REPLICAÇÃO_GEN_MOL

Prévia do material em texto

REPLICAÇÃO DO DNA
Passagem da informação 
genética 
geração geração 
Estudando o DNA
Depositário da informação genética
Célula vegetal
MO
DAPI - corante fluorescente
REPLICAÇÃO DO DNA
Ocorre  a cada ciclo celular Interfase – fase S
Necessita Complexa maquinaria enzimática para copiar
As grandes moléculas de DNA
Replicação importante replicação e manutenção exatas
genomas não são estáticos
Para evolução das espécies
Mutações e rearranjos genéticos necessários para manutenção
variabilidade genética entre
indivíduos
Para que as células mantenham o mesmo material genético
Todo o genoma deverá ser precisamente replicado antes de cada 
evento de divisão celular
Replicação do DNA necessita de várias atividades enzimáticas que 
devem agir de forma integrada e sequencial
Atuando de maneira coordenada 
Nos estágios de 
Início
Alongamento da cadeia 
e término
O conjunto de proteínas que atuam na replicação:
Denominado Replissomo
Princípio básico da 
replicação
Ocorrerá apenas se 
existir uma molécula 
de DNA a ser copiada
Fita-molde
Com uma região
pareada contendo uma
extremidade 3'-OH
livre onde será
iniciada a síntese da
nova fita de DNA
O processo é semiconservativo e semidescontínuo
A adição dos nucleotídeos para o crescimento da cadeia:
Sempre no sentido de 5'-P para 3'-OH 
5'→3’
Replicação inicia sempre em sequências específicas chamadas de 
origens
Replicação Unidirecional e Bidirecional 
Processo de replicação inicia na origem
Prossegue sequencialmente ao longo da fita de DNA
Em uma ou ambas as direções até o término
Formando uma bolha de replicação 
Na replicação unidirecional
Uma forquilha de replicação - replissomo
Parte da origem e segue replicando o DNA em uma só direção
Replicação bidirecional 
Duas forquilhas de replicação deixam a origem em direções opostas 
No caso de genomas contendo múltiplas origens de replicação
Duas forquilhas de replicação se movimentando em orientações 
opostas podem se encontrar permitindo a fusão de duas bolhas de 
replicação
Em 1958, os experimentos de Meselson e Stahl
Demonstraram que a replicação de DNA - SEMICONSERVATIVA
Cada fita de DNA copiada no sentido 5'→3’
ORIGINANDO NOVAS FITAS
Replicação: as duas fitas de DNA parental devem ser separadas e 
cada uma servirá de molde para a síntese das novas fitas de DNA 
As moléculas de DNA geradas após a replicação: 
contêm somente uma das fitas recém-sintetizada e a outra 
corresponde à fita do DNA parental (molde).
. 
Replicação do DNA  Processo semiconservativo
 Cada fita parental  serve como molde para nova fita filha
e é conservada em cada molécula de DNA
da progênie
Conformação antiparalela do DNA e a síntese no sentido 5'→3' 
apresentam um desafio para a maquinaria de replicação
Cada replissomo se movimenta em um sentido ao longo das duas 
fitas de DNA
Estes problemas foram superados pela dinâmica do complexo da 
holoenzima que realiza a replicação
Cadeias do DNA são  Antiparalelas
Antiparalelismo
Adição de nucleotídeos a fita molde de DNA
Observar - cadeias anti-paralelas
Processo semiconservativo
Observar 
adição de DNTPS
Adição de 
desoxirribonucleotídeos
Catalizada
Pela enzima
DNA-Polimerase
Proteínas envolvidas na Replicação 
DNA-polimerases 
Enzimas necessárias, em todos os organismos
Replicação do DNA e Reparo
As DNA-polimerases de todos os organismos realizam a mesma 
reação enzimática
Incorporação de nucleotídeos trifosfatados na extremidade 3'-OH 
livre
Sintetizando a fita no sentido 5'→3’ 
Seleção do nucleotídeo a ser adicionado depende da 
complementaridade de bases com a fita-molde
E. Coli
DNA- -polimerases I e III
Enzimas que participam do processo de replicação
DNA replicases
DNA-polimerases II , IV e V 
Relacionadas aos eventos de reparação de lesões do DNA
Células eucarióticas  contém 5 polimerases
 Poli , poli , poli , poli , poli 
Poli  Replicação DNA mitocondrial
Outras  Replicação DNA nuclear
poli  ativa nas célula mesmo na ausência
de divisão - Pode estar evolvida com sistema de reparo
Poli , ,  presentes em leveduras e mamíferos
Poli ,  ligadas a replicação em levedura
Poli  função de primase
Poli  Não está ligada atividade replicativa
Diferentes Poli → Papéis na formação da forquilha
Procariotos  Poli III principal enzima replicativa
síntese de fita contínua e descontínua
Eucariotos  Poli  forma complexo com primase
Atua síntese de pequenos fragmentos RNA-DNA
Poli  preenche fragmentos de Okazaki
e atua na síntese de DNA
Todas as DNA-polimerases bacterianas
Além da atividade de polimerização 
Síntese do DNA no sentido 5'→3’
Apresentam uma atividade de exonuclease
Remoção de nucleotídeos a partir da extremidade da molécula de 
DNA
DNA- replicases tem:
Atividade de exonuclease no sentido de 3'-OH para 5’-P 
3’→5’
Função de remover nucleotídeos adicionados incorretamente na fita 
nova do DNA – Reparo do DNA
Mecanismo - “correção de erro”
Permite que a própria DNA-polimerase, que está realizando a 
síntese, remova o nucleotídeo com pareamento incorreto
Atividade de exonuclease 3'→5’ 
Muito importante para que o processo de replicação ocorra livre de 
erros
Ligação fosfodiéster - realizada entre a extremidade 5'-P do 
nucleotídeo incorporado com a extremidade 3'-OH do nucleotídeo já 
pareado. 
