Baixe o app para aproveitar ainda mais
Prévia do material em texto
- -1 PROCESSOS MOLECULARES E GENÉTICOS UNIDADE 1 - O DOGMA DA BIOLOGIA MOLECULAR E SEUS PROCESSOS Autoria: Symara Rodrigues Antunes - Revisão técnica: Carlos Jorge Rocha Oliveira - -2 Introdução Seja bem-vindo à disciplina de Processos Moleculares e Genéticos! Nossa jornada irá começar com a apresentação dos processos básicos de transmissão da informação genética e quais são as moléculas envolvidas neles. Contudo, primeiramente precisamos relembrar conceitos iniciais. É importante recordar que temos dois tipos de células: eucariotas e procariotas, sendo a primeira dotada de núcleo e organelas membranosas, enquanto a segunda não os possui. O núcleo, nas células eucarióticas, guarda uma importante molécula: o DNA (ácido desoxirribonucleico). O DNA, por sua vez, possui uma importância gigantesca: é o nosso material genético. É essa molécula que carrega todas as nossas informações, que designam nossas características físicas e moleculares, ou seja, toda a nossa constituição. Todavia, não é essa a molécula que irá levar a informação para as moléculas que executam as ordens. Portanto, neste capítulo iremos entender como acontecem os processos de transmissão da informação, quais as moléculas envolvidas e quais os processos que o cercam. Ao final, você terá a oportunidade de ter uma visão geral da aplicação desses conhecimentos nas técnicas de biologia molecular, tão difundidas nas pesquisas acadêmicas e cada vez mais ganhando espaço nos diagnósticos clínicos. Bons estudos! 1.1 O dogma central da biologia molecular, suas moléculas e seus processos O ano de 1953 foi um marco na história da biologia molecular: estava descoberto o DNA. Porém, não ache que essa importante molécula simplesmente não era previamente conhecida. Na verdade, Francis Crick, James Watson e Maurice Wilkins realizaram a tarefa de reunir, em um artigo de revisão de duas páginas, as informações que já se conheciam dessa molécula e correlacionaram com a mais importante função dentro da célula: carregar a informação genética. Hoje, parece impensável um mundo no qual não se sabe que é o DNA a molécula que controla todas as funções dentro de uma célula. Não há ainda nem 100 anos dessa descoberta e já há muitos avanços desde então: conseguimos mapear todo o genoma humano e de diversos animais e plantas, conseguimos relacionar alterações estruturais e funcionais do DNA com diversas doenças e características nos animais, além de desenvolvermos técnicas baseadas em análises de DNA que facilitam nosso dia a dia e a medicina. - -3 Entretanto, a descoberta da molécula do DNA não respondia a muitas questões. Já se sabia da existência de RNA e proteínas, mas não se sabia como essas macromoléculas poderiam de alguma forma interagir, ou como interagiam, e qual a hierarquia entre elas. Foi assim que, em 1958, Francis Crick, continuando seus estudos moleculares, propôs o que ficou conhecido como o . Confira!Dogma Central da Biologia Molecular Figura 1 - Dogma Central da Biologia Molecular Fonte: Elaborada pela autora, 2020. #PraCegoVer: imagem representando o Dogma Central da Biologia Molecular e seus processos, em que o DNA é responsável pela informação repassada ao RNA, pelo processo da transcrição, que, por sua vez, passa a informação à proteína por meio da tradução. O processo da síntese de nova molécula de DNA é a replicação. A proposta de Crick era baseada nos diversos estudos anteriores, tanto da sua equipe quanto de outros pesquisadores. Crick e Watson propuseram, pouco após a revelação da estrutura do DNA, como ocorria sua replicação, como ocorriam as mutações e como essas alterações poderiam influenciar no produto final: as proteínas. Em 1958, Crick publicou um novo artigo, propondo o Dogma Central. A partir dessa publicação, ficou estabelecido que o fluxo da informação genética seria do DNA gerando a molécula de RNA por meio do processo denominado transcrição. O RNA, por sua vez, daria origem à proteína, pelo processo da tradução. O DNA seria gerado a partir de uma molécula de DNA prévia, pelo processo de replicação do DNA. De lá para cá, poucos ajustes foram feitos no Dogma Central, não modificando sua estrutura principal, mas inserindo-se exceções na maioria causadas pelos vírus. Descobriram-se enzimas, como a transcriptase reversa, que gera uma molécula de DNA a partir de uma molécula de RNA, por exemplo, mas o cerne do dogma permanece como verdadeiro até os dias atuais. A seguir, vamos conhecer como é a estrutura dessas moléculas e como ocorrem seus processos de formação. Você sabia? Genoma é a denominação dada à sequência completa do DNA de um organismo. Em outras palavras, é a sequência de DNA que designa os genes do ser vivo. O conhecimento do genoma de um organismo possibilita uma vasta gama de informações, que pode auxiliar no entendimento de como ocorrem os processos celulares e moleculares da espécie. - -4 1.1.1 Estrutura e replicação do DNA A proposta da estrutura do DNA por Francis Crick, James Watson e Maurice Wilkins, publicada em 1953, trazia resultados de diversos experimentos de outras equipes de cientistas. Na proposta de Watson e Crick, aceita até os dias atuais, a molécula de DNA é estruturalmente definida como sendo uma molécula helicoidal