Resumo Diagnóstico Laboratorial de IST's - PLP - ana_dinizmed

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As imagens utilizadas são para fins educativos, sem intenção de infringir direitos autorais. @ana_dinizmed 
 É um retrovírus humano 
 É da família Lentivírus: vírus T linfotrópicos 
HTVL-I e II e HIV I e II 
 Morfologia: Icosaedro 
 Núcleo (p24, genoma e enzimas nucleares) 
 Matriz celular (p7) 
 Envelope viral (glicoproteínas gp120 e 
gp41) 
 
 As mortes pelo HIV caíram, porém, a infecção 
ainda se mantém 
 O diagnóstico laboratorial em indivíduos acima 
de 18 meses é feito em duas etapas: 
a) Etapa de Triagem: Alta Sensibilidade 
 Ensaio Imunoenzimático (ELIZA) 
 Ensaio Imunoenzimático de 
Micropartículas (MEIA) 
 Ensaio Imunológico Quimioluminescente 
(QL) 
 Ensaio Imunológico com revelação 
eletroquimioluminescente (EQL) 
 Ensaio Imunológico Fluorescente ligado à 
enzima (ELFA) 
 Ensaio Imunológico Quimioluminescente 
magnético (CMIA) 
 Testes Rápidos: imunocromatografia, 
aglutinação de partículas de látex ou 
imunoconcentração 
b) Etapa Complementar: Alta Especificidade 
 Imunoblot (IB) 
 Imunoblot Rápido (IBR) 
 Western Blot (WB) 
 Quantificação da carga viral 
a) Janela de Soroconversão/ Janela Imunológica/ 
Janela Sorológica 
 Duração do período entre a infecção pelo HIV 
até a primeira detecção de anticorpos anti-HIV 
 
b) Janela Diagnóstica 
 Tempo decorrido entre a infecção e o 
aparecimento /detecção de um marcador da 
infecção, seja ele RNAviral, DNApró-viral, 
antígeno p24 ou anticorpo. 
 A duração desse período depende do tipo de 
teste, da sensibilidade e do método utilizado 
para detectar o marcador 
 Antes da realização dos testes deve-se: 
 Realizar aconselhamento fornecendo 
informações sobre formas de transmissão, 
significados dos resultados dos exames, 
período da janela imunológica 
 É necessário sempre obter o 
consentimento do usuário ou de seu 
responsável 
 
 O teste se encontra em um dispositivo que 
pode possuir várias formas 
 Aplica-se uma amostra soro-plásmica ou fluido-
oral com um diluente (com o diluente, a 
amostra irá correr por capilaridade pelo teste) 
 Se aparecerem duas linhas, o teste é reagente 
e válido, já que apareceram a linha do resultado 
e do controle 
 Se aparecer somente a linha do controle, o 
teste é não reagente e válido 
 Já se não aparecerem nenhuma linha, ou a 
linha do resultado sem a do controle, o teste é 
inválido 
Diagnóstico Laboratorial de IST’s 
Infecção pelo HIV 
Diagnóstico Laboratorial do HIV 
Cinética da Imunidade contra o HIV 
Teste Rápido 
Triagem
Não Reagente
Liberar 
Resultado
Reagente
Teste 
Molecular ou 
WB
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 Na região do resultado existem antígenos de 
HIV 
 Se o paciente apresentar anticorpos que 
reconheçam esse HIV, a mistura se torna 
evidente 
 Já na região do controle há antígenos 
inespecíficos 
 São testes Imunoenzimático que empregam 
antígenos virais (proteínas) 
 São precisos e passíveis de automação 
 Os antígenos estão na fase sólida 
 A placa de ELISA é um dispositivo plástico com 
96 pocinhos independentes, sendo possível 
testar diferentes amostras 
 Se ele for reagente, a cor muda para amarelo 
 Se for não reagente, permanece transparente 
 Ele já vem com antígenos virais colados de 
fábrica, ou seja, é uma placa sensibilizada 
 Aplica-se a amostra do soro do paciente 
nesses pocinhos e espera o resultado 
 O anticorpo do paciente não apresenta um 
marcador colorido ou gera flocos, portanto de 
início não é possível saber o resultado 
 Para dar a diferença de cor, é adicionado um 
anticorpo secundário ligado a uma enzima 
 Se houve a reação Ag-AcHIV, o anticorpo 
reconhece a Ig humana e se liga ao conjunto 
 Ao adicionar um substrato, a enzima torna o 
líquido colorido 
 Esse é um teste muito preciso e passível de 
automação 
a) ELISA 1ª geração 
 Tornou-se obsoleto 
 Janela de soroconversão: 42 a 56 dias 
 
b) ELISA 2ª geração (Indireta - IgG) 
 Janela de soroconversão: 28 a 30 dias 
 Possui um poço sensibilizado com 
antígenos específicos 
 Ao adicionar a amostra do paciente, que 
pode conter ou não as Igs, o pocinho fica 
em incubação que pode variar conforme o 
exame 
 Após o tempo de incubação, os pocinhos 
são lavados 
 Depois da lavagem, restam apenas as 
ligações ou não 
 Nessa mistura, é adicionado o anticorpo 
secundário e novamente, ela vai para a 
incubação 
 E assim, após um tempo, adiciona-se um 
substrato e a enzima reage mudando a 
amostra de cor 
 
c) ELISA 3ª geração (ELISA Sanduíche - IgG e 
IgM) 
 Janela de soroconversão: 22 a 25 dias 
 Possui um poço sensibilizado com 
antígenos específicos, que são 
reconhecidos por IgG ou IgM 
 Adiciona-se a amostra do paciente, e o 
pocinho fica em incubação 
 Após o tempo de incubação, os pocinhos 
são lavados 
 Depois da lavagem, restam apenas as 
ligações ou não 
 Nessa mistura, é adicionado um antígeno 
viral recombinante ligados a uma enzima 
 Assim, após um tempo, adiciona-se um 
substrato e a enzima reage mudando a cor 
da amostra 
 