Características das DNA Polimerases
 Sintetizam DNA
5’  3’
Adicionando dNTP
grupamento 3’
a Hidroxila da cadeia da
Nascente
Adicionam
novo DNTP a fita
ligada por ligações de H 
a fita molde 
complementar
Necessitam de primer
para iniciar síntese de
fita nova
Proteínas envolvidas na Replicação
Processo de replicação do DNA:
Necessária a presença no replissomo
Várias proteínas com funções específicas:
DNA-polimerases
Helicases
Proteínas SSB
Primases
Ligase 
Topoisomerase
Forquilha de replicação deve conter Helicase
Função de quebrar as ligações de hidrogênio entre as bases
Separando as duas fitas de DNA
Abertura das fitas 
Necessária para que a forquilha de replicação possa movimentar se
Todas as DNA-polimerases que replicam o DNA de fita dupla 
Dependem da ação inicial de uma helicase
Em arqueas e eucariotos
Helicase presente no replissomo: denominada MCM
(minichromosome maintenance - manutenção de minicromossomo) 
Forquilha de Replicação
Helicases
Proteínas
Helicases catalisam desnaturação do DNA parental
om hidrólise de ATP a frente da forquilha de replicação
Proteínas presentes no Replissomo
Proteínas que se ligam à fita 
simples do DNA ou
Proteínas SSB –
single strand binding 
ligação à fita simples
Presença das proteínas SSB 
durante a replicação é muito 
importante 
Evitam formação de grampos
SSB- promove conformação do 
DNA ideal para a replicação e o 
pareamento de bases
Protegem as fitas simples da 
degradação por nucleases
Proteínas SSB Proteínas de ligação ao DNA fita simples
Estabilizam a fita molde de DNA desenrolada
Mantendo a fita como simples e permitindo a sua cópia
DNA-polimerases não possuem 
capacidade para iniciar uma cadeia 
de nucleotídeos
Necessita de uma região pareada 
fita dupla
com uma extremidade 3'-OH livre
Para cada início de síntese de uma 
das fitas de DNA
É Necessária a presença de um 
iniciador
Os iniciadores utilizados na 
replicação dos genomas celulares 
são pequenas sequências de RNA 
Sintetizados por uma 
primase
 Primase  sintetiza pequenos fragmentos de RNA (3 a 10 nucleot)
Síntese das fitas contínua e descontínua 
do DNA
As fitas do DNA têm polaridades opostas:
5'→3' e 3'→5’
As DNA-polimerases sintetizam apenas 
no sentido 5'→3’
Sendo uma das fitas sintetizada de forma 
contínua e 
Outra de forma descontínua 
Processo de replicação é considerado 
semidescontínuo
Síntese das fitas contínua e descontínua do DNA
Síntese das fitas contínua e descontínua do DNA
Síntese das fitascontínua e descontínua do DNA
DNA-replicase necessitaria somente um iniciador inicial para a 
síntese da fita contínua
Diversas evidências demonstraram:
Síntese da fita contínua pode ser interrompida por diferentes fatores 
Para que a replicação reinicie
A cada interrupção:
Necessária a síntese de iniciadores adicionais pela PRIMASE 
Síntese das fitas contínua e descontínua do DNA
A síntese da fita descontínua
Realizada a partir de vários iniciadores
Polimerizada em diversos fragmentos de Okazaki
Durante este processo a fita-molde da fita descontínua forma uma 
alça
Replicação do DNA é a coordenação da síntese das duas fitas novas, 
a contínua e a descontínua
Há formação de uma alça na fita descontínua
Síntese das fitas contínua e descontínua do DNA
Primase:
Pode atuar como um “freio” e causar uma parada temporária no 
movimento do replissomo
Mecanismo de ação seria o responsável:
Por impedir que o crescimento da fita contínua ultrapassasse 
excessivamente a síntese da fita descontínua
E. coli - RNAse H e Polimerase I atuam na remoção dos primers e 
preenchimento dos espaços
Eucariotos
Nucleotídeos 
Preeenchidos
pela Poli 
Polimerase 
delta 
Uma série de proteínas atuam na forquilha de replicação
Uma das classes de proteínas  liga-se as Polimerases e
aumenta sua atividade e fazem com que permaneçam ligadas a fita 
molde
São proteínas acessórias: RFC (fator replicativo C)  Eucariotos
Liga-se especificamente ao DNA  junção primer e fita molde
PCNA (Proteína deslizamento da grampo)  forma anel
Proteína similar ao PCNA em procariotos denominada: Proteínas Beta
A medida que as fitas parentais  desenroladas