bifilamentar, com fitas antiparalelas. A molécula é constituída de nucleotídeos que são, por sua vez, formados por uma base nitrogenada, um açúcar (uma desoxirribose) e um grupamento fosfato. Figura 2 - Representação gráfica da molécula do DNA com seus componentes moleculares Fonte: Designua, Shutterstock, 2020. #PraCegoVer: estrutura do DNA. À direita, temos a representação da molécula de DNA: uma molécula helicoidal de fita dupla, antiparalela. À esquerda, o detalhamento da estrutura das fitas: um grupamento fosfato (azul); uma pentose, que é o açúcar (rosa); e uma base nitrogenada (laranja). A união entre as duas fitas se dá por pontes de hidrogênio. Os nucleotídeos do DNA são chamados de desoxinucleotídeos e seguem a mesma constituição base estabelecida anteriormente. A ligação da pentose (lembre-se de que é uma desoxirribose) ocorre pelo carbono 1’ (leia-se carbono um linha) na base nitrogenada e o grupamento fosfato ao carbono 5’ (leia-se carbono cinco linha). As bases nitrogenadas podem ser de dois tipos: Bases púricas Derivadas das purinas, sendo de dois tipos, a adenina (A) e a guanina (G). Bases pirimídicas - -5 Derivadas das pirimidinas, sendo também de dois tipos: a citosina (C) e a timina (T), sendo esta última exclusiva do DNA. Observamos, entretanto, estruturas formadas pela união de uma pentose com uma base nitrogenada, e a essa molécula formada denominamos . Se for inserido um grupo fosfato ao carbono 5’ da pentose, anucleosídeo estrutura passa a ser chamada de . A quantidade de fosfatos ligados à base nitrogenada nucleotídeo monofosfato, difosfato ou trifosfato permite que essas moléculas assumam diferentes e fundamentais funções celulares. Um exemplo que vale a pena destacar é a molécula de , conhecida como a mais importanteATP molécula energética da célula. Sua denominação por escrito já entrega a sua composição: adenosina trifosfato. Continuando a descrição da molécula de DNA, Erwin Chargaff e colaboradores realizaram análises da composição química da molécula e constataram dados curiosos, conforme relatado em GRIFFITHS .et al (2013). Confira! Dado 1 A concentração de timina era sempre igual à de adenina em uma mesma molécula (T=A), assim como a de citocina e guanina (C=G). Dado 2 A concentração total de pirimidinas (T+C) era sempre igual a de purinas (A+G) em uma mesma molécula (portanto, temos a equação T+C=A+G). A partir das observações de Chargaff e colaboradores, foi possível deduzir que as duas fitas que formam a molécula de DNA, ligadas a partir de pontes de hidrogênio, seguem a seguinte regra: timina pareia com adenina ligando por duas pontes de hidrogênio; e citocina pareia com guanina ligando-se por três pontes de hidrogênio. Para quemlembra, as pontes de hidrogênio são ligações químicas que, analisadas isoladamente, Você o conhece? Rosalind Franklin era uma cientista britânica, segunda de cinco filhos de uma importante família judaica. Formou-se em Ciências da Natureza pelo Newnham College, faculdade restrita às mulheres da Universidade de Cambridge. Seu Ph.D. foi obtido com uma pesquisa sobre o carvão, importante substância para a indústria britânica na época da Segunda Guerra Mundial. A partir dessa pesquisa, Rosalind passou a estudar outras substâncias, entre elas o DNA e RNA. De fato, as pesquisas de Franklin foram fundamentais para a descoberta da molécula do DNA, mas, infelizmente, a pesquisadora não pôde receber o prêmio Nobel, em 1962, pela sua contribuição, pois faleceu prematuramente, em 1958, e o prêmio somente é entregue a pesquisadores vivos. - -6 são fracas. Porém, como o DNA é uma molécula muito grande, possui, então, inúmeras pontes de hidrogênio, transformando o conjunto dessas ligações fortes o suficiente para estabilizar a molécula. Na mesma fita de DNA, as bases nitrogenadas são ligadas por meio de uma ligação química do tipo fosfodiéster. A molécula de DNA, então, apresenta-se na forma helicoidal, com mais pontes de hidrogênio fazendo a sua estabilização, estabelecendo os chamados giros menores e os giros maiores. Essa estrutura da molécula do DNA já proporcionou importantes pistas de como seria executada a replicação dessa molécula. O pareamento de bases específico é um mecanismo de cópia fidedigna, como veremos a seguir. Os primeiros estudos e conhecimentos adquiridos sobre a replicação do DNA foram obtidos graças a experimentos com bactérias, em especial a Escherichia coli. Isso porque esse microrganismo tem um tempo relativamente curto entre uma duplicação celular e outra: cerca de 20 minutos. Além se tratar de uma célula procariota, menos complexa do que uma célula humana, eucariota, por exemplo. Deve-se ainda ressaltar outro ponto: nos eucariotos, a replicação do DNA ocorre em uma fase específica do ciclo celular. O ciclo celular, por sua vez, pode ser definido como uma sucessão de fases que regem a vida de uma célula eucariótica, sendo cada fase designada para ocorrência de um conjunto de eventos específicos. O ciclo celular é, então, constituído de uma interfase e da fase de divisão celular propriamente dita (M, de mitose). A interfase é subdividida em G1, S, G2. A replicação do DNA ocorre dentro da fase S, que ganha essa sigla devido a ser a fase de síntese de DNA. Não se esqueça de que síntese significa produção de algo novo (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2012). Como ressaltado anteriormente, o DNA é constituído de duas fitas, antiparalelas, cujas bases se pareiam especificamente seguindo a regra: adenina pareia com timina, e citocina pareia com guanina. Com suas estruturas inalteradas, não há pareamento fora dessa regra. O descobrimento dessa informação deu aos pesquisadores uma importante pista de como ocorreria o processo de replicação da molécula de DNA: usando uma fita molde. Após vários experimentos, o modelo atualmente aceito é de uma replicação semiconservativa para a criação de novas moléculas de DNA. Esse modelo consiste em abrir a molécula de DNA, expondo as duas fitas que compõem a molécula, e utilizando-as como moléculas moldes para as fitas novas. Dessa forma, utilizando a regra de Chargaff, de pareamento de bases, é possível realizar a formação de moléculas precisamente iguais à molécula-mãe (ALBERTS, 2009). Você quer ler? Em 2014, foi publicado no Brasil, pela editora Zahar, o livro de James D. Watson, A como descobri a estrutura do DNA. Nesse livro, Watson conta a sua dupla hélice: versão sobre a descoberta que modificou o mundo e permitiu que, poucos anos mais tarde, essa molécula fizesse parte do conhecimento geral de toda a população. Vale a pena conferir! - -7 Figura 3 - Representação do modelo de replicação semiconservativo do DNA Fonte: Soleil Nordic, Shutterstock, 2020. #PraCegoVer: modelo de replicação semiconservativo de DNA, com apresentação de cinco etapas demonstrando que, ao final, são formadas duas moléculas de DNA, idênticas à original, mas que apresentam, cada uma, uma fita parental e uma fita recém-criada. Na figura, as fitas em azul representam as fitas parentais que compõem a molécula de DNA original. Após a abertura do DNA, expondo as fitas como moldes, são construídas novas fitas complementares (fitas laranjas) tendo como molde as fitas azuis. Ao final, teremos duas novas moléculas, cada uma com uma fita nova (laranja) e uma fita parental (azul). Contudo, para que ocorra a replicação do DNA de forma altamente fidedigna, é preciso a utilização de uma enzima que será a responsável por executar a inserção dos nucleotídeos de acordo com a leitura da fita molde. Essa enzima é a . São conhecidas em cerca de cinco enzimas conhecidas. ADNA polimerase Escherichia coli primeira identificada, a DNA polimerase I, possui as seguintes atividades: Atividade de polimerase Catalisa o crescimento da cadeia no sentido 5’ para 3’. Atividade de exonuclease 3’ ---> 5’ Propriedade de remoção de bases inseridas incorretamente. Atividade de exonuclease 5’ ---> 3’ Propriedade de degradação de pequenos fragmentos de DNA ou RNA. Essa enzima trabalha em um local chamado “forquilha de replicação”, uma estrutura em forma de Y na qual o DNA está aberto e há a atuação de inúmeras enzimas acessórias à DNA polimerase. - -8 Figura 4 - Representação de uma forquilha de replicação, com demonstração da fita líder e da fita com os fragmentos de Okazaki Fonte: Adaptada de ALBERTS et al., 2017, p. 243. #PraCegoVer: estrutura de uma forquilha de replicação de DNA. À esquerda, uma forquilha de replicação com DNA recém-sintetizado em vermelho; as setas indicam a direção 5’-3’ da síntese do DNA. Como as duas fitas-filhas de DNA são polimerizadas na direção 5’-3’, o DNA sintetizado na fita retardada deve ser feito inicialmente em uma série de pequenos segmentos de DNA, os fragmentos de Okazaki, chamados assim por causa do cientista que os descobriu. À direita, a mesma forquilha pouco tempo depois. Na fita retardada, os fragmentos de Okazaki são sintetizados em sequência, sendo os mais próximos à forquilha os fragmentos de síntese mais recente. Entretanto, a DNA polimerase somente consegue inserir novos nucleotídeos na extremidade 5’, para que ocorra a reação fosfodiéster. Devido a isso, observa-se que há, dessa forma, uma fita chamada líder, pois já está posicionada adequadamente para o crescimento da nova cadeia, e uma fita cujo crescimento será mais lento, por meio Fragmentos de Okasaki. É essencial ressaltar que a taxa de erros da DNA polimerase é extremamente baixa, cerca de 1 erro a cada 105 nucleotídeos inseridos e, ainda assim, esses erros são identificados e consertados ainda pela própria enzima antes de finalizar a replicação do DNA. Figura 5 - Representação do processo de replicação do DNA pela DNA-polimerase Fonte: Adaptada de ALBERTS et al., 2017, p. 243. #PraCegoVer: Na figura, a DNA-polimerase catalisa a adição sequencial de um desoxirribonucleotídeo à extremidade 3’-OH de uma cadeia polinucleotídica, a fita iniciadora crescente que está pareada a uma fita- molde já existente. A fita de DNA recém-sintetizada é, então, polimerizada na direção 5’-3’. Como cada desoxirribonucleosídeo trifosfato deve formar par com a fita-molde para ser reconhecido pela DNA- polimerase, essa fita determina qual dos quatro desoxirribonucleotídeos possíveis (A, C, G ou T) será adicionado. A reação é promovida por uma grande alteração favorável da energia livre causada pela liberação do pirofosfato e sua subsequente hidrólise em duas moléculas de fosfato inorgânico. Logo após, é mostrada a estrutura da DNA-polimerase complexada ao DNA (em laranja), determinada por cristalografia de raios X. A fita-molde de