............................................................................................
23
PRÁTICA 5 – ANÁLISE DE SUPERFÍCIES DE EQUIPAMENTOS OU UTENSÍLIOS ............
27
PRÁTICA 6 – CONTAGEM TOTAL DE MESÓFILOS DE AMOSTRAS DE ALIMENTOS ....
31
PRÁTICA 7 – ANÁLISE DE ALIMENTOS COLIFORMES TOTAIS E 
TERMOTOLERANTES EM ALIMENTOS .........................................................................................
35
PRÁTICA 8 – MORFOLOGIA E ESTRUTURA DOS FUNGOS ....................................................
39
PRÁTICA 9 – MÉTODO HOFFMAN ..................................................................................................
45
PRÁTICA 10 – MÉTODO RITCHIE .....................................................................................................
49
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IV
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1
APRESENTAÇÃO
Prezado acadêmico, seja bem-vindo às atividades práticas da disciplina 
de Relações Microrganismos Hospedeiros!
Este livro reúne dez atividades práticas que são fundamentais para a 
compreensão das áreas da microbiologia abordadas na disciplina de Relações 
Microrganismos Hospedeiros. 
As atividades propostas englobam as normas de biossegurança, 
apresentação dos materiais e técnicas básicas utilizadas em microbiologia, 
microscopia e coloração de diferencial, técnicas de isolamento e contagem de 
microrganismos importantes na área de alimentos. 
Apresenta também uma prática sobre os fungos anemófilos, sua 
caracterização e identificação de estruturas. 
Para finalizar, propõem-se dois métodos de Exame Parasitológico de 
Fezes – métodos Hoffman e Ritchie – que possibilitam a visualização de cisto, 
ovos e larvas.
Desejamos um excelente trabalho laboratorial!
Dra. Marcia Regina Pelisser
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3
PRÁTICA 1 – PRINCÍPIOS BÁSICOS DE BIOSSEGURANÇA 
EM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
1 INTRODUÇÃO
A preocupação com a organização do laboratório e a disposição, o 
funcionamento e a manutenção dos equipamentos é um tópico que deve constar 
na lista de prioridades do profissional da área da saúde no momento da realização 
das atividades práticas. É importante o entendimento de alguns conceitos 
básicos próprios da área, bem como o conhecimento dos tipos de vidrarias, dos 
equipamentos e das metodologias aplicadas nos laboratórios. 
Para conduzir trabalhos nos laboratórios de microbiologia, é necessário 
seguir alguns princípios básicos, essenciais para o bom desempenho do trabalho 
e para a segurança dos que conduzem os ensaios. Embora a virulência dos 
microrganismos utilizados nas aulas práticas seja mínima e tenha sido reduzida 
pelo longo período de cultivo artificial, todos os microrganismos devem ser 
tratados como potencialmente patogênicos. Essas medidas simples ajudam a 
evitar acidentes e disseminação de contaminações.
2 OBJETIVOS
• Conhecer as normas de biossegurança aplicadas ao laboratório de 
microbiologia.
• Reconhecer materiais e equipamentos utilizados em laboratórios de 
microbiologia. 
• Aprender as características específicas de alguns materiais usados nos 
laboratórios que envolvem a atividade.
3 MATERIAIS
Além dos equipamentos indispensáveis em um laboratório de 
microbiologia, tais como microscópio, estufas incubadoras, estufas esterilizadoras, 
autoclaves, geladeiras, balanças, potenciômetro, destilador de água, centrífuga, 
banho-maria e filtro Seitz, são necessários vidraria específica e outros materiais 
(HOFLING; GONÇALVES, 2008). 
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FIGURA 1 – PRINCIPAIS MATERIAIS E EQUIPAMENTOS UTILIZADOS NO LABORATÓRIO DE 
MICROBIOLOGIA
FONTE: Vermelho et al. (2015, p.16).
4 PROCEDIMENTOS
Realizar a leitura das normas e explicar cada uma delas demonstrando 
sua importância.
a) Para reduzir a microbiota presente naturalmente no laboratório, as seguintes 
regras devem ser sempre observadas:
deixar os materiais como bolsas, agasalhos, livros, cadernos etc. na prateleira, 
nunca sobre as bancadas de trabalho;
limpar e desinfetar as bancadas e capelas no início e no final do trabalho;
nunca colocar instrumentos contaminados, tais como alças de platina, agulhas, 
pinças e pipetas ou ponteiras sobre a bancada;
colocar as pipetas, ponteiras e lâminas após sua utilização em recipientes com 
desinfetante;
colocar qualquer material contendo contaminantes em um recipiente que permita 
a sua esterilização;
manipular culturas de fungos rapidamente para evitar a disseminação de suas 
estruturas reprodutivas (esporos) no ambiente do laboratório;
identificar o material que será utilizado (nome ou número, data);
fazer o descarte apropriado de materiais microbiológicos, químicos.
b) Para evitar acidentes e a infecção de pessoas, as seguintes regras dever ser 
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sempre observadas:
planejar sempre suas atividades antes de realizá-las;
ler atentamente as especificações sobre os produtos químicos que vão ser 
utilizados;
lavar as mãos com detergente antes e depois de terminar um trabalho e não 
ingerir alimentos;
prender os cabelos durante as atividades; não pentear os cabelos no laboratório; 
não fumar nem aplicar cosméticos; manter as unhas cortadas;
usar guarda-pó limpo e, exclusivamente no laboratório, nunca em banheiros, 
refeitórios, escritórios, bibliotecas, ônibus etc.;
não usar o guarda-pó para limpar lâminas, lamínulas ou qualquer outro material;
se necessário, usar luvas estéreis descartáveis e óculos de proteção; não usar 
a luva fora da área de trabalho; nunca abrir portas e nem atender telefones 
usando luvas;
usar sempre calçados fechados;
não lamber as etiquetas ou colocar objetos na boca, ou qualquer material que 
tenha estado em contato com os agentes potencialmente perigosos (incluindo 
lápis e caneta);
não pipetar com a boca, qualquer que seja a natureza da solução;
não usar anéis, pulseiras, relógios e cordões longos durante as atividades 
laboratoriais;
não tocar com as mãos nos olhos, boca ou nariz;
ser cuidadoso com materiais que possam causar ferimentos na pele, como 
seringas, pipetas, vidraria em geral;
faça a flambagem cuidadosa das alças (ou agulhas) de platina antes e após o 
uso. Da mesma forma, a boca dos tubos de ensaio e frascos de cultura deve 
ser passada no fogo, seguindo sempre a orientação recebida; não coloque o 
tampão de algodão sobre a bancada;
não participar do trabalho quando tiver algum ferimentonas mãos;
relatar imediatamente ao professor qualquer acidente, ferimento ocorrido durante 
a aula;
transportar e manter os tubos de cultura em uma estante apropriada para evitar 
acidentes e contaminações de pessoas e ambiente;
em caso de quebra ou derramamento de culturas, cobrir toda a área com toalhas 
de papel e derramar sobre elas o líquido desinfetante (hipoclorito de sódio 
2%). Após 15 minutos, remover as toalhas e descartá-las de forma indicada 
pelo professor.
Ao terminar seu trabalho, lembre-se de:
Transferir o material a ser descartado para a bancada de limpeza; fazer a 
assepsia da bancada com álcool; limpar e desligar a balança; limpar as lentes do 
microscópio e desligá-lo; lavar as mãos.
Em caso de dúvida, peça orientação ao tutor quanto ao manuseio de 
equipamentos, produtos químicos e biológicos e segurança na execução das 
atividades.
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5 INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS 
Após a realização dessa atividade prática, discuta-os a partir dos 
questionamentos a seguir:
a. A que visam as normas em laboratório de Microbiologia?
b. Quais as recomendações para assegurar a saúde do laboratorista durante a 
realização dos ensaios microbiológicos?
c. Como proceder no caso de acidente laboratorial com quebra de vidraria com 
contaminação bacteriana?
6 REFERÊNCIAS
HOFLING, J. F.; GONÇALVES, R. B. Microscopia de luz em microbiologia: 
morfologia bacteriana e fúngica. Porto Alegre: Artmed, 2008. [Minha Biblioteca]
VERMELHO, A. B. et al. Práticas de microbiologia. Rio de Janeiro: Guanabara 
Koogan, 2015.
OPLUSTIL, C. P. et al. Procedimentos básicos em microbiologia clínica. 3. ed. São 
Paulo:
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PRÁTICA 2 – ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA E 
TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS
1 INTRODUÇÃO
Meios de cultura são preparações químicas que possibilitam o cultivo de 
microrganismos a serem analisados em um ensaio microbiológico, permitindo 
que sejam estudados. Para isso, é indispensável que os meios de cultura possuam 
nutrientes básicos que alimentem os fungos e bactérias a serem analisados e, 
principalmente, que estejam estéreis. 
