Apostila Aula Pratica APO -Ac nucleicos Beatriz Ferreira - Biologia Molecular (1)

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BIOLOGIA MOLECULAR 
 
ESTUDO DOS ÁCIDOS NUCLÉICOS 
Elaborado por: Profa. Dra. Beatriz Ferreira. 
 
 
INTRODUÇÃO 
Estrutura dos ácidos nucléicos 
Os ácidos nucléicos são considerados as moléculas da hereditariedade. Tais moléculas carregam as 
informações genéticas de um indivíduo e possibilitam que as mesmas sejam herdadas por sua prole. Os ácidos 
nucléicos têm função definida, o ácido desoxirribonucleico (DNA) armazena as informações genéticas, 
enquanto que o ácido ribonucleico “decodifica” essas informações dentro da célula, fazendo com que a 
informação armazenada se transforme em uma ação definida. 
O DNA é uma molécula filamentar muito longa, formada por um grande número de 
desoxirribonucleotídeo. Cada nucleotídeo que compõe a molécula de DNA é formado por um açúcar (pentose), 
uma base nitrogenada e um grupamento fosfato. O açúcar de um desoxirribonucleotídeo é a desoxirribose. O 
prefixo desoxi indica que nesta molécula falta um átomo de oxigênio no carbono 2’. A base nitrogenada está 
sempre ligada ao carbono 1’ da desoxirribose e o grupamento fosfato encontra-se ligado ao carbono 5’ da 
mesma. As bases nitrogenadas da molécula de DNA carregam a informação genética, enquanto que as pentoses 
e os grupamentos fosfatos têm um papel estrutural. 
A estrutura dos nucleotídeos é sempre a mesma o que varia e diferencia um nucleotídeo de outro é a 
base nitrogenada que cada um carrega. Os desoxirribonucleotídeos que compõem o DNA são formados por 4 
bases nitrogenadas: adenina (A), citosina (C), guanina (G) e timina (T). Devido ás suas características químicas 
e estruturais, tais bases foram classificadas como Purinas (A e G) e Pirimidinas (C e T). 
A molécula de DNA encontra-se em dupla fita, isso se deve a formação de pontes de hidrogênio em 
ocasião do pareamento das bases nitrogenadas (adenina pareada com timina e guanina pareada com citosina). 
A ligação que une um nucleotídeo a outro na fita de DNA é denominada ligação fosfodiester. Essa ligação 
ocorre entre o grupamento fosfato, localizado no carbono 5’ de um nucleotídeo e o grupamento OH ligado ao 
carbono 3’ do nucleotídeo anterior. 
 
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O RNA é uma molécula longa não ramificada constituída por nucleotídeos unidos por ligações 
fosfodiéster. Como o próprio nome indica a pentose do RNA é uma ribose. As quatro bases constituintes são 
adenina (A), uracila (U), guanina (G) e citosina (C). A adenina pode parear com a uracila e a guanina com a 
citosina. A célula tem vários tipos de RNA: o RNA mensageiro, o RNA transportador, o RNA ribossômico e 
pequenas moléculas de RNA nuclear (snRNA). 
Ambos RNA e DNA são polímeros lineares de nucleotídeos, tais ácidos nucléicos se diferem em três 
aspectos básicos: 
Diferenças 
entre 
RNA e DNA 
1- O esqueleto pentose-fosfato de RNA contém ribose em vez de desoxirribose; 
2- O RNA contém base uracila (U) em vez de timina (T); 
3- O RNA existe em fita simples em vez de uma dupla-fita. 
 
Inúmeras pesquisas têm sido feitas usando os ácidos nucléicos. Essas pesquisas tentam, não só elucidar 
o verdadeiro mecanismo de ação e regulação dessas moléculas dentro da célula, como também as utilizam como 
ferramentas para testes que não têm como único objetivo estudar os mecanismos de herança. Assim sendo, é 
necessário a utilização de técnicas que permitam a extração de ácidos nucléicos. Existem diversos protocolos 
de extração, cada um deles é específico para o organismo do qual será feita a extração de DNA ou RNA. Cada 
protocolo deve atender as peculiaridades do organismo ou tecido, levando-se em consideração sua constituição 
química e física, bem como deve respeitar as diferenças na constituição do ácido nucléico a ser extraído. 
 