DNA é a fita longa, e a fita recém-sintetizada é a curta. Depois, temos um diagrama esquemático da DNA-polimerase.A geometria adequada do pareamento de bases dada pelo desoxirribonucleosídeo trifosfato a ser incorporado provoca um ajuste da polimerase em torno do par de base, iniciando a reação de adição do nucleotídeo. A dissociação do pirofosfato relaxa a polimerase, permitindo a translocação do DNA em um nucleotídeo. - -9 A DNA polimerase, apesar de ser a mais importante enzima do processo de replicação do DNA, não atua sozinha nesse processo. Observe, a seguir, algumas das demais enzimas e moléculas que atuam na replicação com suas respectivas funções (GRIFFITHS ., 2013):et al D N A primase Enzima responsável por fornecer um ou iniciador para a DNA polimerase, pois esta última não éprimer capaz de iniciar uma molécula de DNA sem um suporte inicial. Esse fornecido pela DNA primase éprimer composto de poucos nucleotídeos; cerca de 10 nucleotídeos de RNA que são posteriormente retirados. D N A helicase Enzima responsável pela abertura da molécula de DNA. Imagine-a como se fosse a cabeça de um zíper abrindo-o. Essa é a função da DNA helicase. D N A topoisomerase Enzima responsável por desenrolar a molécula de DNA, não permitindo a formação de nós à frente da forquilha de replicação. Proteínas ligadoras de fita simples de DNA (SSB, de single strand DNA- binding) Pequenas proteínas que se ligam às fitas simples de DNA na forquilha de replicação, de forma cooperativa, e que impedem o DNA de se ligar novamente como fita dupla. Figura 6 - Forquilha de replicação e algumas das diversas enzimas que auxiliam no processo de replicação Fonte: Adaptada de ALBERTS et al., 2017, p. 249. - -10 #PraCegoVer: Diagrama mostrando uma visão atual da disposição das proteínas de replicação em uma forquilha de replicação durante a síntese de DNA. A fita retardada está dobrada para aproximar-se da molécula de DNA-polimerase da fita retardada e formar um complexo com a DNA-polimerase da fita-líder. Esse enovelamento também aproxima a extremidade 3’ de cada fragmento de Okazaki completado do ponto de início do próximo fragmento de Okazaki. Como a DNA-polimerase da fita retardada permanece ligada ao resto das proteínas de replicação, ela pode ser reutilizada na síntese dos sucessivos fragmentos de Okazaki. Nesse diagrama, ela está quase liberando o fragmento de DNA completo e move-se para o iniciador de RNA que está sendo sintetizado. As proteínas adicionais (não mostradas) que auxiliam na manutenção dos diferentes componentes proteicos na forquilha permitem que o complexo funcione como uma maquinaria proteica coordenada. Como podemos observar, o processo de replicação do DNA não é um processo simples. Os conhecimentos que temos desse processo foram adquiridos graças às observações iniciais em procariotos, células mais simples que os eucariotos e com tempo de vida mais curto, o que possibilitou um rápido avanço no conhecimento. Com o avançar das tecnologias e das técnicas de análises, foi possível realizar experimentos observacionais em células eucarióticas e constatou-se que, salvo algumas particularidades próprias dessas células, a replicação ocorre de maneira similar nas células mais complexas. 1.2 Estrutura e transcrição do RNA O RNA (ácido ribonucleico) é uma molécula de estrutura similar ao DNA, sendo também considerado um ácido nucleico. Entretanto, devemos destacar algumas particularidades: o tamanho do RNA é muito inferior ao do DNA; é uma molécula de fita simples; seu açúcar é a ribose e é constituído de ribonucleotídeos, sendo a uracila a base exclusiva do RNA (assumindo o lugar da timina, que é exclusiva do DNA) A molécula de RNA é obtida pelo processo de transcrição. - -11 Figura 7 - Imagem representativa das diferenças das bases nitrogenadas do RNA e do DNA, além de ter uma representação da molécula de RNA Fonte: Adaptada de ALBERTS et al., 2017, p. 225. #PraCegoVer: A estrutura química do RNA se diferencia ligeiramente da estrutura do DNA. O RNA contém o açúcar ribose, o qual difere da desoxirribose, o açúcar utilizado no DNA, pela presença de um grupo -OH adicional. O RNA contém a base uracila, a qual difere da timina, a base equivalente no DNA, pela ausência de um grupo -CH3. A figura mostra um pequeno segmento de RNA. A ligação química entre os nucleotídeos no RNA – uma ligação fosfodiéster é a mesma da no DNA. Um fato curioso é que as células produzem vários tipos de RNA. Podemos destacar cinco tipos de RNAs produzidos pela célula: RNA mensageiro (mRNA) RNA que tem a propriedade de codificar proteínas. É a classe de RNA que cumpre o que é falado no Dogma Central da Biologia Molecular. RNAs ribossômicos (rRNA) RNAs que irão compor a estrutura dos ribossomos que, por sua vez, são responsáveis por catalisar a síntese de proteínas. MicroRNAs (miRNAs) Importantes nos processos de regulação da expressão gênica. RNAs transportadores (tRNAs) Moléculas de RNA que transportam os aminoácidos até os ribossomos para que seja sintetizada uma cadeia polipeptídica que se transformará em uma proteína. Outros RNAs não codificadores Possuem diversas funções dentro dos processos celulares que ainda estão sendo descobertos. Seus tamanhos variam e muitos ainda não têm elucidadas suas funções na célula. - -12 Quando