O estudo de microrganismos no laboratório envolve o seu crescimento 
e manutenção em meios de cultura. Há um conjunto de técnicas básicas de 
repicagens e sementeiras de modo a preservar o organismo. Para isso, é necessário 
obter em primeiro lugar uma cultura pura do isolado (colônia obtida a partir 
de uma única célula). A principal fonte de contaminação externa é a atmosfera, 
por isso a manipulação dos organismos terá que ser efetuada em condições de 
assepsia (HOFLING; GONÇALVES, 2008).
2 OBJETIVOS
• Conhecer as etapas de preparação de materiais e meios de cultura para utilizar 
em ensaios microbiológicos.
• Conhecer os procedimentos técnicos gerais utilizados no laboratório de 
microbiologia.
• Conhecer as técnicas básicas de semeadura em microbiologia.
• Fazer diluições seriadas de amostras de alimentos.
• Inocular em meios de cultura líquidos e sólidos.
• Detectar a presença ou a ausência de crescimento bacteriano nos meios 
inoculados.
3 MATERIAIS (quantidade para um grupo de alunos)
• 1 amostra de leite bovino;
• 5 tubos de ensaio com água salina ou água peptonada 0,1%;
• 5 tubos de ensaio com meio de cultura sólido;
• 5 placas de petri com meio de cultura sólido;
• 5 pipetas;
• 3 alças de semeadura.
4 PROCEDIMENTOS
4.1 ETAPAS DE PREPARAÇÃO DO MATERIAL
a. Lavagem do material: toda vidraria deve ser lavada com água e detergente. 
https://www.prolab.com.br/blog/o-que-e-meio-de-cultura-e-para-que-serve/
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Enxaguar abundantemente em água, e a seguir em água destilada.
b. Secagem do material: realizada normalmente em estufa ou forno Pasteur à 
temperatura de 80 a 100 oC.
c. Preparação do material para esterilização: cada material é embalado 
segundo suas características. As placas são embaladas em papel, nos tubos 
são colocadas rolhas de algodão e nos balões, tampões. Nas pipetas também 
é utilizado algodão.
d. Esterilização: em forno ou autoclave. 
e. Armazenamento do material: guardar o material em local apropriado.
f. Esterilização terminal: após a utilização, todos os materiais utilizados, 
contaminados com bactérias, sangue, secreções etc., são autoclavados antes de 
lavar, para evitar a contaminação dos laboratoristas e do meio ambiente.
4.2 NORMAS PARA UTILIZAÇÃO DA AUTOCLAVE
a. Adicionar a quantidade de água necessária para evitar danos à resistência.
b. Colocar o material na cesta.
c. Fechar e ligar o aparelho.
d. Deixar a válvula de escape aberta para a saída do ar de forma contínua, até 
que seja substituído pelo vapor d´água.
e. Fechar a saída do vapor e ficar controlando a pressão (manômetro).
f. Quando a temperatura atingir 121 oC, controlar para que permaneça estável 
por 15 minutos (regular mediante válvula de escape do vapor).
g. Desligar o aparelho, deixar esfriar e diminuir a pressão.
h. Abrir a autoclave somente quando a pressão interna for igual à externa. A 
abertura antecipada da autoclave é muito perigosa, podendo causar uma 
explosão, fazendo saltar rolhas e meios, além de queimar o operador.
4.3 PROCEDIMENTOS TÉCNICOS GERAIS
• Flambar o fio e a alça de platina, resfriando-os antes da coleta.
• Recipientes com meio de cultura abertos e próximos ao bico de Bunsen.
• Aquecer a boca do tubo de ensaio antes e depois da inoculação.
a. Flambagem de alça ou agulha bacteriológica
Procure executar esse procedimento colocando o instrumento sobre a 
chama, numa inclinação aproximada de 45º e nunca em posição horizontal, pois 
desta forma você estará esterilizando apenas a porção final, e geralmente você 
contamina muito mais do que isso ao introduzir a alça num tubo contaminado 
(Figura 2).
b. Abrir o tubo de cultura
Para os destros: segure o tubo com a mão esquerda e retire o tampão de 
algodão com os dedos mínimo e anelar da mão direita, deixando livres os dedos 
médios, indicador e polegar para manuseio da alça bacteriológica ou pipeta, 
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evitando assim deixar o tampão sobre a bancada, o que levaria a sua contaminação 
(Figura 2).
c. Abrir placas de Petri
Coloque a placa fechada sobre a bancada, com a tampa para baixo. Retire 
o fundo da placa com a mão esquerda e assim você terá a mão direita livre para 
semear microrganismos na superfície do meio de cultura.
FIGURA 2 – MANOBRAS ASSÉPTICAS
Legenda: 
a) Flambagem da alça Henle ou da agulha. b) Abrir o tubo de ensaio. c) Flambar rapidamente a 
boca do tubo de ensaio e mantê-lo aberto dentro da “zona de segurança”. d) Retirar a amostra. 
e) Flambar novamente a boca do tubo de ensaio e fechá-lo. Transferir o inóculo para um tubo 
estéril, cuja boca também foi flambada. Aquecer a alça ou agulha utilizada novamente ao rubro, 
antes de recolocá-la na bancada. 
FONTE: Vermelho et al. (2015, p.24).
4.4 TÉCNICAS DE SEMEADURA EM MEIO MICROBIOLÓGICO
a. Semeadura em meio sólido inclinado (semeadura em estria): coletar, com a 
alça de platina a amostra do material e fazendo movimentos de ziguezague 
de baixo para cima, semear no ágar inclinado.
b. Semeadura em meio semissólido em tubo (semeadura em picada): coletar a 
amostra com o fio de platina e, com uma única picada, fincar o fio de platina 
a 2/3 de profundidade.
c. Semeadura em caldo: coletar a mostra com a alça, colocar no caldo e agitar 
para que as bactérias se desprendam da alça (Figura 3).
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FIGURA 3 – INOCULAÇÕES EM MEIOS DE CULTURA EM CALDO
FONTE: Hofling e Gonçalves (2008, p. 102).
d. Semeadura por esgotamento (Figura 4)
• Flambar a alça de platina na chama, até que toda a região esteja dourada, ou 
seja, estéril.
• Homogeneizar a amostra ou inóculo. 
• Esperar a alça esfriar, para não esterilizaro inóculo. Retirar o tampão do 
inóculo, e inserir a alça de platina. Retirar uma película de inóculo, sempre 
trabalhando próximo da chama.
• Colocar esta película sobre o ágar (PCA) e espalhar suavemente até o final da 
linha 1, não retirar a alça de platina até terminar de espalhar sobre a primeira 
linha.
• Flambar a alça de platina.
• Esperar a alça esfriar, para não esterilizar o inóculo.
• Puxar suavemente a inoculação feita sob a placa na linha 1, construindo a 
linha 2.
• Flambar a alça de platina.
• Esperar a alça esfriar, para não esterilizar o inóculo.
• Puxar suavemente a inoculação feita sob a placa na linha 2, construindo a 
linha 3.
• Sempre inocular próximo à chama, com os braços firmes. 
Essa técnica de semeadura por esgotamento também pode ser utilizada 
para semiquantificação do crescimento em placa (por microrganismo isolado).
1 Crescimento na área 1 = reportar como raras colônias.
2 Crescimento nas áreas 1 e 2 = reportar como algumas (poucas).
3 Crescimento nas áreas 1, 2 e 3 = reportar como numerosas (muitas) 
colônias.
ATENÇÃO: Não perfurar o ágar, controlar a mão para aplicar a alça de 
platina suavemente, procurando ocupar toda a superfície da placa.
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FIGURA 4 – TÉCNICA DA SEMEADURA POR ESGOTAMENTO PARA OBTENÇÃO DE CULTURA 
PURA
Legenda: a) Modo de espalhamento do inóculo, estrias. b) Aspecto da placa estriada após 
incubação. Notar a redução de colônias da primeira para as demais estrias.
FONTE: Vermelho et al. (2015, p.137).
e. Semeadura quantitativa com alça calibrada
 
As alças de inoculação calibradas para conter (0,01ou 0,001 ml de líquido) 
são imersas em uma amostra de urina não centrifugada. A alça é removida e 
todo o volume é colocado na superfície do meio de cultura, fazendo-se uma única 
estria através do centro. O inóculo é espalhado uniformemente em ângulo reto 
em relação à primeira estria.
f. Técnica de inoculação por profundidade - pour plate (Figura 5)
1. Homogeneizar o tubo 10-1.
2. Retirar com a pipeta estéril: 1 ml do inóculo (Tubo 10-1) e passar para a placa 
vazia (estéril).