Extração de ácidos nucléicos 
Muitas diferenças podem ser observadas entre os protocolos de extração de RNA e DNA. Isso se deve 
as diferenças encontradas tanto na estrutura quanto nos processos de síntese e degradação dessas moléculas. As 
moléculas de DNA e RNA são degradadas por enzimas denominadas Nucleases (DNAses e RNAses). Essas 
enzimas são específicas e atuam clivando as ligações fosfodiéster entre os nucleotídeos da cadeia do ácido 
nucléico. Essas nucleases são abundantes e estão presentes em todo o ambiente. Uma das preocupações ao se 
executar um procedimento de extração de ácidos nucléicos é eliminar RNAses e DNAses presentes na vidraria 
e soluções utilizadas para o processo. 
Os protocolos para extração de RNA são mais criteriosos e exigem uma maior rigidez quanto à 
eliminação da RNAse, esse é o principal aspecto que diferencia os procedimentos de extração de DNA e RNA. 
Para extração de RNA de um tecido ou organismo é preciso tratar todas as vidrarias e soluções a serem 
utilizadas para que fiquem totalmente livres de RNAse. As vidrarias são esterilizadas a alta temperatura (180 
 
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ºC) durante longos períodos de tempo (12h) e as soluções são tratadas com DEPC (dietilpirocarbonato), um 
reagente que interage com a RNAse inativando-a. Após o tratamento, essas são esterilizadas por alta pressão e 
temperatura (autoclavagem). 
A necessidade de um sistema completamente livre de nuclease para a extração de RNA se deve ao fato 
de que as moléculas de RNA, por se encontrarem em fita simples, são mais instáveis, sendo facilmente 
degradadas. Adicionalmente, a RNAse é uma proteína altamente estável e abundante, podendo ocorrer em 
diversas superfícies. 
A extração de DNA exige critérios de limpeza e esterilização das vidrarias a serem utilizadas, porém 
dispensa o uso de reagentes fortes para inibição de nucleases. A DNAse geralmente é inativada durante o 
processo de extração, e a mesma existente em vidrarias e soluções é degrada por autoclavagem. 
Nessa aula prática será executado um protocolo de extração de DNA genômico, assim será possível aprender 
com detalhes a metodologia de extração, bem como observar os cuidados exigidos pelo procedimento. 
 
Análise de DNA através de eletroforese em gel de agarose. 
A eletroforese em gel de agarose permite estimar a concentração de ácidos nucléicos em solução, mas, 
sobretudo, permite separar, purificar, estimar o tamanho do fragmento e avaliar a qualidade da amostra. 
As amostras são aplicadas no gel e separadas sob ação de um campo elétrico, sendo que os fragmentos de menor 
massa molecular migram mais rapidamente que os de maior massa molecular. 
Após a migração ou corrida, os fragmentos são visualizados por coloração com brometo de etídeo, 
agente intercalante que fluoresce após a excitação com luz ultravioleta (UV). O limite de detecção é de cerca 
de 10 ng/banda de ácido nucléico. Outro método utilizado para visualização é a coloração com nitrato de prata. 
Este sal permite a visualização dos ácidos nucléicos através de precipitação formando cor ocre, que pode ser 
observada sem auxílio de instrumentos. Neste caso o limite de detecção é de 0,1-1 ng/banda de ácido nucléico. 
A distância de migração dos fragmentos analisados é inversamente proporcional ao logaritmo de seu 
tamanho. Com o auxílio de marcadores de massa molecular conhecidaé possível determinar o tamanho de um 
fragmento. A velocidade de migração dos fragmentos de ácidos nucléicos em um gel de agarose é em função 
do seu tamanho, da concentração do gel e da voltagem aplicada. Nas condições de corrida utilizadas, os ácidos 
nucléicos são carregados negativamente, migrando do polo negativo para o positivo. 
Para análise de RNA, o gel deverá conter um agente desnaturante para corrigir a tendência das estruturas 
secundárias em interferir no padrão de corrida. Os agentes desnaturantes mais utilizados são a formamida e o 
formaldeído. 
 
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-Preparação de um Gel de Agarose para Análise de DNA 
Preparo da placa de gel. 
a) Montar uma placa de eletroforese, limitando-a em toda sua extensão com fita crepe. 
Certifique-se de que houve uma boa vedação. 
b) Calcular o volume necessário de TAE 1 X para a cuba e diluir o TAE 10X. 
c) Em Erlenmeyer: 
d) Colocar agarose e TAE 1 X, de acordo com volume e concentração do gel desejados. 
e) Fundir a solução em forno de microondas. 
f) Deixar a temperatura abaixar até cerca de 50°C e adicionar o volume apropriado de brometo 
de etídeo, para se obter uma concentração final de 0,5 g/ml 
g) Verter o conteúdo do erlenmeyer no molde de gel. 
h) Colocar rapidamente o pente sobre a placa, centrando-o suspenso. 
i) Deixar gelificar à temperatura ambiente por 30-45 minutos, retirar o pente. 
 
