Preparação para Análise de Cromossomos

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Citogenética
1. Preparação para análise dos cromossomos:
O cariótipo é uma técnica de citogenética com o objetivo de avaliar os
cromossomos em nível numérico e estrutural.
➢ Utiliza-se sangue periférico coletado com uma seringa, heparinizada
quando é feita a análise de linfócitos (a cultura pode ser realizada com
sangue total ou de linfócitos isolados).
➢ Inoculadas no meio de cultura em uma câmara de fluxo laminar {o meio
de cultura contém: nutrientes (soro fetal bovino), glutamina A, penicilina e
estreptomicina (para assepsia), fitohemaglutinina (estimula o processo de
divisão celular) - para linfócitos isolados (plasma sanguíneo) utiliza-se
esse meio.}
Diferentes tipos de cultura:
Sangue periférico - meio RPMI - sais enriquecidos com aminoácidos, vitaminas e outros
componentes essenciais para o crescimento celular.
Fibroblasto - meio RPMI ou F10 - teor de piruvato de sódio
Os meios de cultura diferem em relação aos nutrientes utilizados.
Pode-se usar também, líquido amniótico e líquido da vilosidade coriônica.
➢ Incubar a suspensão celular a 37°C; atmosfera de CO2 (3 a 5 dias).
➢ Utiliza-se colchicina para que a divisão seja interrompida na metáfase
(momento em que os cromossomos estão emmaior grau de condensação)
- impede a formação do fuso mitótico por dissolução da tubulina. O tempo
de atuação da colchicina é de 1 a 2 horas (tempo a menos: número
insuficiente de cromossomas bloqueados na fase da metáfase; tempo a
mais: cromossomos muito condensados/ contração exagerada de
cromossomos.
FITOHEMAGLUTININA: utilizada quando a amostra é proveniente do sangue
periférico pois, nesta amostra estarão presentes células maduras que
naturalmente não entram no ciclo de divisão. Não é necessário uso de
fitohemaglutinina em amostras de punção de medula óssea, neste caso o
material apresenta células jovens que entram em divisão naturalmente.
➢ Centrifugação.
➢ Células tratadas com soluto hipotônico (KCl) - tumefação e ruptura da
membrana celular fazendo com que os cromossomos fiquem livres -
suspensão nuclear - cromossomos livres para melhor visualização;
➢ Fixação: retira o KCl e fixa as células com ácido acético e metanol; realiza-se
várias lavagens com o fixador para que restos celulares e citoplasmáticos
sejam descartados. Na última lavagem, suspende-se a lâmina em uma
quantidade de fixador adequada para que tenha-se o número suficiente de
células por gota de suspensão.
Citogenética
IMPORTANTE PARA: garantir a manutenção da forma e da estrutura celular sem
causar nenhuma distorção aos seus componentes. Além disso, o fixador é
importante porque deixa a célula preparada para utilização dos corantes,
garantindo a produção de uma lâmina de qualidade que não tenha
dificuldades na análise.
Preparo do fixador:
30 mL de etanol com 10 mL de ácido acético glacial, sem a
necessidade de acrescentar água destilada.
➢ Espalhamento cromossômico, a gota de suspensão numa lâmina de vidro
deve ser largada, com o uso de uma pipeta, a uma determinada altura da
para melhor espalhamento dos cromossomas _ passo é crucial porque
permite que os cromossomas fiquem suficientemente separados na
lâmina, para uma boa visualização, e suficientemente próximos, para não
haver mistura de cromossomos de células contíguas.
➢ Coloração:
+ Bandamento G: 1º - ação da tripsina que desnatura proteínas
cromossômicas; 2º - coloração com Giemsa. Padrão de bandas clara e
escura - clara (região rica em C e G - genes ativos = eucromatina) e
escura (região rica em A e T - genes pouco ativos = heterocromatina).
Padrão único para cada cromossomo humano, permite que seja feito a
análise de normalidade - detecção de deleção, inversão e duplicação.
Permite, em casos de cromossomos de tamanhos iguais (ex: 4 e 5) a distinção no
idiograma.
+ Bandamento C: 1º - ação do hidróxido de bário; 2º coloração com Giemsa.
Esse método cora regiões com sequências de DNA repetitivo -
CENTRÔMERO = heterocromatina constitutiva.
O centrômero divide o cromossomo em braço curto (p) e braço longo (q).
+ Bandamento R: 1º - tratado com solução salina + calor (desnaturação das
proteínas cromossômicas); 2º - corado com Giemsa, nesse bandamento
ocorre o inverso do G, bandas claras (ricas em A e T) e bandas escura
(ricas em C e G).
