Separação de produtos naturais por técnicas cromatográficas

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
QUÍMICA ORGÂNICA EXPERIMENTAL I - 3320 - TURMA 04
SEPARAÇÃO DE PRODUTOS NATURAIS POR TÉCNICAS
CROMATOGRÁFICAS
PROFESSORA: Debora Cristina Baldoqui
ALUNOS: Cesar Henrique de Souza R.A.: 109395
Maria Clara Mazócoli R.A.: 117567
Mariana Vidotto Donadon R.A.: 116328
Maringá, 20 de setembro de 2022
INTRODUÇÃO TEÓRICA
A coloração típica observada no mundo vegetal em relação às partes
vegetativas é a predominância da coloração verde com base na presença de
clorofila. Seria errado pensar que apenas o pigmento de clorofila está presente
nesses vegetais. O que realmente acontece é que a clorofila “mascara” outros
pigmentos, como carotenóides, ou às vezes outros pigmentos mascaram a
clorofila.[1]
A clorofila é o pigmento natural mais abundante nas plantas e é encontrada
nos cloroplastos das folhas e outros tecidos vegetais. Estudos em uma variedade de
plantas mostram que o pigmento de clorofila é o mesmo. As diferenças aparentes
na cor dos vegetais se devem à presença e distribuição variável de outros
pigmentos relacionados, como os carotenóides, sempre acompanhados de clorofila.
Os pigmentos fotossintéticos presentes e sua abundância variam de espécie para
espécie. A clorofila a (Chl a) está presente em todos os organismos que realizam
fotossíntese aeróbica. As bactérias fotossintéticas não possuem clorofila a, mas
possuem bacterioclorofila como pigmento fotossintético. Chl a é o pigmento usado
para fotoquímica (o primeiro estágio do processo de fotossíntese), enquanto outros
pigmentos ajudam a absorver a luz e transferir energia para o centro de reação, por
isso são chamados de pigmentos acessórios. Os principais pigmentos acessórios
também incluem outros tipos de clorofila: clorofila b, encontrada em plantas
superiores, algas verdes e algumas bactérias; Chl c, em algas marrons e
diatomáceas; e Chl d, em algas vermelhas.
A clorofila (Figura 1) é uma molécula formada a partir de um complexo
derivado de porfirinas com Mg (magnésio) como átomo central. As clorofilas a e b
são encontradas na natureza na proporção de 3:1, respectivamente, e diferem no
substituinte de carbono C-3. Na clorofila a, o anel porfirina contém um grupo metil
em C-3, enquanto a clorofila b (considerada um pigmento acessório) contém um
grupo aldeído, que substitui o grupo metil. A estabilidade da clorofila b é devido ao
efeito de retirada de elétrons de seu grupo aldeído em C-3. A clorofila b é
sintetizada pela oxidação do grupo metila da clorofila a em um grupo aldeído. No
entanto, muitos estudos foram realizados para elucidar a biossíntese da clorofila b,
mas as vias de formação da clorofila b ou as proteínas envolvidas não foram
elucidadas. A clorofila b é convertida em clorofila a por uma enzima chamada
clorofila a oxigenase, que catalisa a conversão de grupos metil em grupos aldeído.[2]
A clorofila está localizada no cloroplasto, a organela que é responsável pela
fotossíntese, ou seja, onde ocorrem duas reações importantes: as reações
fotoquímicas (ocorrem na membrana do tilacóide) e as reações bioquímicas
(ocorrem no estroma do cloroplasto). Além da clorofila, essas organelas contêm
outros pigmentos chamados acessórios, como carotenóides (caroteno e luteína).
Os carotenóides são uma classe de pigmentos naturais encontrados na
natureza pelas cores vermelha, amarela e laranja, atuando na fotossíntese e são
necessários no processo de fotoproteção, principalmente na proteção da clorofila.
São compostos lipofílicos com estrutura básica de tetraterpeno (Figura 2) de 40
carbonos, formado a partir de 8 unidades isoprenóides (Figura 3) de 5 carbonos. A
cadeia carbônica de alguns carotenóides podem apresentar um ou dois anéis
β-ionona (Figura 4) nas extremidades.
Figura 2 - Tetraterpenos.