3. Colocar o meio de cultura sobre o inóculo e homogeneizar lentamente em 
movimentos circulares 888.
4. Deixar solidificar até a temperatura alcançar 45 ºC (momento em que inicia a 
solidificação do meio de cultura).
5. Incubar as placas invertidas a 35 – 37 ºC, por 24 a 48 horas.
6. Ler os resultados.
g. Técnica de inoculação sobre a superfície (Figura 5)
1. Homogeneizar o tubo 10-1. 
2. Retirar com a pipeta estéril 0,1 ml de inóculo e colocar sob a placa com o meio 
de cultura. 
3. Flambar a alça de drigalski que está no álcool, e esperar até esfriar.
4. Colocar a alça de drigalski sobre o ágar de forma a espalhar o inóculo por 
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toda a superfície do meio, até que tudo tenha sido absorvido pelo meio.
5. Deixar em repouso por alguns minutos até a completa absorção do meio. 
Repetir o mesmo procedimento com as demais diluições.
6. Incubar as placas invertidas a 35 – 37 ºC, por 24 a 48 horas.
7. Ler os resultados.
FIGURA 5 – MÉTODOS DE PREPARAÇÃO DAS PLACAS PARA CONTAGEM
Legenda: a) Método de incorporação em placa, semeadura de profundidade. b) Método de 
espalhamento em placa, semeadura de superfície. 
FONTE: Tortora, Funke e Case (2017, p. 168).
4.5 PROCEDIMENTO PARA O PREPARO DAS DILUIÇÕES
1. Trabalhar sempre próximo da chama, para proteger a análise e não se 
contaminar.
2. Identificar os tubos de ensaio (10-1, 10-2...).
3. Homogeneizar a amostra.
4. Retirar 1 ml da amostra e passar para o tubo de ensaio contendo 9 ml de água 
peptonada. Com isso obtém-se a primeira diluição, 10-1. Descartar a pipeta.
5. Retirar 1 ml da diluição 10-1 e passar para o tubo de ensaio contendo 9 ml de 
água peptonada, sendo essa a próxima diluição 10-2 e assim sucessivamente. 
6. Em seguida inocular nas placas, utilizando as diluições adequadas e aplicando 
as duas técnicas: inoculação em superfície e em profundidade.
OBS: em determinadas situações a solução utilizada para a diluição das 
amostras pode ser tampão fosfato (PBS) ou solução salina (0,85% de NaCl).
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FIGURA 6 – DILUIÇÕES SERIADAS E CONTAGENS EM PLACAS
FONTE: Tortora, Funke e Case (2017, p.167).
5 INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS
Após aplicação das técnicas de semeadura, diluição e plaqueamento, 
incubar os tubos e as placas por 24 a 48 horas em estufas bacteriológicas para 
observar e registrar os resultados.
O importante nesta atividade prática é realizar as atividades propostas, as 
técnicas e as manobras assépticas. Após a incubação, fazer a leitura do crescimento 
microbiano no meio líquido e sólido.
Questões
a. Houve crescimento microbiano nos tubos de ensaio com meio de cultura 
líquido?
b. Como ficou a semeadura de esgotamento?
c. Como ficaram as placas com ágar PCA inoculadas com a amostra de leite após 
a diluição seriada utilizando o método de semeadura em profundidade? 
6 REFERÊNCIAS
HOFLING, J. F.; GONÇALVES, R. B. Microscopia de luz em microbiologia: 
morfologia bacteriana e fúngica. Porto Alegre: Artmed, 2008. [Minha Biblioteca]
VERMELHO, A. B. et al. Práticas de microbiologia. Rio de Janeiro: Guanabara 
Koogan, 2015.
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TORTORA, J. G., FUNKE, R. B., CASE, L. C. Microbiologia. 12. ed. Dados 
eletrônicos. Porto Alegre: Artmed, 2017. [Minha Biblioteca]
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PRÁTICA 3 – MICROBIOTA E HIGIENIZAÇÃO DE MÃOS
1 INTRODUÇÃO
A higienização das mãos (Figura 7) é considerada a ação isolada mais 
importante no controle de infecções em serviços de saúde. São consideradas 
as principais ferramentas dos profissionais que atuam nos serviços de saúde, 
pois é através delas que eles executam suas atividades. Assim, a segurança dos 
pacientes, nesses serviços, depende da higienização cuidadosa e frequente das 
mãos desses profissionais (BRASIL, 2009).
A utilização simples de água e sabão pode reduzir a população microbiana 
presente nas mãos e, na maioria das vezes, interromper a cadeia de transmissão de 
doenças. A aplicação de produtos antissépticos, em especial de agentes com base 
alcoólica, pode reduzir ainda mais os riscos de transmissão, pela intensificação da 
redução microbiana ou por favorecer um aumento na frequência de higienização 
das mãos (BRASIL, 2009).
Uma das opções de meios de cultura indicado para realizar a atividade 
prática sobre higienização das mãos é o Ágar Sal Manitol, pois possibilita 
a verificação do crescimento de bactérias Gram-positivas e diferencia o 
Staphylococcus aureus através da fermentação do manitol produzindo colônias 
amarelas com zonas amarelas. A maioria das espécies coagulase-negativas de 
Staphylococcus e Micrococcus não fermentam manitol e crescem como pequenas 
colônias vermelhas rodeadas de zonas vermelhas ou lilás. A cor das colônias e 
do meio é devido à reatividade do vermelho fenol com o pH do meio, vermelho 
fenol é vermelho em pH 8,4 e amarelo a 6,8 (OPLUSTIL et al., 2010).
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FIGURA 7 – HIGIENIZAÇÃO SIMPLES DAS MÃOS
FONTE: Brasil (2009, p.60).
A utilização do ágar sangue para observar o crescimento da microbiota 
humana é indicado por ser um meio de cultura rico em nutrientes e diferencial 
possibilitando o crescimento de grande parte dos microrganismos e ainda a 
observação da hemólise. 
Através da presença de hemólise no ágar sangue, é possível classificar as 
bactérias em: 
a. beta-hemólise: ocorre a Lise total dos eritrócitos e a formação de halo de 
transparência ao redor e/ou sob a colônia. Alguns exemplos de bactérias: 
Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Listeria, Staphylococcus 
aureus, Staphylococcus haemolyticcus;
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b. alfa-hemólise: ocorre a Lise parcial dos eritrócitos, há formação de halo 
com coloração esverdeada. Alguns exemplos de bactérias: Streptococcus 
pneumoniae, Enterococcus; 
c. gama-hemólise: ausência de Lise dos eritrócitos, meio de cultura inalterado. 
Alguns exemplos de bactérias: Estafilococos coagulase-negativo.
2 OBJETIVOS
• Realizar a higienização das mãos de acordo com as recomendações da Anvisa.
• Testar diferentes antissépticos utilizados para higienizar as mãos.
• Entender o processo de higienização das mãos e o fenômeno de redução da 
microbiota da pele por meio do experimento.
• Conhecer a microbiota da boca, fossas nasais, cabelo etc. 
• Realizar a coleta com swab de microrganismos da microbiota humana.
• Visualizar a morfologia colonial. 
• Visualizar a fermentação do sal manitol.
• Classificar a hemólise no ágar sangue.
• Realizar semeadura de esgotamento para purificar as culturas.
3 MATERIAIS
• Equipamentos: autoclave, estufa 35 a 37 ºC.
• Reagentes: coloração de Gram.
• Meios de cultura: 
• Ágar sangue – 1 placa por grupo.
• Ágar Sal Manitol – 1 placa por grupo.
• Degermantes: Álcool etílico 70%, clorhexidina a 2%, sabonetes líquidos.
• Swabs (semelhante a um cotonete comum) – 2 a 3 por aluno.
• Tubos de ensaio com 9 ml de água peptonada tamponada 0,1% – 1 por grupo.
• Controles positivos para facilitar a leitura.
Semeadura em esgotamento: 
a. ÁGAR SANGUE: Stapylococcus aureus; Staphylococcus epidermidis. 
b. SAL MANITOL: Staphylococcus aureus.