+ Bandamento NOR: cromossomos tratados com nitrato de prata e corados;
a região que é corada corresponde aos satélites (regiões organizadoras de
nucléolo) - em cromossomos acrocêntricos. IMPORTANTE PARA DETECTAR
MICRODELEÇÕES.
+ Bandamento Q: cromossomos tratados com substância fluorescente
(quinacrina mostarda); haverá faixas com diferentes intensidades de
fluorescências (mais fluorescente são regiões ricas em A e T). Necessita de
microscópio de fluorescência - Técnica pouco utilizada.
Citogenética
Ordem correta da preparação (ANÁLISE CROMOSSÔMICA):
1- coleta
2- cultura + incubação
3- colchicina
4- centrifugação + descarte
5- solução hipotônica (KCl)
6- centrifugação + descarte
7- fixador
8- preparação da lâmina/ espalhamento cromossômico
9- coloração
10- análise emmicroscopia
IMPORTANTE:
❖ Cromossomos muito condensados = MUITO TEMPO COM COLCHICINA
❖ Nuvem ao redor dos cromossomos/não bandados = ERRO NO FIXADOR
❖ Cromossomo bagunçados, pouco dispersos, indistinguíveis = ERRO NA
PIPETAGEM OU COM A SOLUÇÃO KCl
❖ Restos citoplasmáticos = PROBLEMA NA PIPETAGEM
❖ QUANDO REALIZA-SE DUAS CULTURAS E AMBAS ESTÃO
CONTAMINADAS, O ERRO FOI DURANTE A COLETA / QUANDO
REALIZA-SE DUAS CULTURAS E APENAS UMA ESTÁ CONTAMINADA, O
ERRO FOI NA PREPARAÇÃO DA CULTURA
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Analisando no microscópio:
1º - focar com a objetiva de 10x
2º - objetiva de 40x
3º - colocar entre a objetiva de 40x e 100x, em seguida, adicionar gota de óleo de
imersão na região, prontamente, analisar com a objetiva de 100x.
+ Na técnica de bandamento cromossômico de alta resolução, é utilizada
preparação de cromossomos prometafásicos, sendo o número de
bandas observadas superior ao do bandamento G clássico.
Importante:
Cromossomo X - submetacêntrico, faz parte do grupo C
Cromossomo Y, acrocêntrico menor, faz parte do grupo G
Citogenética
IDIOGRAMA: é um esquema dos cromossomos de uma determinada espécie. Ele pode
mostrar informações simples como o tipo de cromossomo, tamanho dos braços e bandamentos.
exemplo:
CARIÓTIPO: conjunto de cromossomos de uma dada espécie
Anotação correta do cariótipo: 47, XX, +13 / 46, XX
não deve ser feita assim:
47, XXY, del(13)(p)
46, XX, i(xq)
46, XX, del (q13)
46, XX, dup(q21)
Citogenética
Indica-se a realização do cariótipo quando o indivíduo apresenta:
● malformações congênitas múltiplas
● baixa estatura
● deficiência intelectual
● sinais faciais dismórficos
● distúrbios de determinação e diferenciação sexual
● infertilidade e esterilidade
● auxílio diagnóstico e monitoramento em leucemias
● aplicações em pesquisas
● auxílio no diagnóstico de doenças (ex: CCM)
Questão de prova:
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TESTE DO MICRONÚCLEO:
• Pode ser feito a partir de material do sangue periférico
ou de raspado da mucosa oral
• Utiliza-se um bloqueador de citocinese para bloquear
a separação dos núcleos.
• Formação de um núcleo menor (micronúcleo) que
pode ser decorrente de fragmentos de DNA não
incorporados ao núcleo na divisão celular
• Podem apresentar relação com agentes mutagênicos
TESTE DA CROMATINA SEXUAL:
Corresponde a um dos cromossomos X pertencentes ao sexo feminino que se
encontra espiralizado, ou seja, inativo, permitindo com que só um dos alelos X
se manifeste - UTILIZADO QUANDO NECESSÁRIO IDENTIFICAÇÃO DO SEXO.
● Método de avaliação genética que consiste na coleta de raspado da
mucosa oral com espátula de madeira ou lâmina de vidro, sem ferir a boca
do paciente, para coleta de material que será pesquisado por análise
citológica visando a detecção da cromatina sexual.
Utiliza-se corante panótico e coloração de Harris-Shorr, o fixador é álcool 90%.
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QUESTÕES DE PROVA:
R: É utilizado solução hipotônica.