Figura 3 Figura 4
Até o momento foram descritos mais de 750 carotenóides presentes na
natureza, podendo ser classificados em dois grupos, xantofilas e carotenos, de
acordo com o tipo de solubilidade. O grupo das xantofilas é mais solúvel em água e
o grupo de carotenos solúvel em gordura:
Xantofilas: encontradas nas vegetações terrestres, principalmente nas cores
vermelha e amarela. A xantofila está mais envolvida na proteção da fotossíntese; os
carotenoides presentes nesse grupo são: luteína; zeaxantina; astaxantina;
criptoxantina; capsantina; cantaxantina; sapotexantina.
Caroteno: os mais estudados são o licopeno, presente no tomate, e o caroteno,
presente na cenoura. Os carotenos são abundantes em frutas e vegetais. Por serem
menos solúveis em água, os carotenos são melhores absorvidos em preparações
que levam gorduras boas, como o azeite de oliva, exemplos de carotenóides desse
grupo são: diatoxantina; caroteno; crocetina; curcumina; beta caroteno; alfa
caroteno; licopeno; fitoeno; fitoflueno.[2]
A cor amarela após a degradação da clorofila indica a presença e ação de
enzimas de degradação de carotenóides.[3][4]
A clorofila e os carotenóides podem ser separados por cromatografia de
papel. Essa técnica baseia-se em fenômenos e métodos físicos usados na química
e biologia para separação de componentes de uma mistura. A migração diferencial
é o fundamento da cromatografia. A capacidade de migração de cada componente
da mistura pode ser determinada pelo seu Rf, que é a relação entre a distância
percorrida pela substância e aquela percorrida pelo solvente (eluente).[1]
Técnicas cromatográficas
A cromatografia é uma técnica utilizada para a análise, identificação e
separação dos componentes de uma mistura. É definida pela separação dos
componentes de uma dada mistura baseado na interação dos mesmos com a fase
estacionária e com a fase móvel. Dependendo da natureza dessas fases, tem-se
diversas cromatografias: sólido-líquido (coluna, camada fina ou delgada, papel);
líquido-líquido (CLAE – cromatografia líquida de alta eficiência); gás-líquido (CG –
cromatografia gasosa).[5]
A cromatografia pode ser utilizada para a identificação de compostos, por
comparação com padrões previamente existentes, para a purificação de compostos,
separando -se as substâncias indesejáveis e para a separação dos componentes de
uma mistura.[5]
As diferentes formas de cromatografia podem ser classificadas
considerando-se diversos critérios, sendo alguns deles:
1. Classificação pela forma física do sistema cromatográfico
Pode ser subdividida em cromatografia em coluna e cromatografia planar.
Enquanto a cromatografia planar resume-se à cromatografia em papel (CP), à
cromatografia por centrifugação (Chromatotron) e à cromatografia em camada
delgada (CCD), existem diversos os tipos de cromatografia em coluna;
2. Classificação pela fase móvel empregada
Se tratando da fase móvel, são três os tipos de cromatografia: a
cromatografia gasosa, a cromatografia líquida e a cromatografia supercrítica (CSC),
usando-se na última um vapor pressurizado, acima de sua temperatura crítica. A
cromatografia líquida apresenta uma importante subdivisão: a cromatografia líquida
clássica (CLC), na qual a fase móvel é arrastada através da coluna apenas pela
força da gravidade, e a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). No caso de
fases móveis gasosas, separações podem ser obtidas por cromatografia gasosa
(CG) e por cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR). A diferença entre os
dois tipos está na coluna. Enquanto na CGAR são utilizadas colunas capilares, nas
quais a fase estacionária é um filme depositado na mesma, a CG utiliza colunas de
maior diâmetro empacotadas com a fase estacionária.
3. Classificação pela fase estacionária utilizada
Quanto à fase estacionária, distingue-se entre fases estacionárias sólidas,
líquidas e quimicamente ligadas. No caso da fase estacionária ser constituída por
um líquido, este pode estar simplesmente adsorvido sobre um suporte sólido ou
imobilizado sobre ele. Suportes modificados são considerados separadamente,
como fases quimicamente ligadas, por normalmentediferirem dos outros dois em
seus mecanismos de separação.
4. Classificação pelo modo de separação
Por este critério, separações cromatográficas se devem à adsorção, partição,
troca iônica, exclusão ou misturas desses mecanismos.