falamos em Dogma Central da Biologia Molecular e seus processos, a produção de RNA se dá pelo processo de transcrição. Tal processo é o mesmo para todos os tipos de RNA, porém para o RNA mensageiro é somente feito em sequências específicas denominadas genes. Figura 8 - Representação da transcrição do RNA a partir de genes contidos no DNA Fonte: Adaptada de ALBERTS et al., 2017, p. 224. #PraCegoVer: Uma célula pode expressar diferentes genes em diferentes taxas. Essa expressão de genes segue o Dogma Central da Biologia Molecular. Na imagem, são demonstrados dois genes – Gene A e Gene B – alocados na molécula do DNA. À esquerda, é mostrado que do gene A são produzidas cinco moléculas de RNA, mesmo só havendo uma cópia do gene, e na tradução são produzidas vinte e cinco moléculas de proteínas, todas seguindo a informação contida no gene A. À direta, está representada a transcrição do gene B, resultando em somente uma molécula de RNA transcrita e, a partir dela, três proteínas traduzidas. Isso demonstra que a célula pode controlar a quantidade de produtos gênicos produzidos de cada gene contido no DNA de acordo com a necessidade da célula, mesmo que somente haja uma cópia física do gene. Esse processo de transcrição é bem mais simples do que o processo de replicação do DNA descrito anteriormente. O processo de transcrição é dividido em três fases, pois é um processo cíclico de síntese de RNA. Cada ciclo de transcrição ocorre várias vezes na mesma região do DNA, o gene, e, antes que um complexo atinja a região de terminação, outros complexos de transcrição estão iniciando a síntese de RNA (ZAHA ., 2014).et al Na primeira fase, , as sequências específicas do DNA, conhecidas como promotores, sinalizam ofase inicial local de formação do complexo de transcrição e com isso inicializam a cópia das sequências do DNA em RNA. Na segunda fase, , a molécula de RNA é sintetizada propriamente dita.fase de alongamento da cadeia Ocorre a inserção dos ribonucleotídeos pela RNA polimerase. A terceira fase, fase de terminação da , é o processo em que a síntese de RNA é terminada em resposta a sinais específicos detranscrição terminação da transcrição, conhecidos como terminadores. Apesar de normalmente ser mostrado um complexo de transcrição em um determinado gene, a transcrição é dinâmica e várias cópias de um determinado RNA são sintetizadas a partir do gene, concomitantemente. Os componentes do complexo de - -13 transcrição são dissociados, ao final da transcrição, e reiniciam um novo ciclo de transcrição (ZAHA .,et al 2014). Assim como na replicação do DNA, há uma enzima responsável pelo processo de transcrição: a RNA . Tal qual sua irmã, a DNA polimerase, essa enzima somente é capaz de inserir novos nucleotídeospolimeraseno sentido 5’ ---> 3’. Contudo, há uma relevante diferença: a RNA polimerase não necessita de um iniciador, sendo capaz de iniciar a fita de novo, isto é, iniciar a nova fita do zero. Ainda assim, enzimas como a helicase e a topoisomerase são necessárias para auxiliar na abertura da cadeia de DNA e expor as sequências que precisam ser transcritas. Em organismos procarióticos, há somente um tipo de RNA polimerase para a produção de todos os tipos de RNAs necessários para o funcionamento celular. Já em eucariotos, são conhecidos ao menos três tipos de enzimas, responsáveis pela síntese de diferentes tipos de RNAs. Para o reconhecimento das sequências que precisam ser transcritas, a RNA polimerase precisa reconhecer regiões como os promotores de genes, que indicam que um gene está ali próximo. Há, ainda, outras sequências de reconhecimento e de controle da transcrição de promotores e proteínas, conhecidas como fatores de , que auxiliam no processo de reconhecimento das regiões que precisam ser transcritas.transcrição A célula possui um intrincado processo de controle da expressão gênica, designando, com precisão, quais genes necessitam ser transcritos em qual momento e por quanto tempo, controlando, assim, o número de cópias de RNAs enviadas ao citoplasma, que, consequentemente, podem ser traduzidas em proteínas. Tudo depende da necessidade naquele momento da célula e também de sinalizações externas recebidas. No entanto, a simples cópia do molde de DNA, convertida em uma molécula de RNA, baseada no pareamento de bases (adenina pareando com uracila, e guanina pareando com citocina) não gera, em eucariotos, um RNA funcional. Após o processo de transcrição, é necessário que seja realizado o . São trêsprocessamento do RNA os processos realizados na molécula do transcrito primário: Adição de uma capa na extremidade 5’, que consiste em uma guanina atípica com um radical metil anexado a ela. Poliadenilação da extremidade 3’, que nada mais é do que a síntese de uma cauda com uma série de repetições de adeninas, chamada cauda poli-A. Excisão de íntrons em um processo chamado .splicing Aproveite e aprofunde seus conhecimentos! - -14 Somente após essas modificações do RNA é que ele é reconhecido como um RNA maduro e pode, enfim, ser transportado para o citoplasma. Chegando ao citoplasma, caso se trate de um mRNA, imediatamente ele será traduzido pelos ribossomos para a formação das proteínas. 