4 PROCEDIMENTOS
Será realizada a avaliação quantitativa nas amostras das mãos. O 
procedimento será realizado através da impressão digital dos dedos de uma das 
mãos na superfície do meio de cultura Ágar Sal Manitol. As placas serão incubadas 
a 35 a 37 ºC, por 24 a 48h. Esse método será aplicado antes da higienização com o 
tratamento e será repetido após a higienização das mãos. 
Para avaliação da microbiota será coletado amostras das fossas nasais 
e boca através da fricção do swab, submetendo-o em seguida à técnica de 
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estriamento em placa no meio de cultura Ágar Sangue. As placas serão incubadas 
a 35 a 37 ºC, por 24 a 48h. Esse procedimento será realizado para verificar se o 
universitário é ou não portador da bactéria Staphylococcus spp.
5 INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS
a. Preencher os Quadros 1 e 2 e realizar uma discussão dos resultados obtidos. 
QUADRO 1 – RESULTADOS DO EXPERIMENTO SOBRE HIGIENIZAÇÃO DAS MÃOS
Densidade 
microbiana
Mão sem 
higienizar
Mão
 higienizada
Antisséptico 
utilizados
Fermentação 
do manitol
Sem 
crescimento
Crescimento 
reduzido
Crescimento 
elevado
FONTE: A autora
QUADRO 2 – RESULTADOS DO EXPERIMENTO SOBRE MICROBIOTA NO MEIO DE CULTURA 
ÁGAR SANGUE
Densidade 
microbiana
Sem crescimento Crescimento 
reduzido
Crescimento 
elevado
Hemólise
Boca
Fossas nasais
Cabelo
Etc.
FONTE: A autora
b. A higienização foi eficiente na redução dos microrganismos presentes nas 
mãos?
c. Qual produto antisséptico apresentou melhor resultado?
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FIGURA 8 – PLACAS DE ÁGAR SANGUE E SAL MANITOL UTILIZADAS NA PRÁTICA DE 
MICROBIOTA E HIGIENIZAÇÃO DE MÃOS
Legenda: 1ª placa – ágar sangue – microbiota humana; 2ª placa - ágar sal manitol - colônias 
não fermentadoras de manitol; 3ª placa - ágar sal manitol - colônias amarelas demonstram a 
fermentação do manitol. 
FONTE: A autora
6 REFERÊNCIAS
BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Segurança do paciente em 
Serviços de Saúde: higienização das mãos / Agência Nacional de Vigilância 
Sanitária. Brasília: Anvisa, 2009. 105 p.
OPLUSTIL, C. P. et al. Procedimentos básicos em microbiologia clínica. 3. ed. São 
Paulo: Sarvier, 2010 PRÁTICA 4 – COLORAÇÃO DE GRA.
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PRÁTICA 4 – COLORAÇÃO DE GRAM
1 INTRODUÇÃO 
As bactérias apresentam formas típicas que são importantes para a sua 
identificação. As formas principais são esféricas (cocos), cilíndricos ou na forma 
de bastonetes (bacilos), encurvados (espirilos) e na forma de vírgula (vibriões). 
Uma estrutura rígida, denominada parede celular, confere aos microrganismos a 
sua forma original (HOFLING; GONÇALVES, 2008). 
Para a familiarização com essas formas bacterianas, preparados de amostras 
fixados e corados tornam-se um material adequado para essas observações. Assim, 
faz-se necessário colorir as células, já́ que estas são normalmente incolores.
2 OBJETIVOS
• Realizar a coloração de Gram.
• Identificar os principais tipos morfológicos de bactérias.
• Discutir a importância da coloração de Gram na identificação de 
microrganismos.
• Entender e observar que as colorações são um recurso fundamental para o 
reconhecimento dos diversos tipos morfológicos microbianos.
3 MATERIAIS
• Lâminas limpas.
• Suporte para lâminas.
• Óleo de imersão.
• Microscópio óptico.
• Solução salina ou água destilada estéril.
• Lápis para vidro ou etiquetas apropriadas. 
• Alças de Henle ou alças descartáveis (descartar adequadamente).
• Bateria para Gram – reagentes: cristal violeta, Lugol, etanol 95%, safranina ou 
• Lâminas prontas com fucsina. Bactérias Gram-positivas (Staphylococcus 
aureus, Bacillus subtilis) e Gram-negativas (Escherichia coli, Pseudomonas 
aeruginosa).
• Culturas de bactérias em meio líquido ou sólido.
4 PROCEDIMENTOS
4.1 PREPARAÇÃO DO ESFREGAÇO
• Usar uma lâmina de microscópio apropriada, limpa e desengordurada.
• Fazer a identificação da lâmina.
• Colocar uma gota de água salina ou água destilada estéril.
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• Espalhar uma colônia sobre a água com movimentos de rotação da alça ou 
do swab (semelhante a um cotonete comum), a fim de se obter um esfregaço 
(espalhamento) de forma oval, fino e uniforme).
• Deixar secar à temperatura ambiente ou flambar, passando lentamente a 
lâmina sobre chama do bico de Bunsen três vezes.
• Fazer um esfregaço bem homogêneo, fixar pelo calor ou à temperatura 
ambiente e esperar esfriar. Corar com os corantes apropriados.
4.2 COLORAÇÃO DE GRAM
• Cobrir com o corante cristal violeta e deixar agir por um minuto.
• Lavar rapidamente com água.
• Cobrir com solução de lugol por um minuto.
• Lavar com água corrente.
• Descorar pelo álcool absoluto por aproximadamente 15 segundos.
• Corar com fucsina ou safranina por 30 ou 40 segundos.
• Lavar com água, secar. 
4.3 OBSERVAÇÃO NO MICROSCÓPIO
• Colocar a lâmina sobre a mesa de platina do microscópio.
• Localizar as bactérias no esfregaço corado iniciando com o aumento de 40x.
• Após esse passo, depositar uma gota de óleo de imersão apropriado sobre a 
lâmina e observar com a objetiva de imersão (1000x).
• Registrar as formas celulares observadas.
FIGURA 9 – COLORAÇÃO DE GRAM
Legenda: a) Procedimento. (b) Microfotografia de bactérias coradas pela coloração de Gram. 
Os cocos (em púrpura, roxo) são gram-positivos, e os bastonetes (em cor de rosa) são gram-
negativos.
FONTE: Tortora, Funke e Case (2017, p. 65). 5 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
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5 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
1. Como se prepara um esfregaço a partir de uma cultura bacteriana?
2. Qual é a finalidade da coloração de Gram? 
3. Registre através de um desenho as estruturas celulares observadas: forma e 
arranjo celular e qual o Gram.
REFERÊNCIAS
HOFLING, J. F.; GONÇALVES, R. B. Microscopia de luz em microbiologia: 
morfologia bacteriana e fúngica. Porto Alegre: Artmed, 2008. [Minha Biblioteca]
VERMELHO, A. B. et al. Práticas de microbiologia. Rio de Janeiro: Guanabara 
Koogan, 2015.
TORTORA, J. G., FUNKE, R. B., CASE, L. C. Microbiologia. 12. ed. Dados 
eletrônicos. PortoAlegre: Artmed, 2017. [Minha Biblioteca].
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PRÁTICA 5 – ANÁLISE DE SUPERFÍCIES DE EQUIPAMENTOS 
OU UTENSÍLIOS
1 INTRODUÇÃO 
A técnica do esfregaço de superfície aplica-se aos alimentos cuja 
contaminação é predominantemente superficial, como carcaças de bovinos, 
suínos, aves e peixes, e também à análise de superfícies de equipamentos, 
mesas, utensílios e embalagens (SILVA et al., 2017). 
O esfregaço pode ser feito com “swabs” estéreis ou, se a área amostrada for 
grande, com esponjas estéreis. Esse material pode ser adquirido em embalagens 
individuais, estéreis. As esponjas podem ser substituídas por tampões de algodão 
estéreis, preparados no laboratório. Os “swabs” também podem ser preparados no 
laboratório, com hastes de madeira de aproximadamente 15 cm de comprimento 
por 3 mm de diâmetro e a parte absorvente em algodão com aproximadamente 2 
cm de comprimento por 5 mm de diâmetro (SILVA et al., 2017).
2 OBJETIVOS
• Fazer a coleta em superfícies com o swab. 
• Realizar a diluição da amostra.
• Realizar a semeadura de superfície em ágar MacConkey e PCA. 
• Visualizar a morfologia colonial e a fermentação da lactose. 
• Realizar a contagem total dos microrganismos aeróbios mesófilos no meio de 
PCA e apresentar os valores em UFC/cm2. 
3 MATERIAIS (materiais para 1 grupo)
• 1 Autoclave, estufa35 a 37 ºC.
• 1 molde com dimensões de 10 cm x 10 cm (100 cm2). Pode ser de papel.