d) ELISA 4ª geração (Sanduíche - IgG, IgM e p24) 
 Janela de soroconversão: 15 dias 
 Possui um poço sensibilizado com 
antígenos específicos e anticorpos anti-p24 
(1ª proteína do vírus circulante no sangue) 
 Adiciona-se a amostra do paciente, e fica 
em incubação 
 Após o tempo de incubação, os pocinhos 
são lavados 
 Depois da lavagem, restam apenas as 
ligações ou não 
 Nessa mistura, é adicionado o anticorpo 
secundário e antígeno marcado e 
novamente, ela vai para a incubação 
 E assim, após um tempo, adiciona-se um 
substrato e a enzima reage, mudando a 
amostra de cor 
 É necessário para afastar possíveis falsos 
reagentes dos testes de triagem 
 O teste é utiliza uma fita: 
 É feita uma preparação do vírus HIV em 
laboratório, que passa por um tratamento 
térmico/químico que destroem o icosaedro 
viral e uniformizam as cargas das proteínas 
virais 
 Em seguida, essa mistura é levada para um 
gel, que fica em tampão, e é aplicada uma 
carga 
 Essa carga gera polos positivos e 
negativos, e as proteínas menores migram 
para o polo positivo mais rápido do que as 
de maior tamanho 
 Em seguida, é feita uma eletrotransferência 
para tiras de nitrocelulose 
 Assim elas ficam prontas para utilização 
 
 Com as tiras já prontas, o soro do paciente é 
colocado em incubação 
 Se existirem anticorpos que reconhecem as 
proteínas, há uma ligação Ac-Ag 
 Em seguida, adiciona-se o anticorpo 
secundário com marcador, e se houver a 
ligação, formara-se bandas nas fitas 
 No Western Blot, as tiras são compostas de 
membranas com proteínas nativas do HIV e 
separadas por eletroforese 
 Já no Imunoblot, proteínas/peptídeos 
recombinantes/sintéticos são impregnadas nas 
membranas 
Teste ELISA (Enzime Linked 
Immunosorbent Assay) 
Teste WB (Western-Blot) 
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 Para ser considerado reagente, o teste deve ter 
bandas de ao menos duas proteínas: p24, 
gp41, gp120/gp160 
 Ele não é um teste barato, e requer muito 
conhecimento técnico 
 Quando um teste de triagem e um confirmatório 
são reagentes, o paciente necessitará de 
testes de acompanhamento 
a) Quantificação de Células TCD4+ circulantes 
(citometria de fluxo) 
 Inicialmente um paciente na fase aguda 
apresenta uma grande quantidade de 
TCD4+ 
 Também apresenta uma síndrome aguda, 
com uma grande quantidade de partículas 
virais 
 Em seguida, o paciente passa por uma fase 
latente, com baixa de TCD4+ e do HIV 
 Porém, após um tempo a taxa de TCD4+ 
cai e o número do RNAviral aumenta 
(AIDS) 
 O acompanhamento do TCD4+ é feito pela 
citometria de fluxo, onde leucócitos são 
incubados com Ac monoclonais anti-CD4, 
anti-CD8 e anti-CD3 e marcados com 
fluorocromo 
 Depois a suspensãoé analisada e as 
diferentes populações de linfócitos são 
identificadas, de acordo com a 
fluorescência emitida após a excitação com 
luz laser 
 
b) Avaliação da Carga Viral 
 Permite diagnóstico molecular do genoma e 
análise do DNA/RNA 
 Com a análise do DNA/RNA, é possível 
conhecer as alterações moleculares 
 Esse exame: 
 Auxilia no diagnóstico e classificação das 
doenças 
 Orienta sobre o tratamento mais adequado 
 Contribui para estabelecer prognóstico de 
doenças 
 Auxilia na compreensão da etiologia da 
doença 
 
 Os exames biomoleculares podem ser 
divididos em: 
1. Hibridação 
 Primeiro, é feita a desnaturação da fita de 
DNA com calor ou agentes químicos 
 Em seguida o DNAsonda (sintético e 
marcado) e a sequencia alvo são 
colocados em contato 
 Depois, há a remoção do agente 
desnaturador e ocorre a hibridação 
 Por fim ocorre a revelação por meio de 3 
processos: 
 Sonda Radioativa: auto radiografia 
 Sonda Biotinilada: substrato apropriado 
 Sonda Fluorescente: FISH 
2. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) 
 Permite a amplificação exponencial de 
sequências genômicas de interesse, sendo 
considerado um método extremamente 
sensível e específico 
 A repetição dos ciclos (aumento de 
temperatura, diminuição de temperatura e 
aumento da temperatura) permite a síntese 
de DNA em escala exponencial 
 Ao final de 36 ciclos de amplificação (2h de 
reação) uma única molécula de DNA dá 
origem a cerca de 10 bilhões de cópias, 
permitindo a sua manipulação e 
visualização 
 Existem 3 componentes/reagentes 
cruciais: 
 DNAmolde: que será copiado 
 Iniciadores(primers): dois fragmentos 
pequenos de DNA de fita simples, 
complementares das duas extremidades do 
fragmento amplificado 
 Enzima (DNApolimerase) que copia uma fita 
simples do DNA, produzindo sua fita 
complementar 
 
 Depois da replicação, as amostras sã 
colocadas em uma máquina de 
eletroforese 
 Nesse gel, a sequencias de DNA 
percorrem o caminho, e é possível 
observar as bandas 
Exames de Acompanhamento dos 
pacientes HIV+