1.3 Tradução, código genético e estrutura de proteínas Quando o mRNA chega ao citoplasma, ele será imediatamente “atacado” por ribossomos para que seja realizada a tradução da informação genética em uma proteína. A informação genética que antes estava sendo repassada de 1:1 agora passa a ser repassada de 3:1. Isso porque, quando é feita a tradução, a leitura dos nucleotídeos do mRNA não é feita de um a um, mas sim de três em três, as chamadas trincas. Em linhas gerais, o repasse de informação do DNA para o RNA é simples, uma vez que são moléculas química e estruturalmente simples. Muito acertadamente, o nome do processo de conversão da informação contida no mRNA para uma proteína chama-se tradução, pois está sendo convertida para “outra linguagem” molecular. As proteínas são feitas de uma sequência de aminoácidos, e não de nucleotídeos. O mRNA é lido de acordo com uma sequência de trincas, que são agrupamentos de 3 em 3 nucleotídeos. Os ribossomos funcionam como verdadeiras enzimas que catalisam esse processo traducional. Os tRNAs são os responsáveis por fornecerem os aminoácidos para a montagem da molécula de proteína. Toda a leitura é feita obedecendo-se ao chamado .código genético O código genético foi desvendado em 1961 e designa quais trincas designam cada um dos aminoácidos. Entretanto, há uma dificuldade que precisa ser superada: o RNA possui quatro diferentes nucleotídeos, que podem gerar 64 combinações diferentes de trincas e somente há 20 aminoácidos diferentes encontrados formando proteínas. As pesquisas demonstram que o código genético é redundante, isto é, o mesmo aminoácido pode ser designado por trincas diferentes. Vale ressaltar que essas trincas, quando no mRNA, são Você sabia? Os genes eucarióticos são compostos de sequências denominadas íntrons (do inglês, ) e éxons (do inglês, ). Os primeiros não são intervening sequences expressed sequences sintetizados em proteínas, sendo retirados pelo processo de . O fato de os genes splicing eucarióticos serem “interrompidos” permite que sejam feitos rearranjos pós- transcricionais e a modificação da sequência que será traduzida, possibilitando a formação de proteínas diferentes a partir de um único transcrito primário, de acordo como os éxons serão rearrumados na retirada dos íntrons. - -15 chamadas de , e a trinca complementar, presente no tRNA, é chamada de . É consideradocódon anticódon universal, pois quase todos os organismos da atualidade cumprem as suas regras. Outra curiosidade é que ele possui “sinais de pontuação”: códons de iniciação de leitura e códons de parada. Figura 9 - Tabela do código genético baseada em sequências de códons Fonte: Griffiths (2013, p. 276). #PraCegoVer: Tabela do código genético para a leitura das trincas e designar os respectivos aminoácidos a serem inseridos na sequencia formadora da proteína. Na coluna mais a esquerda, está a primeira letra da trinca do códon (U, C, A, G). Na linha mais superior, a segunda letra do códon (U, C, A, G). na coluna mais a esquerda, a terceira letra do códon (U, C, A, G). Ao centro, cada célula é formada pela união das três letras do códon, lido na sequencia descrita, formando 64 combinações possíveis que irão designar os 20 aminoácidos existentes na natureza. A leitura do mRNA inicia-se quando o ribossomo encontra o chamado códon inicial AUG. A partir desse códon, os nucleotídeos serão lidos de 3 em 3, sem “pular” nenhum, até que se encontre um dos 3 códons de finalização (UAA, UAG e UGA). Os ribossomos leem os códons e selecionam o tRNA que possui uma sequência de trinca que seja complementar, chamada de anticódon. Encontrando o tRNA complementar este, carregado com o aminoácido, passa-o para que seja inserido na sequência de aminoácidos que está sendo formada pelos ribossomos, com união por ligações peptídicas. Figura 10 - Esquema em três etapas demonstrando como ocorre o reconhecimento dos códons para designação correta do aminoácido Fonte: Adaptada de ALBERTS et al., 2017, p. 243. - -16 #PraCegoVer: o código genético é traduzido pela atuação conjunta de dois adaptadores: aminoacil-tRNA, sintetases e tRNAs. Cada sintetase acopla um aminoácido específico a seus tRNAs correspondentes, em um processo chamado carregamento. O anticódon da molécula de tRNA carregada forma pares de bases com o códon apropriado no mRNA. Um erro, seja na etapa de carregamento, seja na etapa de ligação do tRNA carregado ao seu códon, fará com que o aminoácido errado seja incorporado a uma cadeia de proteína. Na sequência de eventos ilustrada, o aminoácido triptofano (Trp) é selecionado pelo códon UGG no mRNA. Tal qual acontece com os RNAs, a produção de proteínas ocorre várias de uma única vez, proporcionando a produção de centenas de moléculas a partir de um único mRNA que chega ao citoplasma. Há a possibilidade de fazer controle ainda nessa fase, de acordo com a necessidade da célula. Terminado o processo de tradução, a sequência de aminoácidos formada passa por transformações conformacionais para que possa assumir a forma funcional e desempenhar suas funções na célula. 