• 1 tesoura.
• 1 Swab (semelhante a um cotonete comum).
• 1 alça de Drigalski.
• 1 micropipetadores de 100 ul, ponteiras estéreis. 
• 1 placa de ágar MacConkey. 
• 1 placa ágar para contagem total – PCA. 
• 1 tubo de ensaio com 10 mL de água peptonada 0,1%.
4 PROCEDIMENTOS 
A área de coleta deve ser delimitada utilizando um molde estéril, que 
também deve ser aberto assepticamente, com dimensões de 10 cm x 10 cm (100 
cm2). Para coletas com uso de swab, proceder a amostragem abrindo o invólucro 
contendo o swab e segurando-o sempre pelo cabo sem tocar a ponta que procederá 
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à coleta (SILVA et al., 2017). 
Umedecer a ponta do mesmo na solução e retirar o excesso comprimindo 
a ponta do swab contra as paredes do frasco ou tubo com movimentos giratórios. 
Segurar o swab em ângulo de 30º ao colocá-lo em contato com a superfície 
a ser amostrada. O swab deve ser friccionado com pressão, com a superfície teste, 
vinte vezes na forma “zigue-zague”, nos sentidos das diagonais, na área de coleta 
da superfície. Deve-se rodar continuamente o swab, para que toda a superfície do 
algodão entre em contato com a amostra (SILVA et al., 2017). 
Após amostrado, quebre o cabo do swab de modo a retirar a parte que for 
tocada com a mão e mantenha-o dentro do tubo com a solução, encaminhando 
para o laboratório em gelo ou outro agente refrigerante entre 1 a 4 ºC, tão logo seja 
possível, preferentemente dentro de 4 horas. As amostras podem ser mantidas 
sob refrigeração entre 2 a 8 ºC por um período não superior a 24 horas. 
Em seguida, os swabs devem ser transferidos para tubos de ensaio 
contendo 10 ml de solução tampão com neutralizante (que acompanha o swab). 
 
O material coletado será transferido para tubos de ensaio contendo 10 
ml de água peptonada a 0,1%. Em seguida, realizar as diluições e semeadura em 
superfície para os meios de cultura Ágar PCA e Ágar McConkey. 
As placas serão incubadas de 35 ºC a 37 ºC durante 48 horas. Após a 
contagem das colônias, os resultados serão expressos em UFC/cm². 
 
Após a incubação observar a morfologia colonial, fermentação ou não 
da lactose no Ágar MacConkey, e realizar a contagem total dos microrganismos 
aeróbios mesófilos no meio de PCA. 
 
A análise dos resultados será realizada de acordo com os padrões de 
contaminação microbiana estabelecidos pela APHA (1998), que determina 
contagens inferiores a 100 UFC/utensílio para microrganismos aeróbios mesófilos 
e coliformes totais, além da ausência de bactérias patogênicas.
Regras para contagem das colônias e cálculo dos resultados (SILVA et 
al., 2017).
1. Seguir as regras de contagem.
2. Analisar todas as diluições.
3. Selecionar as diluições que apresentem entre 25 e 250 colônias Unidades 
Formadoras de Colônia. Caso não haja nenhuma diluição que apresente 
contagens entre esses valores seguir as regras seguintes.
a. ↑ 250 UFC/ml: quatro alternativas – Apresentar valores estimados
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1. Contar todas as colônias: caso não seja possível contar por quadrados.
2. ↓ 10 no quadrado, contar 12 quadrados: 6 horizontais; 6 verticais = tirar a 
média e multiplicar pela área da placa.
3. 10 no quadrado, contar 4 quadrados representativos da distribuição de 
colônias;
4. 100 no quadrado, apresentar o resultado com maior que 6.500/diluição. (65 
cm2 área placa de petri).
b. Nenhuma placa atingiu 25 colônias
Contar o número mais próximo de 25, e apresentar o resultado como 
contagem estimada (est.) Ex.: 10-1 = 13 10-2 =2 10-3 = 1 1,3 X10 2 
UFC/ml estimado. 
c. Nenhuma placa com crescimento
Representar o resultado com a menor diluição. Exemplo: < 10 (est). 
 
d. Placas em duplicata, uma com 25-250 colônias e outra com menos de 25 ou 
mais de 250
Considerar ambas as placas, calcular a média. 
e. Duas diluições consecutivas entre 25-250
Calcular a UFC de cada diluição.
Se um dos resultados for maior do que dobro do outro, considere apenas 
o valor menor. Se um dos resultados não ultrapassar o dobro do outro, então 
considere ambos os resultados, apresentando a média dos resultados como 
resultado final.
5 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
a. Foi avaliado no laboratório do Polo da Uniasselvi, uma amostra da 
superfície de uma mesa para contagem total de mesófilos viáveis. A amostra 
corresponde a uma área de 100 cm2 e o swab foi suspendido em 10 ml do 
diluente. A semeadura foi realizada em duplicata colocando 1 ml em cada 
placa. Os resultados da contagem nas placas de PCA apresentaram valores 
de 230 e 228. Apresente de forma correta o resultado final da análise de 
contagem total de mesófilos.
6 REFERÊNCIAS 
APHA (AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION). Standard Methods for 
Examination of Water and Wastewater. 20. ed. Washington, DC: APHA, Water 
Environment Federation, 1998. 
ANDRADE, N. J. Metodologias para avaliar condições higiênicas de ambientes 
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28
de processamento de alimentos. In: XIII Congresso Brasileiro de Microbiologia, 
2005. 
SILVA, N. da et al. Manual de métodos de análise microbiológica de 
alimentos e água. 5. ed. São Paulo: Blucher, 2017.
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29
PRÁTICA 6 – CONTAGEM TOTAL DE MESÓFILOS DE 
AMOSTRAS DE ALIMENTOS
1 INTRODUÇÃO
A análise microbiológica de alimentos é predominantemente cultural, 
objetivando a detecção ou a enumeração de microrganismos vivos. Pode ser 
de dois tipos: ensaios qualitativos, que verificam a presença ou ausência do(s) 
microrganismo(s)-alvo em uma dada quantidade da amostra, sem quantificar, 
e ensaios quantitativos, que determinam a quantidade do(s) microrganismo(s)-
alvo na amostra, geralmente por unidade de massa ou volume (SILVA et al., 2017). 
A contagem padrão em placas é utilizada tanto para a quantificação de 
grandes grupos microbianos como os aeróbios mesófilos, os aeróbios psicrotróficos, 
os bolores e leveduras, os clostrídios sulfito redutores, os enterococos e as 
bactérias lácticas, como também para gêneros e espécies em particular, como 
Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Clostridium perfringens (SILVA et al., 
2017). 
A contagem em placa de bactérias aeróbias mesófilas indica a qualidade 
sanitária do alimento. Mesmo com a ausênciade patógenos e alterações químicas 
e sensoriais no alimento, uma contagem elevada indica que o alimento é insalubre 
(FRANCO; LANDGRAF, 2005). 
 
 Exceção dada aos alimentos fermentados (108 UFC/g). Sinais visíveis 
de deterioração são detectados quando a população bacteriana atinge valores 
superiores a 106 UFC/g no alimento (FRANCO; LANDGRAF, 2005).
2 OBJETIVOS
• Realizar o ensaio para quantificação total de mesófilos aeróbios viáveis em 
uma amostra (torta de frutas ou carne moída) de alimento.
• Aplicar a técnica de semeadura e profundidade.
• Realizar a contagem total de colônias e apresentar o resultado em UFC/g ou 
ml de acordo com a regras de contagem.
• Conhecer a qualidade higiênico-sanitária do alimento.
3 MATERIAIS 
• Meios de cultura: água peptonada tampanada 0,1%; ágar padrão para 
contagem – PCA.
• Equipamentos e vidrarias: para uma amostra de alimento (25 g de alimento – 
amostra analítica).
• Autoclave.
• Homogeneizador de alimentos.
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• Contador de colônias.
• 1 Embalagem estéril (usada no homogeneizador de alimentos).
• Estufa bacteriológica – temperatura 35 ºC a 37 ºC. 
• 1 balança. 
• 1 Erlenmyer com capacidade para 500 ml com 225 ml de água peptonada 
tamponada 0,1%.
• 3 tubos de ensaio com 9 ml de água peptonada tampanada 0,1%.
• 3 pipetas graduadas com capacidade máxima de 10 ml.
• Talheres estéreis – kit: garfo, faca, colher.
• 3 placas de petri estéreis.