Regiões do DNA  a frente da forquilha - forçadas a rotar
Topoisomerases - impedem super enovelamento do DNA
Enzimas que catalisam reação reversível de quebra e junção
de fitas de DNA - Permitem que o DNA gire livremente
Enzimas envolvidas 
Replicação
Coordenadas
Fita contínua 
e Descontínua
Polimerase
Uma atua na fita contínua
Outra na fita descontínua
Há formação de alça
Fita descontínua
Estrutura da forquilha de replicação
Estrutura da forquilha de replicação
Estrutura da forquilha de replicação
Forquilha de Replicação
Visão da Bolha de Replicação
Somente uma fita de DNA → sintetizada de maneira contínua
Sua elongação →segue sentido do movimento da forquilha de 
replicão
Outra fita → formada de pedaços descontínuos de DNA no sentido 
inverso em direção da forquilha de replicação
Os Fragmentos de Okazaki
Fita de síntese contínua e Fita de síntese descontínua
Observar fragmentos de Okazaki
Forquilha de replicação em 3 dimensões
Origens e Iniciação da Replicação
Inicia-se  seqüência particular
Origem da replicação
Ponto de ligação local de ligação de proteínas que iniciam 
replicação
E. coli região 245 PB - ORI
Proteína iniciadora começa processo de abertura das fitas
recruta proteínas envolvidas na síntese
Helicase e SSB  atuam desnaturação
2 forquilhas Formadas
Origens de Replicação em cromossomos eucarióticos
Genoma maior  síntese originada sítios múltiplos
Prossegue ambas direções e sentidos ao longo do cromossomo
uma “ori”  cada 300 pb
Humanos 30.000 origens
Origens de Replicação
Origem da replicação 
Replicação na molécula de DNA:
Ocorre a partir de um ponto inicial - Origem da replicação
Origens da replicação - característica comum
Formadas por sequências ricas em nucleotídeos AT
Principais diferenças entre os organismos são relativas ao número de 
origens de replicação no seu genoma
O DNA de células bacterianas 
Contém somente uma origem de replicação
Genomas de eucariotos e de algumas espécies de arqueas
Múltiplas origens são encontradas 
Origem da replicação 
Em todos os organismos:
Início da replicação:
Caracterizado pelo reconhecimento da origem por proteínas 
específicas
Posteriormente tais proteínas:
Recrutam proteínas adicionais 
Formando então o replissomo
Características das origens da replicação
Isolamento e a caracterização da origem da replicação (oriC) 
Genoma de E. coli 
Região de 245 pb do cromossomo de E. coli
Essencial à replicação
Região – caracterizada por dois grupos de sequências 
(1) quatro blocos contendo sequências repetidas de 9 pb
Consenso é 5'TTAT(C/A)CA(C/A)A3’
(2) três regiões com sequências repetidas de 13 pb ricas em 
nucleotídeos A ou T, localizadas adjacentes ao grupo 1
Características das origens da replicação
As sequências de 9 pb são os sítios-específicos de reconhecimento da 
proteína iniciadora Dna A
Sua ligação à oriC é cooperativa
Originando a ligação de 20-40 proteínas de Dna A nessa região da 
oriC
A Dna A possui três funções durante o processo de início da 
replicação: 
(1) reconhecimento da sequência nucleotídica da origem, 
determinando o lugar onde deve iniciar a replicação; 
(2) indução da abertura das duas fitas de DNA, por meio da sua 
ligação cooperativa; 
(3) possibilitar a ligação da helicase DnaB na oriC
Características das origens da replicação
Origens da replicação nos cromossomos de organismos eucarióticos 
Dificuldades nos estudos devido à complexidade desses genomas
Em cromossomos de leveduras:
isoladas sequências com replicação autônoma ARS 
autonomously replicating sequence
sequência autônoma de replicação
Ricas em bases AT - atuam como origens da replicação
Proteínas relacionadas ao início da replicação em espécies 
eucarióticas e em arqueas:
Formam um complexo denominado ORC 
Origin recognition complex 
Complexo de reconhecimento de origem da replicação 
subunidades ORC1 a ORC5 - todos os eucariotos
Características das origens da replicação
Apesar de ORC - ter função semelhante a Dna A
Estes dois complexos proteicos não apresentam identidade entre as 
respectivas sequências de aminoácidos
