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Tomates biofortificados fornecem uma nova rota para a suficiência de vitamina D
INTRODUÇÃO
Vitamina D é um hormônio esteroide muito importante para o metabolismo humano, sendo convertida em produtos com bioatividade que funcionam no processo de sinalização em diversos órgãos, incluindo o cérebro. 
O baixo nível de Vit D é um problema de saúde global. Aproximadamente 1 bilhão de pessoas ao redor do mundo sofrem de insuficiência da Vitd e os números estão aumentando devido a disponibilidade alimentar inadequada.
 A deficiência da VitD afeta funções imunológicas, aumento do risco de deficiência de micronutrientes, câncer, doença de Parkinson, depressão, declínio neurocognitico e risco de desenvolver COVID 19 grave.
Os alimentos que possuem VitD: Fígado, óleo de fígado de bacalhau, atum, sardinha, queijo (ricota, suíço), cogumelhos, ovos, peixe espada, truta – a maioria são de origem animal e nem todos são acessíveis às comunidades mais carentes.
SÍNTESE DA VITD
A vitamina D pode ser sintetizada por seres humanos a partir do 7-desidrocolesterol (7-DHC), também conhecido como provitamina D3 , após a exposição da pele à luz ultravioleta B (UVB) , mas a principal fonte é a dieta.
O 7-DHC é sintetizado por algumas plantas, como o tomate, na rota para a síntese do colesterol e glicoalcalóides esteroidais (SGA), predominantemente nas folhas, que, quando expostas aos raios UVB, produzem a vitamina D3. Entretanto, as plantas são fontes pobres em vit D3.
O tomate possui uma via duplicada, onde isoformas específicas de algumas enzimas, geralmente responsáveis ​​pela biossíntese de fitoesteróis e brassinosteróides, produzem colesterol para a formação de SGAs. Essa separação parcial da biossíntese de fitoesteróis e colesterol permite flexibilidade metabólica para a síntese de importantes hormônios (brassinosteróides) e substâncias químicas do estresse mais especializadas, como os SGAs, com propriedades fungicidas, antimicrobianas e inseticidas. A existência de uma via 'duplicada' para a biossíntese de SGA no tomate torna a manipulação do acúmulo de 7-DHC relativamente direta. Uma isoforma específica da 7-desidrocolesterol redutase (Sl7-DR2) converte 7-DHC em colesterol para a síntese de α-tomatina em folhas e frutos.	Comment by Thalita Cruz: A -tomatina é um glicoalcalóide encontrado no tomate (Lycopersicon esculentum) que possui funções biológicas importantes como a redução dos níveis de colesterol LDL, inibição do crescimento de células cancerosas, estimulação do sistema imune e efeito antimetastátic
Consequentemente, eliminar a atividade de Sl7-DR2 resulta no acúmulo de 7-DHC com impacto mínimo na biossíntese de fitoesteróis e brassinosteróides.
OBJETIVO
biofortificar o tomate em pró-vitamina D 3 , através do bloqueio da atividade de Sl7-DR2 usando a edição do genoma CRISPR-Cas9.
Acúmulo de provitamina D 3 no tomate pela edição do genoma, modificando uma seção duplicada da biossíntese de fitoesteróis em plantas solanáceas, para fornecer um alimento biofortificado com a possibilidade adicional de produção de suplementos a partir de resíduos.
Desenvolvemos uma nova fonte dietética de vitamina D em plantas para atender à crescente demanda por formas de tratar a insuficiência de vitamina D, o que é de particular relevância para aqueles que adotam dietas ricas em vegetais, vegetarianas ou veganas.