4 PROCEDIMENTO DA PRÁTICA
O esquema geral de análise para contagem total de aeróbios mesófilos em 
alimentos usando o método de plaqueamento está apresentado na Figura 9.
A análise de contagem total de microrganismos mesófilos aeróbios viáveis 
em alimentos é realizada através da pesagem, diluição da amostra, plaqueamento 
em profundidade (apresentada na Prática 2) no meio de cultura Ágar Padrão para 
Contagem- PCA, contagem das colônias típicas. 
A partir das diluições, serão inoculadas as placas de petri estéreis e 
vazias e após será realizada a adição do meio de cultura PCA. Verter nas placas 
inoculadas, 12 a 15 ml de PCA, previamente fundido, esterilizado em autoclave e 
resfriado a 44-46 oC e banho maria. 
Após a solidificação do ágar as placas com os meios de cultura serão 
incubadas de 35 a 37º C por 48 horas. Após esse período será realizada a contagem 
das colônias e os resultados serão apresentados em UFC/g ou ml do alimento. 
FIGURA 10 – ESQUEMA GERAL DE ANÁLISE PARA CONTAGEM TOTAL DE AERÓBIOS 
MESÓFILOS EM ALIMENTOS USANDO O MÉTODO DE PLAQUEAMENTO
FONTE: Silva et al. (2017, p. 78).
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5 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
a. Para a contagem, selecionar as placas com número de colônias entre 25 e 250 
(10 a 150 no caso da contagem de bolores e leveduras). Contar as colônias com 
o auxílio da lupa de um contador de colônias, para facilitar a visualização. 
b. Relatar se amostra de alimento analisada apresenta valores esperados com 
relação à quantidade de microrganismos mesófilos viáveis.
FIGURA 11 – PLACA DE ÁGAR PCA COM CRESCIMENO DE BACTÉRIAS MESÓFILAS PARA 
REALIZAR CONTAGEM NO CONTADOR DE COLÔNIAS
FONTE: A autora
6 REFERÊNCIAS
FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos alimentos. São Paulo: 
Atheneu, 2005. 
SILVA, N. da et al. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos e 
água. 5. ed. São Paulo: Blucher, 2017.
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PRÁTICA 7 – ANÁLISE DE ALIMENTOS COLIFORMES 
TOTAIS E TERMOTOLERANTES EM ALIMENTOS
1 INTRODUÇÃO 
O método clássico de contagem de coliformes totais, termotolerantes e 
E. coli em água e alimentos é o Número Mais Provável – NMP –, que inclui as 
seguintes etapas:
a. Teste Presuntivo – formação de gás e ácido no meio de cultura caldo lauril 
sulfato triptose – LST.
b. Confirmação de coliformes totais e termotolerantes – produção de gás no 
meios caldo verde brilhante bile 2% - VB e caldo E.coli – EC, respectivamente, 
coliforme total e termotolerante.
c. Cálculo dos resultados – anotar o número de tubos com crescimento e produção 
de gás, confirmativos da presença de coliformes totais e termotolerantes e 
determinar o Número Mais Provável (NMP)/g ou ml usando uma tabela de 
NMP (SILVA et al., 2017).
2 OBJETIVOS
• Quantificar coliformes totais e termotolerante em amostras de alimentos.
• Comparar os resultados com a legislação vigente.
3 MATERIAIS
Meios de cultura: água peptonada tampanada 0,1%; Caldo Lauril Sulfato 
Triptose – LST; Caldo Verde Brilhante Bile – VB; Caldo Escherichia coli – EC. 
Equipamentos e vidrarias: para uma amostra de alimento.
• Autoclave.
• Homogeneizador de alimentos.
• Estufa bacteriológica – temperatura 35 ºC a 37 ºC. 
• Banho-maria – 44,5 ºC.
• 1 balança. 
• 1 Erlenmyer com capacidade para 500 ml.
• 30 tubos de ensaio com capacidade para no mínimo 10 ml, com tampa. 
• 27 tubos de durhan.
• 1 alça de Henle ou de platina ou ainda de semeadura.
• 3 pipetas graduadas com capacidade máxima de 10 ml.
4 PROCEDIMENTOS
O esquema geral de análise de coliformes será realizada de acordo com a 
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descrição da Figura 10.
1. Trabalhar sempre próximo da chama, para proteger a análise e não se 
contaminar.
2. Homogeneizar e diluir a amostra. 
Retirar 25 ml ou g da amostra e colocar em um erlenmeyer contendo 225 
ml de água peptonada 0,1%. Com isso, obtém-se a primeira diluição. Em seguida, 
retirar 1 ml da diluição 10-1 e passar para o tubo de ensaio contendo 9 ml de água 
peptonada, sendo essa a próxima diluição:10-2, e assim sucessivamente até obter 
a diluição desejada.
3. Inoculação – Presuntivo: selecionar três diluições adequadas da amostra 
e, com uma pipeta de, no máximo, 10 ml, inocular uma série de três tubos 
de Caldo Lauril Sulfato Triptose – LST por diluição, adicionando 1,0 ml da 
diluição por tubo com 6 a 8 ml de LST.
4. Incubação: incubar os tubos de LST a 35 °C por 24 horas e observar se há 
crescimento com produção de gás. Em caso positivo, passar aos itens 
subsequentes. Em caso negativo, reincubar até completar 48 horas e repetir a 
leitura, passando aos itens subsequentes.
5. Confirmação de coliformes totais termotolerantes: observar os tubos de LST 
com produção de gás e transferir uma alçada bem carregada de cada cultura 
para tubos de caldo verde brilhante bile 2% – VB e incubar na estufa 35 ºC. 
Fazer o mesmo procedimento com o Caldo E. coli – EC e incubar em banho-
maria a 44,5 °C por 24 horas e observar se há crescimento com produção de 
gás. 
6. Anotar o número de tubos de VB e EC com produção de gás, confirmativo da 
presença de coliformes totais e termotolerantes e determinar o NMP/ml na 
tabela correspondente. 
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FIGURA 12 – ESQUEMA DE ANÁLISE DE COLIFORMES TOTAIS E TERMOTOLERANTES EM 
ALIMENTOS PELO MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVE
FONTE: Silva et al. (2017, p. 122).
5 INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS 
A combinação de tubos positivos e negativos na técnica do NMP permite 
estimar, por cálculo de probabilidade, a densidade do(s) microrganismo(s)-alvo 
na amostra. Os valores já foram calculados e tabulados em tabelas de NMP, não 
sendo necessário o uso de fórmulas, somente buscar o resultado na tabela (Figura 
13). 
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FIGURA 13 – NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP) E INTERVALO DE CONFIANÇA A NÍVEL DE 95% 
DE PROBABILIDADE, PARA DIVERSAS COMBINAÇÕES DE TUBOS POSITIVOS EM SÉRIE DE TRÊS 
TUBOS. QUANTIDADE INOCULADA DA AMOSTRA: 0,1 - 0,01 E 0,001 G OU ML
FONTE: Silva et al. (2017, p. 59).
Questões
a. Registrar os tubos de ensaio com formação de gás no tubo de Durhan e 
consultar a Tabela de NMP para apresentar o resultado.
b. Consultar a legislaçãovigente (RDC12/2001) e verificar se o alimento está 
adequado para o consumo.
6 REFERÊNCIAS 
BRASIL. Resolução RDC nº 12, de 2 de janeiro de 2001. Regulamento Técnico 
sobre padrões microbiológicos para alimentos. Brasília, DF: Anvisa, 2001.
SILVA, N. da et al. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos e 
água. 5. ed. São Paulo: Blucher, 2017.
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PRÁTICA 8 – MORFOLOGIA E ESTRUTURA DOS FUNGOS
1 INTRODUÇÃO
 
A identificação da maioria das espécies fúngicas é realizada considerando-
se suas variadas características morfológicas. Os fungos incluem, basicamente, as 
leveduras, os bolores ou mofos, que são fungos microscópicos, e os cogumelos, 
que são considerados fungos superiores, macroscópicos (ZAITZ, 2010). 
Os fungos são organismos não fotossintéticos que podem apresentar uma 
forma filamentosa, pluricelular (bolores – fungos filamentosos) ou unicelular 
(leveduras). Alguns fungos podem ser dimórficos, apresentando uma estrutura 
micelial ou unicelular dependendo das condições do meio (ZAITZ, 2010). 
Os fungos que são dispersos pelo ar atmosférico, possuindo capacidade 
de colonizar habitats e substratos de forma eficiente, são denominados fungos 
anemófilos. São encontrados na forma de esporos que quando inalados podem 
causar algum tipo de patologia no ser humano (ZAITZ, 2010). 