Soluções. 
1 - Tampão TAE 10x 
Tris-base 2 M 
Ácido acético 0,1 M 
EDTA 0,05M solução O,5M pH8,0). 
Ajustar pH para 7,4 com HCl. 
 
2 - Tampão de Amostra 5x 
Azul de Bromofenol 0,12% (p/v) 
Ficol tipo 400 1 S% (p/v) ou glicerol 30% (v/v) 
Dissolver em TAE 5x 
 
 
 
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- Eletroforese 
a) Transferir o gel para a cuba de eletroforese, verte-se a quantidade de TAE 1 X necessária para cobrir 
completamente o gel. 
b) Conectar os cabos entre a fonte de tensão e a cuba, de maneira, que a corrida ocorra do polo negativo 
para o positivo (testar para ver se está passando corrente). Observar a formação de bolhas de ar que são 
geradas no ânodo e cátodo, devido à eletrólise. 
c) Aplicar as preparações de DNA, previamente misturadas ao tampão de amostra, com auxílio de uma 
micropipeta automática. 
d) Aplicar voltagem de 1-5 V / cm (distância medida entre os eletrodos). 
e) Acompanhar a corrida usando como referência o corante azul do tampão de amostra. Desligar a fonte 
de tensão e remover o gel da cuba. 
f) Analisar o resultado da corrida através da exposição do gel à luz UV e fotografar para documentação. 
a) - Cuidados Recomendados 
a) O brometo de etídeo é um agente mutagênico potente. Usar luvas para manipular os géis ou soluções 
contendo este composto. 
b) Luz UV : usar proteção quando estiver operando equipamentos contendo esta fonte de luz. 
c) O nitrato de prata se complexa com as proteínas da pele. Usar luvas para manipular os géis ou soluções 
contendo este sal. 
- Faixa de separação de DNA em gel de diferentes concentrações de agarose. 
Concentração de agarose( % p/v ) Faixa de separação de DNA linear %/v kb 
0,3 5-60 
0,6 1-20 
0,7 0,8-10 
0,9 0,5-7 
1,2 0,4-6 
1,5 0,2-3 
2,0 0,1-2 
 
 
 
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Mecanismos químicos da extração de DNA 
 
 
Para extração de ácidos nucléicos, inicialmente, o DNA tem que ser liberado do interior dos núcleos 
celulares. Essa fase é conduzida através de processos físicos e químicos. Assim, em todo processo de extração, 
o primeiro passo consiste na maceração. Durante a maceração, geralmente com tecido congelado, o tecido é 
pulverizado até formar um pó bem fino. Durante esse processo ocorre a quebra mecânica de boa parte das 
células. Entretanto, o DNA ainda está insolúvel, assim como todo o resto do material celular, como proteínas, 
membranas, parede celular, etc. É nessa etapa que a solução de extração faz a diferença. Essa solução contém 
reagentes responsáveis pela solubilização de DNA, RNA, proteínas e lipídeos. 
Todas as soluções de extração contem, geralmente, um agente tamponante para regular o pH, um 
detergente para solubilizar as membranas (como a membrana nuclear para exposição do DNA) e, em alguns 
casos, desnaturar proteínas, sal para manter a estringência iônica e água como solvente. Dessa forma, após o 
tecido ter sido macerado, a solução de extração é adicionada ao material macerado e misturado até atingir uma 
massa uniforme. Durante esse processo o detergente interage com as membranas fazendo com que elas sejam 
“dissolvidas”. Nessa etapa todo o conteúdo celular é exposto e entra em solução em função da presença do 
detergente e do sal. Com a adição da solução de extração, a maioria das interações entre as macromoléculas da 
 
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célula é desfeita. Como o nosso exemplo é o DNA, a solução de extração desfaz todas aquelas estruturas 
enoveladas formadas por DNA e proteínas, deixando o DNA linearizado com todas as suas cargas negativas 
expostas. Como os ácidos nucléicos são moléculas longas e altamente carregadas, uma grande força de repulsão 
entre essas moléculas será gerada. Essa força de repulsão é evitada pela presença de sal no tampão de extração. 
Como os sais em solução aquosa são encontrados em sua forma iônica, os íons carregados irão interagir com as 
moléculas em solução [DNA (carga -), RNA (carga -) e proteínas (carga variável)]. 
Após a solubilização, o DNA é retirado “seletivamente” da mistura de moléculas orgânicas através da 
adição de álcool (etanol ou isopropanol). O álcool, na proporção indicada, “sequestra” as moléculas de água 
solvatada no longo polímero de DNA. Como o DNA é insolúvel em álcool ele sai de solução e forma um 
emaranhado com todas as moléculas de DNA presentes na amostra. Na ausência do sal essa interação entre as 
moléculas seria inviabilizada, pois a repulsão entre as cargas negativas seria muito forte.