METODOLOGIA
Tomate ( Solanum lycopersicum e mutantes knockout de Sl7-DR2 – cultivados em estufa
Construção do plasmídeo -- Tranformação do tomate – Triagem das linhas knockout de Sl7-DR2 – Análise do RT-qPCR ( avaliou a expressão genética) – Análise da imagem MALDI – Análise de esteróis – Análise de SGA – Tratamento UV (fatias das frutas cortadas para serem expostas aos raios) – Análise estatística (triplicata)
RESULTADOS
Geraram 5 linhas independentes – Por isso tem Mut1 ( todas com a mutação) - Cinco alelos homozigotos-knockout de Sl7-DR2 foram selecionados, após segregação, na geração T2
A perda da atividade de Sl7-DR2 não teve efeito no crescimento, desenvolvimento ou rendimento das linhagens de tomate
frutos de tomate tipo selvagem (WT) e Sl7-DR2 -knockout em diferentes estágios de amadurecimento (IMG, verde imaturo; MG, verde maduro; Breaker, fruta amadurecendo; B + 7, 7 dias após o breaker -fruta madura)
Em plantas selvagens, o 7-DHC foi detectado apenas em frutos verdes imaturos e não foi detectado em frutos maduros e amadurecidos. Em contraste, a perda da atividade de Sl7-DR2 resultou em aumentos substanciais nos níveis de 7-DHC em folhas e frutas verdes (Fig. 1c,d ). Os níveis de 7-DHC foram menores em frutos maduros dos mutantes Sl7-DR2 (Fig. 1c ), mas permaneceram altos o suficiente para que, se convertido em vitamina D 3 por tratamento com UVB, a quantidade em um tomate fosse equivalente à de dois ovos de tamanho médio ou 28 g de atum, que são fontes dietéticas recomendadas de vitamina D 
Imagens MALDI: Ionização por Dessorção a Laser Assistida por Matriz (367,33) e do íon derivado (365,32). Selvagem e mutante // Casco ao redor e polpa do tomate do centro. São frutas verdes
- Aumento de 7-DHC foram distribuídos tanto na polpa quanto na casca dos tomates
- Curiosamente, os níveis de colesterol eram geralmente mais altos no mutante do que n controle. Isso sugere que o bloqueio no fluxo ao longo da via biossintética do SGA pode ser compensado pelo aumento do fluxo de intermediários, talvez catalisado pelas enzimas da via do fitosterol (ou pelo menos Sl7-DR1), que complementam a produção de colesterol e limitam as reduções no acúmulo de SGA.
- α-tomatina era menor nos mutantes Sl7-DR2 do que nos controles 
Graficos demonstrativos da imagem anterior.
B -  folhas mostraram níveis substancialmente mais baixos de tomatina, mas não foi eliminada
C - Uma forte redução nos níveis do SGA, esculeosídeo A, também foi observada em frutos maduros dos mutantes em comparação com o controle 
D – Nível de colesterol nas folhas também foram altos
Para confirmar a estratégio de biofortificação, testou se os níveis elevados de 7-DHC em plantas mutantes poderiam ser convertidos em vitD3 irradiando folhas e frutas fatiadas com luz UVB por 1H.
O tratamento das folhas foi muito eficaz, resultando em rendimentos de vitamina D 3 de cerca de 200 μg g −1 de peso seco
Os rendimentos de frutos foram menores, refletindo o declínio do teor de 7-DHC em frutos verdes e frutos vermelhos maduros em comparação com as folhas .  A vitamina D 3 em frutas maduras pode ser aumentada ainda mais pela exposição prolongada a UVB, por exemplo, durante a secagem ao sol.
CONCLUSÃO
Para os idosos com níveis decrescentes de 7-DHC, o consumo de frutas biofortificadas com 7-DHC pode resolver diretamente suas deficiências 19 .
As folhas dos mutantes Sl7-DR2 são fontes ricas de provitamina D 3 e, conseqüentemente, podem fornecer um novo e importante alimento para animais usando o material vegetativo residual do cultivo de tomate para a fabricação de suplementos de vitamina D 3 de plantas que seriam adequados para veganos.
 Edição de Sl7-DR2poderia gerar alterações semelhantes em qualquer variedade de tomate de elite, o que significa que o tomate poderia ser desenvolvido como uma fonte vegetal sustentável de vitamina D 3 .