Os fungos anemófilos, além de serem importantes como contaminantes 
de substratos diversos, o conhecimento desses fungos interessa a várias áreas da 
medicina humana, principalmente como desencadeantes de alergias respiratórias, 
asma brônquica e rinites alérgicas e, eventualmente, como agentes primários de 
lesões oculares, otites, onicomicoses, entre outras micoses (ZAITZ, 2010).
2 OBJETIVOS
• Coletar fungos anemófilos de ambientes internos e externos.
• Observar das estruturas de vários fungos – hifas, micélio, células e estruturas 
de reprodução.
3 MATERIAIS
• autoclave;
• estufa 30 ºC;
• balança;
• alça em forma de L;
• fita adesiva;
• microscópio; 
• lâminas e lamínulas;
• azul de algodão ou lactofenol;
• placas de petri;
• meio de cultura ágar batata dextrose ou ágar sabouraund com clorofenicol.
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4 PROCEDIMENTOS
• Preparar o meio de cultura ágar batata dextrose ou ágar sabouraund com 
clorofenicol.
• Esterilizar em autoclave e dispensar nas placas de petri.
• Expor as placas com 20 ml de meio de cultura nos locais escolhidos (ambientes 
internos e externos). 
• Colocar as placas abertas, a uma altura de 90 cm durante 20 minutos.
• Incubar as placas fechadas em estufas com a temperatura regulada para 30 ºC 
no período de 3 a 5 dias.
• Após o período de incubação, realizar a contagem do número total de Unidades 
Formadoras de Colônias – UFC – e a relação da contaminação interior e 
exterior (I/E). A determinação da I/E foi realizada através da metodologia da 
ANVISA (BRASIL, 2003). 
• Determinar os gêneros dos fungos através de análises macroscópicas, 
observando a pigmentação, textura, consistência e forma do verso e reverso 
das colônias desenvolvidas in vitro. 
• Para análise microscópica dos gêneros realizar o microcultivo ou análise 
com fita adesiva para observar estruturas como micélio, conídios e esporos 
conforme metodologia de Lacaz (1998).
TÉCNICA DE MICROCULTIVO PARA FUNGOS FILAMEN-
TOSOS (ANVISA, 2004) 
• Colocar sobre uma lâmina esterilizada, contida em uma placa de Petri estéril, 
um cubo de ágar: ágar batata dextrose ou ágar sabouraund com clorofenicol.
• A lâmina deve estar sobre um suporte, que pode ser formado por outra lâmina, 
ou um pequeno bastão de vidro recurvado, ou ainda, dois palitos de fósforo.
• Semear o fungo, a partir de repique recente, nos 4 lados do cubo de ágar. 
• Recobrir com uma lamínula esterilizada. 
• Fazer uma câmara úmida, adicionando 1 a 2 ml de água destilada estéril no 
fundo da placa ou embeber um pequeno chumaço de algodão estéril, para 
evitar a dessecação do meio de cultura, durante o crescimento do fungo. 
• Tampar a placa e deixar à temperatura ambiente por 7 a 10 dias, até que se 
observe desenvolvimento de hifas com ou sem pigmentação. 
• Após esse período, inativar a esporulação, adicionando 1 ml de formol ao 
algodão e vedando a placa com fita adesiva durante 24h-48h. O vapor 
de formol, além de inativar o fungo, auxiliará na fixação das estruturas 
microscópicas. 
• Retirar a lamínula com auxílio de uma pinça, cuidadosamente, uma vez que 
nela deverão estar aderidas as hifas e esporos do fungo. 
• Pingar uma gota de corante azul de lactofenol-algodão (“Cotton Blue”) e 
montar sobre uma lâmina. 
• Desprezar o cubo de ágar e, em seu lugar, pingar outra gota de corante azul 
e recobrir com lamínula, para visualizar esporos e hifas também aderidos à 
lâmina. 
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• Observar em microscópio ótico com objetiva de 40 X, o tipo e cor da hifa, 
forma disposição e formação de esporos. 
FIGURA 14 – TÉCNICA DE MICROCULTIVO PARA ANÁLISE MICROSCÓPICA DE FUNGOS 
FILAMENTOSOS FONTE: Anvisa (2004, p. 17).
SUGESTÃO DE CARACTERÍTICAS PARA IDENTIFICAÇÃO MACROMORFOLÓGICA DOS FUNGOS 
As observações têm por finalidade orientá-lo na verificação das principais 
características macromorfológicas que deverão ser registradas. Entretanto, não 
significa que a colônia que você deseja identificar tenha todos os itens descritos 
anteriormente, e, além disso, para cada item poderá ser observada mais de uma 
característica (por exemplo: a superfície de uma colônia poderá ser ao mesmo 
tempo: lisa, pastosa e brilhante).
1. Micélio (aspecto macroscópico):
( ) leveduriforme (levedura); 
( ) filamentoso (bolor);
( ) aéreo ( o que se projeta acima do meio de cultura); 
( ) rasteiro (o que cresce sobre ou abaixo do meio de cultura).
2. Cor da colônia: 
3. Presença de pigmento: (reverso da colônia – verso da placa) 
4. Bordos: ( ) inteiro ( ) franjado ( ) liso ( ) ondulado ( ) encrespado ( ) arredondado
5. Superfície: ( ) lisa ( ) rugosa ( ) cerebriforme ( ) coriácea ( ) algodonosa
( ) mucoide ( ) cremosa ( ) concêntrica ( ) opaca ( ) aveludada
( ) brilhante ( ) pulverulenta ( ) pastosa
6. Sulcos: ( ) presentes ( ) ausentes
7. Tipo: ( ) seca ( ) úmida
8. Protuberância central: ( ) presente ( ) ausente
9. Elevação: ( ) achatada ( ) levantada ( ) amontoada
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10. Reverso da colônia: 
11. Morfologia colonial final após a identificação:
5 INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS
a. Realizar a contagem de fungos anemófilos (bolores e leveduras) presentes 
na placa após a exposição ao ambiente e incubação em estufa. 
b. Registrar todos os resultados da contagem de fungos anemófilos no quadro 
e observar os locais que apresentam a maior e a menor contaminação por 
fungos. Identificar qual o local que apresenta maior diversidade de fungos.
c. Visualizar as principais estruturas microscópicas dos fungos através do 
microcultivo.
FIGURA 15 – MICROSCOPIA DE ALGUNS FUNGOS CONTAMINANTES FREQUENTES NO BRASIL 
Legenda: A. Alternaria. B. Aspergillus. C. Cladosporium. D. Curvularia. E. Epicoccum. F. Fusarium. 
G. Penicillium. H. Nigrospora. I. Rhizopus.
FONTE: Zaitz (2010).
6 REFERÊNCIAS 
ANVISA. Detecção e identificação dos fungos de importância médica. Módulo 
VII. 2004. Disponível em: http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/microbiologia/
mod_7_2004.pdf Acesso em: 9 ago. 2011. 
BRASIL. Resolução RE nº 9 de 16 de janeiro de 2003. Organização nacional de 
vigilância sanitária. Padrões referenciais de qualidade do ar interior em ambientes 
climatizados artificialmente de uso público e coletivo. Disponível em: http://zip.
http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/microbiologia/mod_7_2004.pdf
http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/microbiologia/mod_7_2004.pdf
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net/bwtJtl. Acesso em: 25 fev. 2017. 
LACAZ, C. S. da. et al. Guia para identificação: fungos, actinomicetos, algas de 
interesse médico. São Paulo: Sarvier, 1998.
ZAITZ, C. Compêndio de micologia médica. Rio de Janeiro: Guanabara, 2010.
MINAMI, P. S. Micologia: métodos laboratoriais de diagnóstico das micoses. São 
Paulo: Manole, 2003.
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PRÁTICA 9 – MÉTODO HOFFMAN
1 INTRODUÇÃO
O exame parasitológico de fezes – EPF – tem como objetivo diagnosticar 
os parasitos intestinais, através da pesquisa das formas parasitárias que são 
eliminadas nas fezes. 
O exame macroscópico permite a verificação da consistência das fezes, do 
odor, da presença de elementos anormais, como muco ou sangue, e de vermes 
adultos ou partes deles. O exame microscópico permite a visualização dos ovos 
ou larvas de helmintos, cistos, trofozoítos ou oocistos de protozoários (NEVES, 
2011). 
Os métodos quantitativos realizam a contagem dos ovos nas fezes, 
permitindo, assim, avaliar a intensidade do parasitismo. Exemplos: método de 
Stoll-Hausheer e Kato-Katz (NEVES, 2011). 