Figura 5 - Esquema dos diferentes tipos de cromatografia
A cromatografia em camada delgada (CCD) é uma técnica de adsorção
líquido–sólido. Esta técnica consiste de uma fase estacionária fixada em uma placa
(de vidro ou alumínio) e uma fase móvel, que é composta por um solvente ou
combinação de solventes, chamado eluente. A amostra a ser analisada é aplicada
sobre a fase estacionária, que é um adsorvente. [6]
Neste caso, a separação se dá pela diferença de afinidade dos componentes
de uma mistura, a qual deseja separar, pela fase estacionária. [5]
É a mais simples e mais econômica técnica cromatográfica, utilizada geralmente
quando se pretende a separação rápida e a identificação visual.
Devido a isso, é muito utilizada nas análises de substâncias, no acompanhamento
de reações em sínteses, para determinar o número de componentes em uma
mistura ou verificar a eficiência de uma separação.
A sílica gel é a fase estacionária mais utilizada, sendo seguida pela alumina,
pela terra diatomácea e pela celulose. Para a preparação das placas, faz-se uma
suspensão do adsorvente em água, sendo a mesma depositada sobre a placa. Após
a deposição, deixa -se a placa secar ao ar. A etapa final da preparação da placa é
sua ativação, que ocorre na estufa a uma alta temperatura. Após a aplicação da(s)
amostra(s) sobre a placa, a mesma deve ser introduzida numa cuba contendo a
fase móvel adequada. [5]
O parâmetro mais importante a ser considerado em CCD é o fator de
retenção (Rf ), o qual é a razão entre a distância percorrida pela substância em
questão e a distância percorrida pela fase móvel.[5]
𝑅
𝑓
=
𝑑
(𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡â𝑛𝑐𝑖𝑎))
𝑑
(𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑚ó𝑣𝑒𝑙)
Quanto maior for o fator de retenção, maior a distância percorrida pelo
componente e portanto a interação com a fase móvel é mais fraca, e vice-versa.
Figura 6 - Cromatograma obtido por CCD
Como a maioria dos compostos orgânicos é incolor, muitas vezes é
necessário a utilização de um revelador para que se possa analisar o resultado.
Existem dois métodos revelação, podendo ser um processo destrutivo ou não
destrutivo.
Os métodos não destrutivos mais utilizados são a utilização de placas onde a
fase estacionária é fluorescente ou iodo. O primeiro visualiza substâncias
fluorescentes (placa sem indicador) ou baseia-se na utilização de substâncias
fluorescentes misturadas à sílica. O segundo vale -se do fato de que o iodo reage
com muitos compostos orgânicos, formando complexos, e levando a formação de
manchas amarelas e marrons.
Os processos destrutivos consistem na oxidação dos compostos sobre a
placa, pulverizando-os com solução aquosa de um oxidante orgânico e/ou um ácido
mineral, e submetendo-se a placa a altas temperaturas por alguns minutos. Os
compostos orgânicos oxidados serão revelados na forma mais escura.
PROPRIEDADES FÍSICAS E TOXICIDADE
Hexano (C6H14) [7]
É altamente inflamável e seus vapores podem ser explosivos. A maior parte
do hexano usado na indústria é misturado com produtos químicos semelhantes
chamados solventes. O principal uso de solventes contendo n-hexano é extrair
óleos vegetais de culturas como a soja.
Figura 7 - Estrutura molecular do hexano.
- Características: Líquido incolor com odor de gasolina;
- Massa molar: 86,18 g/mol;
- Densidade: 0,66 g/cm³ a 25°C;
- Ponto de Fusão: - 95,35°C;
- Ponto de Ebulição: 68,73°C;
- Solubilidade em água: Insolúvel em água; muito solúvel em etanol; solúvel
em éter etílico, clorofórmio.
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/ethanol
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/ethyl%20ether
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/chloroform
- Toxicidade: A inalação causa irritação do trato respiratório, tosse, depressão
leve, arritmias cardíacas. A aspiração causa irritação pulmonar grave, tosse,
edema pulmonar; excitação seguida de depressão. A ingestão causa
náuseas, vômitos, inchaço do abdome, dor de cabeça, depressão.
Clorofórmio (CHCl3) [8]
Figura 8 - Estrutura molecular do clorofórmio.