Possuem: Domínios funcionais similares
Função principal do ORC:
Servir como base para a associação sequencial de várias proteínas 
que formam o complexo de pré-replicação
Incluindo helicase MCM
ARS- sequencias autônomas de replicação
ORC - Complexo proteíco
ORC →necessário para iniciação da replicação
recruta outras enzimas necessárias a replicação
→Encontradas em Drosophilas, C. elegans, humanos
Formação  de duas forquilhas
Término da replicação
Os cromossomos de organismos procarióticos
Estrutura circular fechada sem extremidades livres
Replicação de uma molécula circular não apresenta problemas de
término
Término ocorre quando as duas forquilhas de replicação se
encontram - replicação bidirecional
Ou quando a forquilha atinge novamente a região de origem de
replicação - replicação unidirecional
Término da replicação
Replicação do cromossomo circular de E. coli
Duas forquilhas de replicação se encontram na região terminal
Denominada sítio Ter
Oposta ao oriC
Existem duas regiões gerais de terminação - T1 e T2
Término da replicação:
Proteína Tus: que reconhece e liga-se à sequência consenso presente
no sítio Ter
Impedindo, com isso o movimento da forquilha de replicação
Proteína Tus liga-se aos sítios Ter
Bloqueando a atividade de helicase da DnaB
Término da replicação de cromossomos lineares
Células Eucarióticas término:
Ocorre pelo encontro das forquilhas de replicação adjacentes
Fusão das bolhas de replicação dispensaria o uso de sequências
específicas para a regulação dos processos de replicação
No entanto:
São encontrados sítios de pausa de replicação em eucariotos
Por exemplo, a região onde estão localizados os genes codificadores
de rRNA
Término da replicação de cromossomos lineares
Polimerases - incorporam os nucleotídeos no sentido 5’→3
Na síntese da fita descontínua
Remoção do iniciador localizado na extremidade 5'-P da cadeia da 
cadeia de fita descontínua
Resultaria na perda de parte do DNA a cada geração celular
Isso acabaria por ocasionar a perda da informação genética
Telomerases Replicando  Extremidadesdos cromossomos
Término da replicação de cromossomos lineares
Os telômeros - relacionados à estabilidade genômica
Compostos de sequências repetidas ricas em “G”
Durante os eventos de replicação
Telômeros diminuem seu tamanho conduzindo a senescência
(morte) celular
Término da replicação de cromossomos lineares
Células com uma alta atividade replicativa
Telômeros são alongados pela atividade de uma enzima específica
Telomerase
Telomerase em células humanas:
Composta por uma unidade catalítica com atividade de
transcriptase reversa denominada de hTERT
E uma molécula de RNA denominada de hRT
A molécula de RNA serve de molde para a atividade de
polimerização da transcriptase reversa
(Síntese de DNA no sentido 5'→3', utilizando um molde de RNA)
Término da replicação de cromossomos lineares
Mecanismo de ação da telomerase
Consiste em alongar uma das fitas de DNA por meio da adição de
nucleotídeos na extremidade 3’- OH livre
Enzima adiciona as bases complementares à molécula de RNA
presente na sua estrutura em direção à extremidade distal do
cromossomo
Ao atingir o final da fita-molde a telomerase se desloca para a
extremidade recém-sintetizada, pareando com os últimos resíduos
e iniciando novamente a síntese
Várias unidades repetidas de TTGGGG são adicionadas em uma
das fitas do DNA
Término da replicação de cromossomos
lineares
Modelo de replicação dos
telômeros em organismos
eucarióticos. Na figura estão
representadas somente as
extremidades dos cromossomos
contendo as sequências repetidas
A telomerase (elipse) contendo a
molécula de RNA que serve de
molde, realiza a síntese da fita no
sentido 5'→3’. Os nucleotídeos
adicionados pela telomerase na
molécula de DNA estão
representados em vermelho e
sublinhados. Após a síntese dos
primeiros nucleotídeos, a
telomerase se desloca para a
extremidade, mantendo o
pareamento RNA-DNA, e reinicia a
síntese
Término da replicação de cromossomos
lineares
A síntese da fita complementar
destas regiões teloméricas pode
ocorrer por meio da maquinaria
normal de replicação
.