1.4 Técnicas de detecção de ácidos nucleicos e suas aplicações O entendimento e o conhecimento acerca dos processos moleculares descritos anteriormente permitiram que fossem desenvolvidas técnicas que pudessem reproduzi-los em laboratório e possibilitassem ain vitro observação do processo quanto ao uso em análises moleculares. Entretanto, apesar de baseados nos processos que ocorrem nas células, ainda ocorrem limitações na reprodução em laboratóriopor não contar com diversas outras questões bioquímicas e moleculares que a célula possui. Em 1983, Francis Mullis revolucionou a pesquisa em biologia molecular ao desenvolver a PCR (reação em cadeia da polimerase, do inglês, ). Essa técnica lhe rendeu um prêmio Nobel emPolymerase Chain Reaction 1993 e, ainda hoje, pode ser considerada a principal técnica de biologia molecular usada em laboratório. Tal técnica permite, em linhas gerais, a replicação de fragmentos específicos do DNA em centenas de milhares de cópias, em uma questão de poucas horas. A técnica de PCR consiste em submeter uma mistura de nucleotídeos, sequência de DNA alvo e iniciadores ( ), misturados a uma solução tampão com adição de Taq polimerase (a enzima DNA polimerase usada primer in ), a uma variação de temperatura sequencial em ciclos. Os ciclos podem se repetir de 20 a 40 vezes. Avitro técnica base utiliza DNA como sequência-alvo a ser multiplicada. Em teoria, pode-se amplificar uma única sequência de DNA em centenas de milhares de cópias em poucas horas. A evolução tecnológica possibilitou o surgimento de máquinas de PCR cada vez mais precisas com a variação de temperatura dos ciclos e mais ágeis na troca de temperatura, acelerando o processo. A PCR pode ainda ser associada a outras técnicas, como a digestão enzimática por endonucleases. Essas enzimas clivam o DNA em pontos de sequências reconhecidas com precisão. Desse modo, se aquele - -17 fragmento de DNA possuir a sequência-alvo da endonuclease, ele será clivado, gerando dois fragmentos de tamanhos possivelmente variados. Se não houver a sequência, não haverá o corte e o fragmento permanecerá íntegro. A visualização do resultado se dá por meio de análises de bandas em géis de agarose na maioria das vezes. Essa simples combinação de técnica possibilitou um leque de análises e exames, incluindo até mesmo o sequenciamento do genoma humano. Com o avançar dos anos, foram surgindo outras possibilidades para a PCR, com aperfeiçoamento da técnica e surgimento de outras derivadas dela. A técnica da PCR em tempo real (RT-PCR) permitiu a análise da amplificação do DNA (e mais tarde do RNA) à medida que iria ocorrendo. Essa simples mudança da técnica – de se analisar se está ocorrendo a amplificação durante o processo, e não somente ao final, como na PCR tradicional – permite resultados mais rápidos e precisos, se há a sequência-alvo no pool de amostra analisado, além de outras importantes análises. As análises de doenças infecciosas se beneficiaram dessa técnica, pois proporcionam uma rápida identificação entre as amostras dos pacientes, diminuindo o tempo de janela imunológica. Entretanto, o campo de técnicas moleculares expandiu-se muito desde a descoberta de Mullis. Há cerca de cinco anos, o meio acadêmico científico foi novamente surpreendido com uma nova e revolucionária técnica: CRISPR. Jennifer Doudna e sua colaboradora, Emmanuelle Charpentier, estabeleceram a técnica de edição de, virtualmente, qualquer DNA. A técnica ainda não é totalmente dominada, mas os seus usos e suas aplicações são gigantescos: pode-se desde consertar genes defeituosos em doenças a até mesmo adquirir novos fenótipos a partir de alterações do genoma. Os genes localizados nos cromossomos controlam as características hereditárias transmitidas pelos gametas feminino e masculino com a finalidade de manter contínua a genética das gerações. A comprovação da identificação de uma determinada pessoa, ou seja, pelo DNA de seus filhos (prole), conhecida popularmente como teste de paternidade, é uma técnica que utiliza sondas capazes de detectar as sequências de DNA humano, as quais são idênticas aos de seus ascendentes, no caso os pais. Lembre-se de que uma pessoa é formada a partir da união de dois gametas: um espermatozoide e um óvulo. Em cada um deles, há um conjunto de cromossomos que trazem genes. Portanto, uma pessoa é formada a partir de dois conjuntos de cromossomos, cada um herdado de um dos pais. A variabilidade encontrada na espécie humana é fornecida pelo crossing-over que ocorre na formação de cada um dos gametas, antes da Você quer ver? Neste TED Talk, a cocriadora da técnica CRISPR -Cas9, Jennifer Doudna explica, de forma clara, sucinta e elucidativa, como essa técnica pode revolucionar o tratamento de doenças genéticas antes tidas como incuráveis. Confira acessando o link https://www. e não se esqueça de ativar a legenda!youtube.com/watch?v=TdBAHexVYzc https://www.youtube.com/watch?v=TdBAHexVYzc https://www.youtube.com/watch?v=TdBAHexVYzc - -18 ocorrência da fecundação. Entretanto, mesmo após o crossing-over, ainda há a permanência de similaridades do cromossomo que podem ser rastreadas, pois apresentam um padrão específico de bandeamento. Essas bandas se devem a sequências repetidas que mantêm o padrão conforme de qual progenitor é herdado. A técnica de análise desse padrão de bandas é chamado de VNTR ), que(Variable Number of Tandem Repeats busca comparar exatamente essas sequências curtas repetidas ao longo das moléculas de DNA que compõem cada um dos cromossomos e comparar com as sequências dos pais (DOMINGOS, 2017). Outra técnica de análise de ácidos