- Características: líquido incolor, com odor doce;
- Massa molar: 119,38 g/mol;
- Densidade: 1,48 g/cm3 em 20°C;
- Ponto de fusão: - 63°C;
- Ponto de ebulição: 61°C;
- Solubilidade: 8,7 g/L em 23°C;
- Toxicidade: Provoca irritação à pele e aos olhos, é nocivo se ingerido, tóxico
se inalado e provoca danos ao fígado e rins por exposição repetida ou
prolongada. É suspeito de provocar câncer.
Sulfato de sódio anidro (Na2SO4) [9]
Figura 9 - Estrutura molecular do sulfato de sódio.
- Características: sólido branco, inodoro.
- Massa molar: 142,04 g/mol;
- Densidade: 2,67 g/cm3 em 25°C;
- Ponto de fusão: 888°C;
- Ponto de ebulição:
- Solubilidade: em água, 200 g/L e insolúvel em etanol;
- pH: 7,5 - 9,2;
- Toxicidade: toxicidade aguda por inalação e para o ambiente aquático. Causa
lesões e irritações oculares graves e irritação/corrosão à pele.
Acetona (C3H6O) [10]
Figura 10 - Estrutura molecular da acetona
- Características: líquido claro e incolor, com odor suave de fruta;
- Massa molar: 58,08 g/mol;
- Densidade: 0,786 g/cm³ a 24°C;
- Ponto de Fusão: - 94°C;
- Ponto de Ebulição: 56°C;
- Solubilidade: em água 100 mg/mL, em etanol 95% 100 mg/mL. Miscível em
clorofórmio e éter;
- Toxicidade: Por inalação: Pode causar severa irritação no trato respiratório,
náuseas, vertigens e sonolência. Por ingestão: Pode causar dor de cabeça,
náuseas, vômitos, vertigens, desmaios, perda de apetite, inflamação no
estômago e duodeno. Contato com a pele: Pode ser rapidamente absorvido
pela pele, causando irritação. Contato com os olhos: causa irritação, podendo
danificar olhos e córnea. Exposição crônica: Pode afetar o sistema nervoso
central, rins e fígado, causar inconsciência e até morte.
OBJETIVOS
O presente experimento tem como objetivo, identificar os compostos
presentes no espinafre, utilizando cromatografia em camada delgada (CCD).
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Preparação do extrato
Colocar em um béquer 10-15 folhas de espinafre cortadas em pedaços e 30
mL de uma mistura de 20:10 mL hexano/acetona e triturar bem as folhas.
Filtrar o extrato, transferir o filtrado para um funil de separação e adicionar 10
mL de água. Agitar lentamente o funil, pois a agitação brusca pode causar a
formação de emulsão. Separar e descartar a fase aquosa. Repetir esta operação
mais uma vez, sempre descartando a fase aquosa.
Transferir a solução de pigmentos para um erlenmeyer e adicionar sulfato de
sódio anidro. Filtrar a solução em um balão de fundo redondo e evaporar o solvente
(filtrado) em evaporador rotativo.
Desenvolvimento do cromatograma
Dissolver o resíduo em uma pequena quantidade de clorofórmio. Aplicar com
um capilar a solução de pigmentos sobre uma placa de sílica a aproximadamente
1,0 cm de uma das extremidades. Deixar o solvente evaporar.
Preparar uma cuba com 10-15 mL de clorofórmio ou hexano/acetona (7:3). e
colocar cuidadosamente a placa na cuba, evitando que o ponto de aplicação da
amostra mergulhe no solvente. Ao final da corrida, remover a placa e marcar a
frente do solvente (linha de chegada da fase móvel). Deixar secar ao ar e observar o
número de manchas coloridas. Copiar a placa com as substâncias separadas
(cromatograma), obedecendo fielmente a distância entre o ponto de aplicação e a
frente do solvente, bem como a distância percorrida por cada substância, iniciando
pelo ponto de aplicação até o centro de maior concentração da mancha. Preparar
uma nova cuba usando como eluente uma mistura de CHCl3 e acetona (9:1).
Efetuar um novo desenvolvimento da placa, tendo o cuidado de não deixar que a
frente do solvente atinja a mancha amarela de maior fator de retenção (Rf), obtida
na primeira eluição. Copiar o cromatograma.