Os métodos qualitativos são os mais utilizados que os métodos 
quantitativos e demonstram a presença das formas parasitárias. 
Muitas vezes o número de formas parasitárias eliminadas com as fezes é 
pequeno, havendo necessidade de recorrer a processos de enriquecimento para 
concentrá-las (NEVES, 2011). 
De acordo com Neves (2011), os principais processos de enriquecimento 
são: 
a. sedimentação espontânea: método de Hoffman, Pons e Janer, também 
conhecido como método de Lutz; 
b. sedimentação por centrifugação: método de Blagg (também conhecido por 
método de MIFC), método de Ritchie, Coprotest;
c. flutuação espontânea: método de Willis. Indicado para a pesquisa de ovos 
leves (principalmente ancilostomídeos); 
d. centrífugo-flutuação: método de Faust. Usado para a pesquisa de cistos e 
alguns oocistos de protozoários, permitindo, também, o encontro de ovos 
leves;
e. concentração de larvas de helmintos por migração ativa, devido ao 
hidrotropismo e termotropismo positivos: método de Baermann-Moraes 
e método de Rugai. Indicados para a pesquisa de larvas de Strongyloides 
stercoralis. 
O método de Hoffman permite o encontro de ovos e larvas de helmintos 
e de cistos de protozoários. É um método muito indicado para pesquisa de ovos 
pesados, especialmente ovo infértil de Ascaris lumbricoides, ovo de Schistosoma 
mansoni e Taenia sp. É um método de custo acessível sendo amplamente 
utilizados nos laboratórios clínicos.
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2 OBJETIVOS
• Realizar o método Hoffman.
• Identificar cistos, ovos e larvas e amostras de fezes.
• Conhecer as estruturas dos parasitas 
3 MATERIAIS
• Fezes.
• Reagentes: Água destilada, corante lugol, palito de madeira, béquer, lâminas 
de vidro, lamínulas de vidro, gaze, peneira, cálice de sedimentação e pipeta 
Pasteur. 
4 PROCEDIMENTOS 
• Dissolver com o palito de madeira cerca de 2 gramas de fezes com cerca de 20 
ml de água destilada em um béquer. 
• Filtrar em peneira com gaze 4 dobras para um copo de sedimentação e 
completar com água destilada até a metade.
• Deixar em repouso de 2 a 24 horas. 
• Retirar do fundo do copo 0,5 a 1ml de sedimento com uma pipeta de Pasteur 
ou canudo plástico.
• Pingar uma gota do sedimento sobre a lâmina, corar com 1 gota de lugol e 
sobrepor uma lamínula. 
• Observar em microscópio com aumento 10x e 40x.
5 INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS 
a. Diferenciar cisto, ovos e larvas.
FIGURA 16 – IMAGEM DO MICROSCÓPICO COM CISTOS E OVO
FONTE: <https://2.bp.blogspot.com/-rlnrQmrJ64U/W898cnn6MPI/AAAAAAAAlik/
fM0xTAt1QnkICs0DehBjGBPiXOtvrp0ogCLcBGAs/s1600/30261071_1714098248637035_109749
5037551312896_n.jpg>. Acesso em: 22 abr. 2020
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FIGURA 17 – IMAGEM DO MICROSCÓPICO COM UMA LARVA
FONTE: A autora
b. 
6 REFERÊNCIAS
NEVES, D. P. Parasitologia humana. 12. ed. São Paulo: Atheneu, 2011.
NEVES, D. P.; NETO BITTENCOURT, J. B. Atlas didático de parasitologia. São 
Paulo: Atheneu, 2006.
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PRÁTICA 10 – MÉTODO RITCHIE
1 INTRODUÇÃO 
O método de sedimentação por centrifugação, como o método de Ritchie, 
tem como princípio a separação das estruturas através da centrifugação – 
sedimentação em sistema formol – éter. 
O método Ritchie é utilizado para a pesquisa de ovos leves e larvas de 
helmintos, cistos e alguns oocistos de protozoários. 
De acordo com Neves (2011), as formas parasitárias variam quanto ao seu 
peso e tempo de vida no meio exterior. Assim, não existe um método capaz de 
diagnosticar, ao mesmo tempo, todas as formas parasitárias. Alguns métodos são 
mais gerais, permitindo o diagnóstico de vários parasitos intestinais, outros são 
métodos específicos, indicados para um parasito em especial. Entre os métodos 
gerais, podemos citar o método de Hoffman, Pons e Janer e os métodos de 
centrifugação (Ritchie e Coprotest).
2 OBJETIVOS
• Identificar cistos, ovos e larvas e amostras de fezes.
• Conhecer as estruturas dos parasitas.
3 MATERIAIS
• Fezes.
• Reagentes: formol a 10% e éter ou acetato de etila, corante lugol.
• Água destilada, palito de madeira, béquer, lâminas de vidro, lamínulas de 
vidro, gaze, tubo falcon com tampa, peneira e pipeta Pasteur, centrífuga.
4 PROCEDIMENTOS
• Dissolver com o palito de madeira cerca de 2 gramas de fezes com 15 ml de 
água destilada em um béquer.
• Filtrar 10 ml das fezes dissolvidas em peneira com gaze 4 dobras. 
• Centrifugar por 1 minuto a 2000 rpm. 
• Descartar o sobrenadante e ressuspender com água destilada até completar 
10 ml. 
• Centrifugar novamente por 1 minuto a 2000 rpm. 
• Descartar o sobrenadante.
• Adicionar 7 ml de formalina 10%, agitar e deixar descansar o tubo com 
formalina por 5 minutos. 
• Adicionar 3 ml de éter ao tubo. 
• Agitar vigorosamente e centrifugar por 1 minuto a 2000 rpm.
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• Descartar o sobrenadante e o anel formado de gordura e resíduo, ficando 
somente com o sedimento. 
• Adicionar 2 gotas de lugol ao tubo e ressuspender o sedimento. 
• Colocar uma gota do sedimento em uma lâmina e sobrepor a lamínula. 
• Observar em microscópio com aumento de 10X e 40X.
5 INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS
 
a. Analise as proposições a seguir:
 I- Para a coleta de ovos de Enterobius vermiculares se usa a técnica da fita 
gomada sobre a região perianal, sendo a fita estendida na lâmina do microscópio 
com o lado adesivo para baixo.
II- Para os exames microscópicos, são necessários, no mínimo, 50 gramas 
de fezes, sendo que para as pesquisas de proglotes de tênias ou para a coprocultura 
são necessários, no mínimo, 300 gramas de fezes. 
III- Os exames de fezes visam revelar a presença de protozoários 
(trofozoítos e cistos) ou helmintos (ovos e larvas), habitualmente, encontrados 
parasitando o sistema digestório do ser humano. 
Assinale a alternativa CORRETA: 
a) III, apenas. 
b) I e III. 
c) I e II.
d) II e III. 
e) I, apenas.
b. Na pesquisa de Entamoeba histolytica nos exames de fezes, buscamos 
encontrar nas fezes líquidas e nas fezes formadas, respectivamente: 
a) Cistos e trofozoítos.
b) Trofozoítos e cistos.
c) Trofozoítos e ovos.
d) Ovos e cistos.
e) Trofozoítos, larvas e ovos.
c. Giardia lamblia é um dos enteroparasitas mais frequentemente observados 
nos exames parasitológicos devido à facilidade com que os cistos são 
acidentalmente ingeridos com a água e alimentos contaminados com fezes. 
É um pequeno protozoário flagelado, que parasita o homem e vários animais 
domésticos ou silvestres. A Giardíase temcomo sintoma mais característico 
a esteatorreia, o que é esteatorreia e como ocorre? 
a) Esteatorreia é a presença de sangue nas fezes; ocorre pela perfuração da 
mucosa intestinal. 
b) Esteatorreia é a presença de pus nas fezes; ocorre pela infecção da 
mucosa intestinal 
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c) Esteatorreia é a presença de cistos nas fezes; ocorre pela infestação do 
parasita. 
d) Esteatorreia é a presença de gordura nas fezes; ocorre pela formação de 
um “tapete” pelo parasita impedindo a absorção de gordura. 
e) Esteatorreia é a presença de larvas nas fezes; ocorre uma formação de 
um “tapete” pelas larvas do parasita impedindo a absorção de gordura. 
6 REFERÊNCIAS 
NEVES, D. P. Parasitologia humana. 12. ed. São Paulo: Atheneu, 2011.
NEVES, D. P.; NETO BITTENCOURT, J. B. Atlas didático de parasitologia. São 
Paulo: Atheneu, 2006.