nucleicos é a eletroforese em gel de agarose. Essa técnica permite a visualização de bandas luminosas. A técnica utiliza um gel de agarose, que formará uma teia por onde o DNA (ou fragmentos provenientes de amplificação por PCR) irá passar quando submetido a um campo elétrico. A molécula de DNA possui uma carga negativa; logo, é atraída para o polo positivo do campo. Como o gel oferece uma resistência à passagem das moléculas, aquelas que forem menores, irão se movimentar mais rapidamente, e as maiores irão se movimentar mais lentamente. Essas moléculas, então, irão se agrupar em bandas, que poderão ser visualizadas com a impregnação de substâncias fluorescentes, que emitem uma marcação luminosa quando submetidas à luz UV (DOMINGOS, 2017). A técnica de ou impressão digital genética, com confiabilidade de 99,9%, baseia-se na análise defingerprint sequências do DNA que formam um padrão único para cada pessoa. Essa técnica pode ser utilizada para atestar se um material biológico, que contenha material genético, pertence ou não a uma determinada pessoa (ZAHA ., 2014).et al Outras técnicas foram e estão sendo desenvolvidas e aperfeiçoadas. O sequenciamento de DNA, no qual conseguimos conhecer a sequência exata dos nucleotídeos do DNA, teve avanços significativos nos últimos anos. A técnica, que antes era bem demorada para se executar, hoje, diante das novas técnicas, propicia o conhecimento do sequenciamento do DNA em pelo menos metade do tempo. As análises de RNA também ganharam destaque, pois permitem observar se há o fluxo da informação genética pelo Dogma da Biologia Molecular. Das técnicas, a PCR em tempo real (RT-PCR) possibilita a análise da amplificação do RNA, por técnica que se baseia na PCR, mas as análises são feitas em tempo real, podendo ser registrado quantas moléculas são amplificadas por minuto. A bioinformática tem despontado como uma ciência essencial para as análises em biologia molecular. Com o avanço das técnicas de análises do DNA, criou-se uma avalanche de informações a serem pesquisadas, produtos das técnicas de análises. Portanto, a união das áreas de matemática, informática, estatística e biologia permite que haja maior robustez e detalhamento nas análises, além de rapidez. TESTE SEUS CONHECIMENTOS (ATIVIDADE NÃO PONTUADA) - -19 Com a associação com a bioinformática, a chamada era da genômica (em que se focou nas análises da sequência de DNA e suas interações) acelerou-se e hoje possui robustas ferramentas on-line de análises rotineiras, como o site BLAST, o qual permite a comparação de sequências de DNA com um banco de sequências mundial de DNA e, por meio de um algoritmo, possibilita ter uma grande quantidade de informações acerca daquela sequência (ZAHA ., 2014).et al A genética e a genômica modernas enfrentam o desafiode aplicar esses novos recursos ao estudo da dinâmica da atuação dos genes e genomas para realizar a melhor compreensão de sua biologia. - -20 Conclusão Chegamos ao final desta unidade e, até aqui, você aprendeu os processos moleculares básicos relacionados ao DNA, como sua estrutura, localização, replicação e transcrição; o RNA, seu processamento e sua tradução; a síntese de proteínas; assim como o código genético e as principais técnicas utilizadas para detecção do DNA, do RNA e das proteínas. Nesta unidade, você teve a oportunidade de: • estudar os aspectos dos genes, os elementos estruturais da molécula de DNA; • identificar as bases nitrogenadas; • compreender que a informação genética é descrita em código, no qual o DNA é encontrado estruturado em cromossomos, que são os veículos da hereditariedade; • entender a replicação do DNA; • identificar o processo de transcrição a partir de trechos de DNA; • compreender a tradução do mRNA, o rRNA e o tRNA, que, por sua vez, está associado à subunidade do ribossomo; • entender o início da síntese de proteínas; • Compreender o código genético; • identificar a reação em cadeia da polimerase – PCR ( ), que permite o Polymerase Chain Reaction isolamento de qualquer segmento de DNA; • conhecer as técnicas mais utilizadas para a detecção do DNA e do RNA. • • • • • • • • • • - -21 Referências ALBERTS, B. . 5. ed. Porto Alegre: Artmed, 2009.Biologia molecular da célula ALBERTS, B. . . 4. ed. Porto Alegre: Artmed, 2017.et al Fundamentos da biologia celular DOMINGOS, P. P. . Londrina: Editora e Distribuidora Educacional S.A., 2017.Genética GRIFFITHS, A. J. F. . . 10. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2013.et al Introdução à genética JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. . 9. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,Biologia celular e molecular 2012. WATSON, J. D. como descobri a estrutura do DNA. Rio de Janeiro: Zahar, 2014.A dupla hélice: WATSON, J. D. . . 7. ed. Porto Alegre: Artmed, 2015.et al Biologia molecular do gene ZAHA, A.; FERREIRA, H. B.; PASSAGLIA, L. M. P. . 5. ed. Porto Alegre:Biologia molecular básica Artmed, 2014. Introdução 1.1 O dogma central da biologia molecular, suas moléculas e seus processos 1.1.1 Estrutura e replicação do DNA Bases púricas Bases pirimídicas 1.2 Estrutura e transcrição do RNA 1.3 Tradução, código genético e estrutura de proteínas 1.4 Técnicas de detecção de ácidos nucleicos e suas aplicações Conclusão Referências
Compartilhar